Summary
هنا، ونحن نصف تطور نموذج المورين ذات الصلة سريريا من سرطان الكبد تلخيص السمات المناعية النموذجية للسرطان الكبدي (HCC).
Abstract
وقد أعاق عدم وجود نموذج حيواني ذي صلة سريرياً يتناول الخصائص المناعية النموذجية لسرطان الكبد الخلوي (HCC) إلى حد كبير توضيح الآليات الأساسية وتطوير استراتيجيات مبتكرة للعلاج المناعي. لتطوير نموذج حيواني مثالي ينقص HCC البشرية، تتلقى الفئران C57BL/6J منذوية المناعية المناعية أولاً حقن رابع كلوريد الكربون (CCl4)للحث على تليف الكبد، ثم تلقي خلايا كبدية أوسنتوجينية طبيعية من الذكور الشباب SV40 T مستضد (TAg)-الفئران المعدلة وراثيا (MTD2) عن طريق التضونداخل الطحال (ISPL). الاندروجين ولدت في الفئران الذكور المتلقي في سن البلوغ يبدأ التعبير TAg تحت سيطرة المروج الخاصة بالكبد. ونتيجة لذلك، تصبح خلايا الكبد المنقولة خلايا سرطانية وتشكل كتل الورم في إعداد تليف الكبد / تليف الكبد. هذا النموذج الجديد يحاكي بدء HCC الإنسان والتقدم في سياق تليف الكبد / تليف الكبد ويعكس السمات الأكثر نموذجية من HCC الإنسان بما في ذلك خلل المناعة.
Introduction
سرطان الكبد الخلوي (HCC) هو أسرع أنواع السرطان المتزايدة في الولايات المتحدة (الولايات المتحدة)1،2،3. كل عام، يتم تشخيص ما يقرب من 850،000 حالة جديدة4و5 و 700،000 المرضى يموتون من هذا المرض القاتل6،7،8،9،10 ، مما يجعلها ثاني أعلى سبب للوفاة المرتبطة بالسرطان في جميع أنحاء العالم. إدارة HCC تشمل الاستئصال الجراحي، زرع، الاستئصال، العلاج الكيميائي، أو العلاجات الجهازية، مثل سورافينيب11. التشخيص المبكر والإدارة مع استئصال جراحي أو زرع لها أعلى فائدة البقاء على قيد الحياة عموما4. للأسف، فإن غالبية المرضى الحاضرين في مرحلة لاحقة وتتطلب إدارة مع الاستئصال، chemoembolization أو سورافينيب12. سورافينيب، مثبط اتيوزين كيناز مستقبلات (RTKI)، وافقت عليه إدارة الغذاء والدواء في عام 2008 كعلاج الدواء الجهازية الوحيدة المتاحة لعلاج HCC غير قابلة للاستئصال. على الرغم من أن الدواء يوفر فقط زيادة متواضعة في البقاء على قيد الحياة عموما, من 7.9 إلى 10.7 أشهر13,أنها قدمت استراتيجية علاجية جديدة التي يمكن استخدامها لإدارة HCC.
التلاعب في الجهاز المناعي للقضاء على السرطانات الراسخة هو مجال ينمو بسرعة في أبحاث السرطان14. دراسات نقاط التفتيش المناعية قد متقدمة إلى حد كبير تطوير المخدرات المناعية العلاجية في علاج السرطان15,16. وافقت إدارة الأغذية والعقاقير على استخدام الأجسام المضادة (عبس) ضد مستضد الخلايا الليمفاوية T السامة للخلايا (CTLA-4)، وبروتين موت الخلايا المبرمج 1 (PD-1)، والرباط PD-L1 لعلاج الورم الميلانيني، وسرطان الرئة، وسرطان الرأس والرقبة، وسرطان المثانة17، 18 سنة , 19 سنة , 20. التجاربالسريرية للعلاج الأحادي أو الجمع باستخدام واحد أو عدة الأجسام المضادة ضد PD-1، PD-L1، أو CTLA-4 لعلاج HCC المتقدمة جارية21،22،23،وبعض وقد أظهرت التجارب نتائج إيجابية. في عام 2017، منحت إدارة الأغذية والعقاقير الموافقة المعجلة للأجسام المضادة للPD-1 لعلاج مرضى HCC، الذين هم مقاومة لسورافينيب، ولكن معدل الاستجابة الإجمالية لهذا العلاج هو فقط 14.3٪. لم تترجم استراتيجيات أخرى إلى ممارسة سريرية في هذا الوقت24,25. التغلب على التحمل المناعي العميق الناجم عن الورم لتحسين العلاج بنقاط التفتيشالمناعية 26; التنبؤ بفعالية العلاج بنقاط التفتيش المناعية؛ منع الأحداث السلبية المتعلقة بالمناعة؛ تحسين مسار الإدارة، والجرعة، والتردد؛ وإيجاد تركيبات فعالة من العلاجات27،28،29 كلها لا تزال مهام صعبة للغاية.
هناك العديد من النهج التقليدية المستخدمة للحث على HCC في نماذج الماوس حاليا وتستخدم اعتمادا على السؤال البحثي الخاص للمحقق30. نماذج الماوس HCC المستحثة كيميائيا مع المركبات السامة جينيا تحاكي الأورام الخبيثة الناجمة عن الإصابة. نماذج Xenograft من خلال زرع خارج الرحم أو تقويم العظام من خطوط الخلايا HCC هي مناسبة لفحص المخدرات. وقد تم تصميم عدد من الفئران المعدلة وراثيا للتحقيق في الفيزيولوجيا المرضية للالمقرس ة. تسمح الفئران المحورة وراثياً التي تعبر عن الجينات الفيروسية و/أو الأنكوجينيات و/أو عوامل النمو بتحديد المسارات التي ينطوي عليها تكوين الكبد. بسبب القيود المتأصلة، هذه النماذج لا تلخص الخصائص المناعية النموذجية التي ينظر إليها في HCC الإنسان، والتي أعاقت بشكل كبير توضيح الآليات الأساسية وتطوير استراتيجيات مبتكرة للعلاج المناعي14 ،15. لقد أنشأنا مؤخرًا نموذج ًا للمورين ذي صلة سريرياً. هذا النموذج الجديد لا يحاكي فقط بدء HCC الإنسان والتقدم ولكن يعكس أيضا معظم السمات النموذجية للأمراض البشرية بما في ذلك خلل المناعة. لقد ميّزنا خصائصه البيولوجية والمناعية. الاستفادة من هذا النموذج الجديد، لقد استكشفنا مختلف الاستراتيجيات المناعية لعلاج HCC31،32،33،34،35،36، 37.هذه المنصة الفريدة تسمح لنا لدراسة آليات تحمل المناعة الناجمة عن الورم ووضع استراتيجيات علاجية إثبات المفهوم لHCC نحو الترجمة السريرية في نهاية المطاف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: تمت الموافقة على جميع الإجراءات بما في ذلك المواضيع الحيوانية من قبل IACUC في جامعة ميسوري. وتلقت جميع الفئران رعاية إنسانية وفقا للمعايير المبينة في "دليل رعاية واستخدام الحيوانات المختبرية". يجب إجراء الإجراء التالي لعزل الخلايا والتطعيم في غطاء محرك السيارة. يجب على جميع فناني الأداء ارتداء معدات الحماية الشخصية القياسية للتعامل مع الفئران والأنسجة.
1. تحريض تليف الكبد وتليف الكبد مع حقن IP من رابع كلوريد الكربون (CCl4)
ملاحظة: انظر الشكل 1. (CCl4 هو كاشف شديد الخطورة، وينبغي التعامل معها بعناية ومع ارتداء قفازات مقاومة للمواد الكيميائية)
- الحصول على الذكور C57BL/6J الفئران التي هي ستة إلى ثمانية أسابيع من العمر (انظر جدول المواد).
- إعداد 10٪ CCl4 (V / v) الحل في زيت الذرة في أنبوب الطرد المركزي. تحديد الحجم الإجمالي استناداً إلى عدد الفئران التي سيتم حقنها (انظر الخطوة 1.6).
- استخدام تقنية معالجة الفئران المناسبة لتحديد ماوس واحد للحقن.
- ضبط الماوس يدويًا مع جانب الظهر (البطن).
- تنظيف موقع الحقن على جدار البطن من الماوس عن طريق تنقية مع الكحول 70٪.
- حقن الذكور C57BL/6J الفئران مع 160 درجة مئوية من 10٪ CCl4 الحل عن طريق حقن داخل الصفاق (IP) باستخدام إبرة 25 مقياس المتاح.
- تأكد من أن الإبرة تخترق فقط من خلال جدار البطن (حوالي 4-5 ملم) مع شطبة الجانب صعودا وزاوية قليلا في 15-20 درجة.
- حقن الفئران مرتين في الأسبوع لما مجموعه أربعة أسابيع كل ماوس سوف تتلقى ما مجموعه ثماني ة حقن.
ملاحظة: بعد أسبوعين من الحقن ة الأخيرة، تكون الفئران المعالجة جاهزة لتلقيح ISPL لخلايا الكبد الأنسيوجينية من فئران MTD2.
2. عزل خلايا الكبد المعدلة وراثيا من الفئران خط MTD2
ملاحظة: راجع الجدول 1 للحصول على وصفات الحل.
| 10X إيرل متوازن الملح الحل دون كاليفورنيا أو ملغ (EBSS دون كاليفورنيا أو ملغ) | 4 غرام كيلو كل 68 غ من حمض الكل 1.4 غرام NaH2PO4· H2o 10 غ سكر العنب إضافة الماء إلى 1 لتر، ودرجة الحموضة إلى 4.32 تمر عبر عامل التصفية |
| الحل 1 | 20 مل 10x EBSS دون كاليفورنيا أو ملغ 44 غرام ناهكو3 1.33 مل 1.5 مليون هيبس 10 مل من 10 مل EGTA إضافة الماء إلى 200 مل |
| الحل 2 | 100 مل 10x EBSS 2.2 غرام ناهكو3 6.67 مل 1.5 مليون هيبس إضافة الماء إلى 1 لتر |
| 0.75٪ محلول كولاجيناز | 15 ملغ كولاجيناز نوع 1 20 مل من الحل 2 |
| متوسطة كاملة | 2 دورة في الدقيقة 50 مل FBS 5 مل 100x بنسيليان-ستربيتوبمايسين |
الجدول 1: وصفات الحل.
- الحصول على خط MTD2 الفئران38 لتكون بمثابة مصدر لخلايا الكبد oncogenic.
- تخدير الفئران MTD2 5 أسابيع من العمر باستخدام 2.5٪ isoflurane.
ملاحظة: سيتم التحقق من التخدير المناسب بواسطة طريقة قرصة اصبع القدم. باختصار، باستخدام إصبعين، وإعطاء إصبع القدم الماوس / القدم ضغطة جيدة. إذا لم يكن هناك رد فعل الانسحاب، يتم الحكم على الحيوان عميق بما فيه الكفاية لبدء الجراحة. - عندما مخدر بشكل كاف، وضع الفئران في وضع supine وإصلاح الأطراف مع الشريط لتوفير التعرض الكافي لسطح البطن.
- إجراء شق في فترة البطن خط الوسط باستخدام مقص على طول خط ألبا كبيرة بما يكفي لتوفير التعرض الكافي للكبد.
- إزاحة الأمعاء إلى اليسار لتوفير التعرض أفضل للكبد والثالوث المدخل.
- تشريح فوق الكبد لفضح الوريد الأجوف السفلي (IVC).
- يُلْزُ الـ IVC فوق الكبد باستخدام مشبك الشريان.
- العودة إلى الحدود السفلية للكبد، واستخدام إبرة فراشة (انظر المواد) للحصول على الوصول الرابع إلى الوريد المدخل. إصلاح القسطرة باليد.
- على التوالي perfuse كبد الماوس باستخدام حقنة حقنة في 8.9 مل / دقيقة مع مع 15 مل من الحل 1، 15 مل من 0.75٪ محلول كولاجيناز 2، و 15 مل من الحل 2 عن طريق القسطرة.
- حصاد الكبد الممزوج عن طريق قطع وأخذ كتلة الورم من الفئران MTD2 في أنبوب مخروطي 50 مل مع 10-15 مل من PBS.
- إزالة PBS وغسل وقت إضافي مع PBS. لا الطرد المركزي في هذه الخطوة.
- قطع الكبد إلى قطع أصغر باستخدام مقص ثم يغسل مرة أخرى مع PBS 2X لإزالة الدم المتبقي.
- إضافة 5 مل من كامل RPMI المتوسطة إلى الأنبوب المخروطي ودقيقة باستمرار الكبد مع مقص إلى قطع صغيرة (<3 مم) الأنسجة يجب أن تذهب بسلاسة من خلال ماصة 5 مل.
- إضافة RPMI كاملة إلى حجم النهائي من 30 مل وتعليق الكبد باستخدام ماصة 5 مل.
- تصفية الحل المختلط مع مصفاة 70 درجة مئوية في أنبوب مخروطي 50 مل.
- اغسل المصفاة عدة مرات باستخدام RPMI كاملة واضبط الحجم النهائي إلى 50 مل بإضافة وسيط RPMI إضافي.
- تدور بسرعة التعليق بواسطة الطرد المركزي إلى حد أقصى من 500 دورة في الدقيقة. مرة واحدة يتم تسريع السرعة إلى 50 × ز،يجب إيقاف الطرد المركزي.
- Decant supernatant وتعليق الكريات في 20 مل من PBS.
- عد الخلايا باستخدام استبعاد الأزرق تريبان ومقياس الهيموميتومتر، ثم ضبط تركيز الخلية إلى 2.5 × 106/مليلتر لتلقيح الخلية التالية.
ملاحظة: العائد المتوقع من 5 غرامات من أنسجة الورم هو 80 مليون خلايا الكبد مع القدرة على البقاء > 95٪.
3. تلقيح خلايا الكبد من الفئران MTD2 إلى الكبد من نوع البرية C57BL/6J الفئران عن طريق حقن ISPL
- وينبغي استخدام تقنية العقيم في جميع الإجراءات
- التخدير CCl4-المعالجةالذكور C57BL/6J الفئران مع 2.5٪ isoflurane، وينبغي أن تعامل الفئران مع التشحيم العين لمنع العينين من الجفاف.
- إعداد المحاقن مع 200 ميكرولتر من خلايا الكبد للحقن.
- عندما مخدر بشكل كاف، وضع الفئران مع الجانب الأيسر حتى.
- قم بتقشير الجناح الأيسر بأكمله من الفئران، ثم افرك المنطقة، بالتناوب بين 70٪ من الكحول والبيتادين ثلاث مرات.
- إعطاء 5 ملغ / كغ من carprofen تحت الجلد قبل شق الجراحية.
- قم بعمل شق 1 سم على الجناح الأيسر بالتوازي مع الضلعالثالث عشر من بداية الظهرية القصوى أسفل عضلة العمود الفقري مباشرةً.
- التعرف على الطحال، ثم خارجها باستخدام ملقط حادة مدببة.
- قص الطحال مع اثنين من مقاطع التيتانيوم متوسطة الحجم. ضع كلا المقطعين بين الشريان الطحال والوريد، واترك مجالاً بين القصاصات لتقطعه لاحقاً بعد التلقيح.
ملاحظة: الهدف هو عزل القطب السفلي من الطحال للحد من خطر البذر. - حقن 200 ميكرولتر (0.5 مليون) من خلايا الكبد المعدة في القطب السفلي من الطحال باستخدام إبرة 27 G.
- قص الفرع السفلي من pedicle (أوعية القطب الطحال السفلي) مع مقطع واحد متوسطة الحجم.
- قطع الطحال بين اثنين من مقاطع وضعت في البداية.
- إزالة القطب السفلي من الطحال التي تم حقنها مباشرة مع الخلايا السرطانية.
- استخدام 3-0 بوليغلكتين 910 توقف خياطة لإغلاق طبقة العضلات الداخلية.
- استخدام مقاطع الجرح الصلب المعقم لإغلاق طبقة الجلد الخارجي.
ملاحظة: يفضل مقاطع الصلب على الغرز لتجنب الحيوانات مضغ الغرز، وترك جرح خطيئة. - إدارة 5 ملغ / كغ من carprofen تحت الجلد بعد خياطة.
- ضع جميع الحيوانات التي تتعافى على وسادة تدفئة يتم التحكم في درجة حرارتها وراقبها عن كثب حتى تتعافى تماما ً من التخدير.
- إعطاء الفئران حرية الوصول إلى المياه بعد الجراحة. إذا أصبح الفأر جافًا أثناء الجراحة، فدير السوائل تحت الجلد (<1 مل).
- إزالة مقاطع الجلد في 7-10 أيام بعد العملية الجراحية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وقد بذرت خلايا الكبد الأنسيوجينية المعزولة عن الفئران المعدلة وراثيا ً (الشكل 2) في كبد الفئران البرية عن طريق الحقن داخل الطحال (الشكل 3). الخلايا الكبدية المزروعة بنجاح وبشكل موثوق نمت أورام تقويم العظام(الشكل 4)مع مستضد الورم محددة SV40 TAg (الشكل 5) في وضع التهاب الكبد والتليف (الشكل 1).
الشكل 1: مخطط لإعداد نموذج الماوس من HCC. التصميم التجريبي لإنشاء نموذج murine مبتكرة من HCC. يتم التعامل مع الفئران C57BL/6J لأول مرة مع حقن IP من CCl4 مرتين أسبوعيا لمدة أربعة أسابيع للحث على تليف الكبد. بعد أسبوعين من حقن IP الأخير، تتلقى الفئران المعالجة بـCCl 4خلايا كبدية معزولة عن فئران MTD2 الذكور الشباب عن طريق تلقيح ISPL. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: عزل وتنقية خلايا الكبد من الفئران خط MTD2. (أ)تم إعداد خلايا الكبد المعزولة من الفئران MTD2 وفقا للبروتوكول وملطخة بالأزرق trypan للكشف عن جدوى ونقاء عزل الخلايا. تُظهر اللوحة اليسرى كل من خلايا الكبد (السهم الأسود) والخلايا الليمفاوية المتسللة للورم (السهام الحمراء) التي يتم عزلها أثناء استخراج الخلايا. تُظهر اللوحة اليمنى عدد الخلايا المتبقية بعد الطرد المركزي المنخفض السرعة، بما في ذلك خلايا الكبد (السهم الأسود) وأقل بكثير من الخلايا الليمفاوية التي تتسرب من الورم. التكبير = 10X الهدف، شريط مقياس = 100 ميكرومتر.(B)ملطخة خلايا الكبد معزولة من الفئران MTD2 مع محلول الأزرق تريبان قبل تلقيح الفئران C57BL/6J من النوع البري. يتم تحديد عزل الخلية لتكون ناجحة إذا كانت قابلة للحياة >95%. سوف تكون ملطخة الخلايا الميتة مع الأزرق trypan (السهام الحمراء)، في حين أن الخلايا القابلة للحياة لن تكون ملطخة (السهم الأسود). التكبير = 10x الهدف، شريط مقياس = 100 ميكرومتر. الرسم البياني على اليمين يظهر نتائج عزل الخلايا مع > 95٪ من خلايا الكبد كونها قابلة للحياة، والبيانات الإحصائية تأتي من 5 مجال ملاحظ مختلفة تحت المجهر. أشرطة الخطأ تمثل +SD. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تلقيح خلايا الكبد داخل الجنب في كبد الفئران البرية من النوع C57BL/6J. التصميم التجريبي لتلقيح ISPL من خلايا الكبد للحث على HCC في الفئران C57BL/6J. (1) يتم تحديد الطحال وخارجية. (2) يتم قص الطحال مع اثنين من مقاطع التيتانيوم متوسطة الحجم. (3) يتم حقن خلايا الكبد المعدة في القطب السفلي من الطحال. (4) يتم قص الفرع السفلي من pedicle (أوعية القطب الطحال السفلي) مع مقطع واحد متوسط الحجم. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: التطور التدريجي للورم في الفئران C57BL/6J بعد التلقيح مع الخلايا الكبدية MTD2. (أ)تم تأسيس نموذج الورم الأوثورام يُعقد وفقاً للبروتوكول. وقد التقطت الصور التشريحية قبل التلقيح وفي الدورات الزمنية دون المتسلسلة. (أ) يظهر الكبد السليم قبل التلقيح مع خلايا الكبد MTD2. (ب) كبد الفأر بعد 3 أشهر من التلقيح مع وجود دليل على تطور الورم الإجمالي. (ج) بعد 3.5 أشهر من التلقيح مع زيادة عبء الورم. (د) بعد 4.5 أشهر من التلقيح. (هـ) بعد 6 أشهر من التلقيح مع وجود دليل على وجود ورم في جميع أنحاء الكبد. (ب)تم حصاد العقيدات الورمية ووزنها في الوقت المشار إليه بعد التلقيح مع خلايا الكبد MTD2. تمثل أشرطة الخطأ +SD. ***P < 0.001، تم إجراء التحليل الإحصائي بواسطة اختبارات t. (C)الصور التمثيلية للنوع البري وأقسام الكبد الملقحة MTD2. يصور تلطيخ الهيماتوكسيلين وإيوسين (H&E) تشكيل الغدد الزائفة (السهام السوداء). هناك الازدحام النووي، والخلايا السرطانية هي الحمضات مع نسب عالية من النواة إلى السيتوبلازم (صورة مكبرة). التكبير = 20x الهدف، شريط مقياس = 50 ميكرومتر. يتم تضخيم الشرائح على أعلى اليمين يدويًا. (D)سيريوس الأحمر تلطيخ تشير إلى ترسب الكولاجين غير طبيعي، بما يتفق مع تليف الكبد. التكبير: 40x الهدف، شريط مقياس = 20 درجة.
الشكل 5: الكشف المحدد عن جين مستضد SV40 T في الورم. (أ)تم جمع أنسجة الورم وعينات إضافية من الأنسجة في جميع أنحاء الفئران من الفئران التي أنشأتها الأورام. تم عزل الحمض النووي الجينومي من الأنسجة والتمهيديات لكل من SV40 T Ag و P53 (التحكم) تم تصنيعها لPCR التقليدية. تم الكشف عن جين مستضد T SV40 في أنسجة الورم ولكنه غير موجود في الأنسجة الطبيعية أو الأنسجة الأخرى في الفئران. (ب)تم جمع أنسجة الورم من الفئران الحاملة للورم وملطخة بالأجسام المضادة المضادة للمستضد T المضادة للSV40. اللوحة اليسرى هي عنصر تحكم سلبي من أنسجة الكبد السليمة التي تم جمعها من الفئران الساذجة. تظهر اللوحة اليمنى مستضد SV40 T كبير تلطيخ أنسجة الورم التي تم جمعها من الفئران الحاملة للورم (اللون البني). التكبير = 40x الهدف، شريط مقياس = 20 درجة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
مع هذا البروتوكول، أنشأنا نموذج murine موثوق بها واستنساخها من HCC الذي يحاكي بدء HCC الإنسان والتقدم. سريريا, العديد من عوامل الخطر على التوالي الحث على إصابة الكبد, تليف الكبد, تليف الكبد والمرحلة النهائية من HCC. في بروتوكولنا، يتم استخدام حقن IP من CCl4 لإنتاج التليف الكبدي لأول مرة في الفئران من النوع البري، والذي يسمح لخلايا الكبد الأنسيوجينية اللاحقة لتشكيل الأورام في وضع تليف الكبد. وجدنا أن تشكيل الورم حدث بنجاح أكبر في الفئران التي تلقت تلقيح خلايا الكبد بعد أسبوعين من العلاج CCl4، مقارنة مع الفئران تلقي الحقن في نقاط زمنية أخرى. وبالإضافة إلى ذلك، وجدنا تليف الكبد يمكن الكشف عن ما يصل إلى أربعة أشهر بعد حقن CCl4. هذا النهج يؤدي إلى أكثر من 90٪ من الفئران تطوير أورام HCC مقارنة مع الفئران دون التعرض لCCl4. في نموذجنا، نقل خلايا الكبد من الفئران MTD2 خط إلى الفئران C57BL/6J، وحركة المرور إلى الكبد حيث تصبح مدمجة كما خلايا الكبد التي تعبر عن TAg كمستضد الأنسجة. عزل خلايا الكبد من MTD2 هو خطوة حاسمة خلال هذا البروتوكول. يتم دمج كبد الماوس MTD2 تماما مع الحل 1 و 2 لإزالة خلايا الدم الحمراء المتداولة داخل الكبد تماما. يتم استخدام محلول الكولاجين لperfuse الكبد في التركيز المشار إليه والسرعة لتوليد هضم الكبد السليم للإفراج عن خلايا الكبد. استخدام تركيزات أقل من الكولاجين غير كافية للهضم، مما أدى إلى كتل من خلايا الكبد. وعلى النقيض من ذلك، فإن التركيزات العالية قاسية جداً على الأنسجة، مما يؤدي إلى انخفاض كبير في خلايا الكبد القابلة للحياة. ونجد أيضا أن الطرد المركزي القصير كما هو موضح في بروتوكولنا مطلوب لتحسين نقاء خلايا الكبد. يمكن أن يؤدي الدوران السفلي الذي استخدمناه في الطرد المركزي إلى تسريع خلايا الكبد وترك الكريات البيض في الـ supernatant استنادًا إلى فرق الكثافة في هذين النوعين من الخلايا.
الخطوة الحرجة التالية هي الطريق لتلقيح خلايا الكبد في الفئران البرية من النوع. في دراساتنا التجريبية، استكشفنا طرقمختلفة لإجراء تلقيح خلايا الكبد. وينظر إلى نمو الورم الأربيء الناجح في الكبد أفضل في الفئران التي تتلقى تلقيح داخل الجنب من خلايا الكبد الأورام بجرعة من نصف مليون خلية لكل فأر، مقارنة مع الفئران تلقي الخلايا تدار عن طريق الوريد الذيل وداخل الشبكية حقن بجرعات مختلفة. وتشير هذه النتائج إلى أن نمو HCC تقويم العظام هو الطريق والجرعة تعتمد. يحدث التحول الخبيث تدريجيا ويقتصر على السكان الفرعيين من خلايا الكبد المزروعة بدلا من parenchyma الكبد كله. يؤدي استمرار انتشار الخلايا إلى تطور العقيدات السرطانية في جميع أنحاء الكبد.
لHCC أو غيرها من السرطانات للتقدم يجب التهرب من الجهاز المناعي; في الواقع، يعتبر تجنب تدمير المناعة الآن سمة مميزة للسرطان39. ومع ذلك، فإن عدم وجود مستضد خاص بالورم هو حاجز حاسم لتوضيح الآليات الأساسية. في نموذجنا، يتم التعبير عن TAg في الأورام، وليس الأعضاء الأخرى، والتي تعمل كمستضد خاص بالورم. أيضا، TAg لديها العديد من الepitopes محددة جيدا التي يمكن التعرف عليها من قبل خلايا CD8 T في الفئران C57BL/6J. وفيما يتعلق بالظهارة TAg-I، قمنا بتوليد خط 416 الفئران التي تعبر وراثيا مستقبلات الخلايا T لهذا epitope34. استهداف TAg لفحص الاستجابة المناعية الخاصة بمستضد الورم يسمح لنا بالتحقيق في مراقبة المناعة الورم أثناء بدء الورم والتقدم، وهو أمر غير ممكن باستخدام النماذج التي يسببها DEN أو التلاعب الوراثي. توضيح الآليات الأساسية تمكننا من تحديد الخلايا الحرجة والجزيئات التي تتوسط في تحمل المناعة الناجم عن الورم. استهداف هذه العوامل الرئيسية يمكن أن تعزز بشكل كبير تطويراستراتيجيات العلاج المناعي مبتكرة ضد HCC. باستخدام هذا النموذج الفريد HCC والأدوات المنشأة، قمنا بالتحقيق في الآليات الكامنة وراء التسامح الناجم عن الورم25،35 واستكشف مختلف العلاجات المناعية المضادة للورم المستندة إلى المناعة31،32 , 36 , 37.
وباختصار، فإن نموذج المورين القائم على الـ HCC يعكس بعض السمات النموذجية للأمراض البشرية. في مقالنا المنشور سابقا، تمكنا من إثبات هذا كنموذج الورم ذات الصلة سريريا التي لديها سمات نموذجية من HCC الإنسان. أظهرنا أن الفئران المعالجة مع CCl4 و MTD2 خلايا الكبد وضعت الأورام التي عبرت عن المستضدات المرتبطة HCC، AFP وGPC336. علم الأمراض تحديد أن الآفات في نموذج المورين لدينا متشابهة على حد سواء من الناحية العيانية والمرضية إلى HCC الإنسان. الاستفادة من هذا النموذج الموثوق به والأدوات المتقدمة، يمكننا دراسة هذا المرض البشري المعقد بما في ذلك نظرة ثاقبة في آليات تطوير HCC والعلاج المتاح سريريا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
لا يوجد شيء ليعلنه.
Acknowledgments
ويدعم هذا العمل من قبل NIH/ NCI R01 CA164335-01A1 (K. F. Staveley-O'Carroll, PI) وNIH/NCI R01CA208396 (مارك كستر، غوانغفو لي، كيفن ف. ستافيلي-أوكارول).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia machine | VETEQUIP | IMPAC6 | anesthesia machine for surgery |
| Butterfly needle | BD | 8122963 | Needle used for liver perfusion |
| C57BL/6 mice | Jackson Lab | 000664 | mice used in prototol |
| Carprofen | CRESCENT CHEMICAL | 20402 | carprofen for pain release |
| Cell Strainer | CORNING | REF 431751 | Cell strainer, 70µm, for hepatocytes isolation |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Allegra X-30R | centrifuge for cell isolation |
| Clips | Teleflex Medical | REF 523700 | Titanium Clips for spleen |
| Microscope | Zeiss | Primovert | microscope for cell observation |
| Mtd2 mice | N/A | Gift from Dr. William A Held at roswell Park Cancer Institute in 2002, maintained in our lab | |
| Needle | BD | REF 305109 | BD precisionglide needle, 27G x 1/2 (0.4mm x 13mm) |
| Suture | ETHICON | J303H | coated VICRYL suture |
| SV40 T Ag antibody | Abcam | ab16879 | anti-SV40 T-antigen antibody for IHC |
| Syringe | BD | REF 309626 | 1 mL TB syringe for cell injection |
| Trypan blue | SIGMA | T 8154 | Trypan blue solution for cell viability test |
| Wound clips | Reflex | reflex9, Part. No. 201-1000 | stainless steel wound clips for wound close |
References
- O'Connor, S., Ward, J. W. Hepatocellular carcinoma - United States. Morbidity and Mortality Weekly Report. 59, 517-520 (2010).
- Petrick, J., Kelly, S., Altekruse, S., McGlynn, K., Rosenberg, P. Future of Hepatocellular Carcinoma Incidence in the United States Forecast Through 2030. Journal of clinical oncology: official journal of the American Society of Clinical Oncology. 34, 1787-1794 (2016).
- Greten, T., Lai, C., Li, G., Staveley-O'Carroll, K. Targeted and Immune-based Therapies for Hepatocellular Carcinoma. Gastroenterology. 156, 510-524 (2019).
- Llovet, J., Zucman-Rossi, J., Pikarsky, E., Sangro, B., Schwartz, M., Sherman, M., Gores, G.
- Ding, X., et al. Precision medicine for hepatocellular carcinoma: driver mutations and targeted therapy. Oncotarget. 8, 55715-55730 (2017).
- Colombo, M., Maisonneuve, P. Controlling liver cancer mortality on a global scale: still a long way to go. Journal of Hepatology. 67, 216-217 (2017).
- Llovet, J., Burroughs, A., Bruix, J.
- Parkin, D., Bray, F., Ferlay, J., Pisani, P. Estimating the world cancer burden: Globocan 2000. International Journal of Cancer. 94, 153-156 (2001).
- Thomas, M., Zhu, A. Hepocellular carcinoma: the need for progress. Journal of Clinical Oncology. 23, 2892-2899 (2005).
- Llovet, J., Bruix, J. Molecular targeted therapies in hepatocellular carcinoma. Hepatology. 48, 1312-1327 (2008).
- Bruix, J., Sherman, M. Management of hepatocellular carcinoma: an update. Hepatology. 53, 1020-1022 (2011).
- Pang, T., Lam, V.
- Llovet, J., et al. Design and endpoints of clinical trials in hepatocellular carcinoma. Journal of the National Cancer Institution. 100, 698-711 (2008).
- Mueller, K. Cancer immunology and immunotherapy. Realizing the promise. Introduction. Science. 348, 54-55 (2015).
- Gajewski, T., Schreiber, H., Fu, Y. Innate and adaptive immune cells in the tumor microenvironment. Nature Immunology. 14, 1014-1022 (2013).
- Ribas, A., Wolchok, J. Combining cancer immunotherapy and targeted therapy. Current Opinion in Immunology. 25, 291-296 (2013).
- Postow, M., Callahan, M., Wolchok, J. Immune checkpoint blockade in cancer therapy. Journal of Clinical Oncology: Official Journal of the American Society of Clinical Oncology. 33, 1974-1982 (2015).
- Gao, J., et al. VISTA is an inhibitory immune checkpoint that is increased in ipilimumab therapy in patients with prostate cancer. Nature Medicine. 23, 551-555 (2017).
- Hahn, A., Gill, D., Pal, S., Agarwal, N. The future of immune checkpoint cancer therapy after PD-1 and CTLA-4. Immunotherapy. 9, 681-692 (2017).
- Remon, J., Besse, B. Immune checkpoint inhibitors in first-line therapy of advanced non-small cell lung cancer. Current Opinion in Oncology. 29, 97-104 (2017).
- Kudo, M. Immune checkpoint blockade in hepatocellular carcinoma: 2017 update. Liver Cancer. 6, 1-12 (2017).
- Kudo, M. Immune checkpoint inhibition in hepatocellular carcinoma: Basics and ongoing clinical trials. Oncology. 92, 50-62 (2017).
- Breous, E., Thimme, R. Potential of immunotherapy for hepatocellular carcinoma. Journal of Hepatology. 54, 830-834 (2011).
- Sprinzl, M., Galle, P. Facing the dawn of immunotherapy for hepatocellular carcinoma. Journal of Hepatology. 59, 9-10 (2013).
- Liu, D., Staveley-O'Carroll, K., Li, G. Immune-based therapy clinical trials in hepatocellular carcinoma. Journal of Clinical Cell Immunology. 6, 376 (2015).
- Greten, T., Wang, X., Korangy, F. Current concepts of immune based treatments for patients with HCC: from basic science to novel treatment approaches. Gut. 64, 842-848 (2015).
- Koster, B., de Gruijl, T., van den Eertwegh, A. Recent developments and future challenges in immune checkpoint inhibitory cancer treatment. Current Opinion in Oncology. 27, 482-488 (2015).
- Johnson, D., Sullivan, R., Menzies, A. Immune checkpoint inhibitors in challenging populations. Cancer. 123, 1904-1911 (2017).
- Li, H., et al. Programmed cell death-1 (PD-1) checkpoint blockade in combination with an mTOR inhibitor restrains hepatocellular carcinoma growth induced by hepatoma cell-intrinsic PD-1. Hepatology. 66, 1920-1933 (2017).
- Heindryckx, F., Colle, I., van Vlierberghe, H. Experimental mouse models for hepatocellular carcinoma research. International Journal of Experimental Pathology. 90, 367-386 (2009).
- Qi, X., et al. Development of inCVAX, in situ cancer vaccine, and its immune response in mice with hepatocellular cancer. Journal of Clinical and Cellular Immunology. 7, 438 (2016).
- Qi, X., et al. Development of a radiofrequency ablation platform in a clinically relevant murine model of hepatocellular cancer. Cancer Biology and Therapy. 16, 1812-1819 (2015).
- Liu, D., et al. Sunitinib represses regulatory T cells to overcome immunotolerance in a murine model of hepatocellular cancer. Oncoimmunology. 7, 1372079 (2017).
- Staveley-O'Carroll, K., et al. In vivo ligation of CD40 enhances priming against the endogenous tumor antigen and promotes CD8+ T cell effector function in SV40 T antigen transgenic mice. Journal of Immunology. 171, 697-707 (2003).
- Avella, D., et al. Regression of established hepatocellular carcinoma is induced by chemoimmunotherapy in an orthotopic murine model. Hepatology. 55, 141-152 (2012).
- Li, G., et al. Successful chemoimmunotherapy against hepatocellular cancer in a novel murine model. Journal of Hepatology. 66, 75-85 (2017).
- Li, G., et al. Nanoliposome C6-ceramide increases the anti-tumor immune response and slows growth of liver tumors in ice. Gastroenterology. 154, 1024-1036 (2018).
- Held, W., et al. T antigen expression and tumorigenesis in transgenic mice containing a mouse major urinary protein/SV40 T antigen hybrid gene. EMBO Journal. 8, 183-191 (1989).
- Hanahan, D., Weinber, R.
