Summary
ここでは、肝細胞癌(HCC)の典型的な免疫特徴を要約した肝癌の臨床的に関連するマウスモデルの開発について述べた。
Abstract
肝細胞癌(HCC)の典型的な免疫特性に対処する臨床的に関連する動物モデルの欠如は、基礎となるメカニズムの解明と革新的な免疫療法戦略の開発を著しく妨げている。ヒトHCCを要約する理想的な動物モデルを開発するために、免疫能力のある雄C57BL/6Jマウスは、まず肝臓線維症を誘導するために四塩化炭素(CCl4)注射を受け、次いで若い雄から組織学的に正常な発血性肝細胞を受け取る。SV40 T抗原(TAg)-トランスジェニックマウス(MTD2)を脾臓内(ISPL)接種により用いる。思春期のレシピエント雄マウスで生成されたアンドロゲンは、肝臓特異的プロモーターの制御下でTAg発現を開始する。その結果、転移した肝細胞は癌細胞となり、肝線維症/肝硬変の設定で腫瘍塊を形成する。この新しいモデルは、肝線維症/肝硬変のコンテキストでヒトHCCの開始と進行を模倣し、免疫機能障害を含むヒトHCCの最も典型的な特徴を反映する。
Introduction
肝細胞癌(HCC)は、米国(米国)1、2、3で最も急速に増加しているタイプの癌である。毎年、約85万人の新しい症例がこの致死性疾患6、7、8、9、10で死亡する4、5、700,000人と診断されている。世界で2番目に高いがん関連死の原因となっています。HCCの管理は、外科的切除、移植、切除、化学的化、またはソラフェニブ11のような全身療法を含む。外科的切除または移植を伴う早期診断および管理は、全体的な生存利益が最も高い4を有する。残念ながら、患者の大半は、後の段階に存在し、アブレーション、化学oembolizationまたはソラフェニブ12で管理を必要とします。ソラフェニブは、受容体チロシンキナーゼ阻害剤(RTKI)であり、切除不能なHCCの治療に利用可能な唯一の全身性薬物療法として2008年に食品医薬品局によって承認されました。薬物は、全体的な生存のわずかな増加を提供するが、7.9から10.7ヶ月13に、それはHCCを管理するために利用することができる新しい治療戦略を提供した。
確立された癌を排除するために免疫系を操作することは、がん研究14の急速に成長している分野です。免疫チェックポイント研究は、がん治療における免疫療法薬開発をかなり進めました15,16.FDAは、細胞傷害性Tリンパ球抗原4(CTLA-4)に対する抗体(Abs)、プログラムされた細胞死タンパク質1(PD-1)、および黒色腫、肺癌、頭頸部癌、および膀胱癌17の治療のためのリガンドPD-L1の使用を承認した。18歳,19歳,20.高度なHCCの治療のためのPD-1、PD-L1、またはCTLA-4に対する1つまたは複数の抗体を用いた単剤療法または併用療法の臨床試験は、進行中の21、22、23、および一部である試験は良好な結果を示している。2017年、FDAはソラフェニブに対する耐性を有するHCC患者を治療するための抗PD-1抗体の承認を加速したが、この治療の全体的な応答率はわずか14.3%である。他の戦略は、この時点で臨床実践に翻訳されていません24,25.免疫チェックポイント療法を改善するために腫瘍誘発深い免疫寛容を克服26;免疫チェックポイント療法の有効性を予測する;免疫関連の有害事象を防ぐ;投与経路、投与量、および頻度の最適化;そして、治療の効果的な組み合わせを見つける27,28,29すべてが非常に困難なタスクのまま.
現在、マウスモデルでHCCを誘導するために使用されるいくつかの従来のアプローチがあり、研究者の特定の研究質問30に応じて利用されている。ケノ毒性化合物を有する化学的に誘発されたHCCマウスモデルは、傷害誘発性悪性腫瘍を模倣する。HCC細胞株の異所性またはオルコトピック移植を介した異種移植片モデルは、薬物スクリーニングに適している。遺伝子組み換えマウスの数は、HCCの病態生理学を調査するために設計されています。ウイルス遺伝子、オンコ遺伝子および/または成長因子を発現するトランスジェニックマウスは、肝発癌に関与する経路の同定を可能にする。固有の制限により、これらのモデルはヒトHCCに見られる典型的な免疫特性を要約せず、基礎となるメカニズムの解明と革新的な免疫療法戦略の開発を著しく妨げている14 、15.我々は最近、臨床的に関連するマウスモデルを作成した。この新しいモデルは、ヒトのHCCの開始と進行を模倣するだけでなく、免疫機能障害を含むヒト疾患の最も典型的な特徴を反映している。その生物学的および免疫学的特性を特徴付けた。この新しいモデルを利用して、我々はHCC 31、32、33、34、35、36を治療するための様々な免疫療法戦略を探求してきた。37.このユニークなプラットフォームにより、腫瘍誘発免疫トレランスのメカニズムを研究し、最終的な臨床翻訳に向けたHCCの概念実証治療戦略を開発することができます。
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Protocol
注:動物の被験者を含むすべての手順は、ミズーリ大学のIACUCによって承認されています。すべてのマウスは、「実験動物のケアと使用のためのガイド」に概説された基準に従って人道的ケアを受けました。細胞の単離および接種のための次の手順はフードで行われるべきである。すべてのパフォーマーは、マウスおよび組織の取り扱いのための標準的な個人用保護具を着用する必要があります。
1. 脂肪塩化炭素のIP注入による肝線維症と肝硬変の誘導(CCl4)
注: 図 1 を参照してください。(CCl4は非常に危険な試薬であり、それは慎重に、耐薬品性手袋を着用して取り扱われるべきです)
- 生後6~8週の雄C57BL/6Jマウスを入手する(材料表参照)。
- 遠心管にトウモロコシ油で10%CCl4(v/v)溶液を調調します。注入するマウスの数に基づいて総体積を決定する(ステップ1.6を参照)。
- 適切なマウス処理技術を使用して、注射用に 1 つのマウスを選択します。
- 手動でその後部(腹部)側を上にしてマウスを拘束します。
- 70%のアルコールで洗うことによってマウスの腹壁に注射部位をきれいにします。
- 25ゲージの使い捨て針を用いて食肉内(IP)注射により、160 μLの10%CCl4溶液を用いてオスのC57BL/6Jマウスを注入する。
- 針が腹壁(約4〜5mm)を通って、ベベル側を上にして15〜20度でわずかに角度を付けて突き刺さっていることを確認します。
- マウスを週2回注射し、合計4週間の合計4週間の注射を行い、合計8回の注射を受ける。
注:最後の注射の2週間後、治療されたマウスはMTD2マウスからの発死性肝細胞のISPL接種の準備ができている。
2. ラインMTD2マウスからのタグトランス原性肝細胞の分離
注: ソリューションレシピについては、表 1を参照してください。
| CaまたはMgなしの10xアールのバランス塩溶液(CaまたはMgなしのEBSS) | 4 g KCl 68 g ナクル 1.4 グラム NaH2PO4 ·H2o 10 g デキストロース 水を1リットルに、pHを4.32に加える パススルーフィルタ |
| ソリューション 1 | Ca または Mg なしの 20 mL 10x EBSS 44 g ナフコ3 1.33 mL 1.5M ヘプ 10 mL EGTA の 10 mL 200 mLに水を加える |
| ソリューション 2 | 100 mL 10x EBSS 2.2 g ナフコ3 6.67 mL 1.5 M ヘプ 1リットルに水を追加 |
| 0.75% コラゲナーゼ溶液 | 15 mg コラゲナーゼ タイプ 1 20 mLの溶液 2 |
| 完全なメディア | 2 RPMI 50 mL FBS 5 mL 100x ペニシリン連鎖マイシン |
表 1: ソリューションのレシピ。
- 発細胞性肝細胞の供給源として役立つラインMTD2マウス38を得る。
- 2.5%イソルランを用いて5週齢のMTD2マウスを麻酔する。
注:適切な麻酔はつま先のピンチ法によってチェックされます。簡単に言えば、2本の指を使用して、マウスのつま先/足に良いスクイーズを与えます。撤退反応がない場合、動物は手術を開始するのに十分な深さと判断される。 - 十分に鎮静したら、マウスをサフィンの位置に置き、腹をテープで固定して腹部表面を十分に露出させます。
- 肝臓の十分な露出を提供するのに十分な大きさのリニアアルバの長さに沿ってはさみを使用して中間腹腔切開を行います。
- 肝臓とポータルトライアドのより良い露出を提供するために左に腸を置き換えます.
- 肝臓の上で解剖して、劣った静脈カバ(IVC)を露出させる。
- 動脈クランプを使用して肝臓の上にIVCをライゲートします。
- 肝臓の劣った境界に戻り、蝶の針(材料を参照)を使用して、ポータル静脈へのIVアクセスを得る。手でカテーテルを修正します。
- 溶液15mL、0.75%コラゲナーゼ溶液2の15mL、カテーテルを介して溶液2の15 mLを用いて8.9 mL/minの注射注射器を使用してマウス肝臓を連続的に浸透させる。
- 10-15 mLのPBSを有する50 mL円錐管でMTD2マウスから腫瘍塊を切断し、取ることによって、注入された肝臓を収穫する。
- PBSを削除し、PBSで追加の時間を洗浄します。この手順では遠心分離しないでください。
- はさみを使って肝臓を小さく切り、PBS 2xで再度洗って残りの血液を取り除きます。
- 円錐形のチューブに完全なRPMI媒体の5 mLを追加し、連続的に小片(<3ミリメートル)にはさみで肝臓をミンチ- 組織は滑らかに5 mLピペットを通過する必要があります。
- 30 mL の最終容積に完全な RPMI を追加し、5 mL ピペットを使用して肝臓を中断します。.
- 混合溶液を70 μmストレーナーで50 mL円錐管に濾過します。
- 完全なRPMIでストレーナーを数回洗浄し、RPMI培地を追加して最終容積を50mLに調整します。
- 遠心分離機でサスペンションを最大500rpmまで素早く回転させます。速度が50 x gに加速されたら、遠心分離機を停止する必要があります。
- PBSの20 mLで上清をデカントし、ペレットを中断します。
- トリパンブルーの除外と血球計を使用して細胞をカウントし、次の細胞接種のために細胞濃度を2.5 x 106/mLに調整します。
注:5グラムの腫瘍組織からの期待収量は、生存率>95%の8,000万肝細胞です。
3. ISPL注射による野生型C57BL/6Jマウスの肝臓へのMTD2マウスからの肝細胞接種
- 無菌技術は、すべての手順で使用する必要があります
- CCl4-処置された雄C57BL/6Jマウスを2.5%イソファランで麻酔し、マウスは目が乾燥するのを防ぐために眼の潤滑油で治療されるべきである。
- 注射用肝細胞の200 μLで注射器を調剤します。
- 十分に鎮静したら、マウスを左上に位置を付します。
- マウスの左脇腹全体を剃り、その後、70%のアルコールとベタジンの間で交互に3回、領域をスクラブします。
- 外科的切開の前に5 mg/kgのカルプロフェン皮下皮を投与する。
- 背骨の筋肉のすぐ下から背部極端な始まりから13番目の肋骨に平行に左脇腹に1cmの切開を行います。
- 脾臓を識別し、鈍い尖った鉗子を使用してそれを外装します。
- 脾臓を2つの中型チタンクリップでクリップします。脾動脈と静脈の間に両方のクリップを配置し、接種後に後でカットするクリップの間にスペースを残します。
注:目標は、播種のリスクを低減するために脾臓の下の極を分離することです。 - 27G針を用いて脾臓の下端の極に200μL(050万円)の肝細胞を注入する。
- ペディクルの下枝(下脾臓のポール容器)を中型のクリップ1本でクリップします。
- 最初に配置された 2 つのクリップの間に脾臓を切ります。
- 腫瘍細胞を直接注入した脾臓の劣った棒を取り除く。
- 3-0 ポリグラクチン 910 中断縫合を使用して、内側の筋肉層を閉じる。
- 殺菌されたスチール創傷クリップを使用して、外側の皮膚層を閉じます。
注:スチールクリップは、動物が縫合糸を噛み切るのを避けるために縫合糸よりも好ましく、隙間のある傷を残します。 - 縫合後に皮下にカルプロフェンの5 mg/kgを投与する。
- すべての回復動物を温度管理された加熱パッドに置き、麻酔から完全に回復するまで注意深く監視します。
- 手術後にマウスに水への無料アクセスを与えます。手術中にマウスが脱水状態になった場合は、皮下液(<1 mL)を投与する。
- 術後7~10日でスキンクリップを取り外します。
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Representative Results
TAg-トランスジェニックマウス(図2)から単離した発血性肝細胞を、脾臓内注射により野生型マウスの肝臓に播種した(図3)。移植された肝細胞は正常かつ確実に肝細胞を成長させ、肝炎症および線維症の設定において腫瘍特異的抗原SV40 TAg(図5)を有する正頭不最小HCC腫瘍(図4)を成長させた(図1)。
図1:HCCのマウスモデルを準備するための回路図。HCCの革新的なマウスモデルを確立するための実験設計。C57BL/6Jマウスは、肝線維症を誘発するために週2回CCl4のIP注射で4週間治療される。最後のIP注射の2週間後、CCl4-処理されたマウスは、ISPL接種を介して若い雄MTD2マウスから単離された肝細胞を受け取る。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:MTD2マウス行分からの肝細胞の単離および精製。(A)MTD2マウスから単離した肝細胞をプロトコルに従って調製し、トリパンブルーで染色し、細胞単離の生存率および純度を検出した。 左のパネルは、細胞抽出中に単離された肝細胞(黒い矢印)と腫瘍浸潤リンパ球(赤い矢印)の両方を示しています。 右のパネルは、肝細胞(黒い矢印)および有意に少ない腫瘍浸潤リンパ球を含む低速遠心分離後に残っている細胞集団を示しています。倍率=10倍目的、スケールバー=100μm(B)MTD2マウスから単離された肝細胞は、野生型C57BL/6Jマウスの接種前にトリパンブルー溶液で染色される。 細胞の単離は、生存率が >95% の場合に成功すると判断されます。 死んだ細胞はトリパンブルー(赤い矢印)で染色され、生存可能な細胞は染色されません(黒い矢印)。 倍率 = 10倍の対目的、スケールバー= 100 μm。右のグラフは、細胞単離の結果を示し、肝細胞の95%が生存可能で、統計データは顕微鏡下の5つの異なる観察された分野から来ている。エラーバーは+SDを表し、この図のより大きなバージョンを表示するにはここをクリックしてください。
図3:野生型C57BL/6Jマウスの肝臓への肝細胞の脾細胞内接種 C57BL/6JマウスにおけるHCCを誘導する肝細胞のISPL接種のための実験計画。(1)脾臓を同定し、外装する。(2)脾臓を2つの中型チタンクリップで切り取ります。(3)調製した肝細胞は脾臓の下極に注入される。(4)ペディクルの下枝(劣った脾臓の棒容器)は、1つの中型クリップでクリップされます。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:MTD2-肝細胞を接種した後のC57BL/6Jマウスにおける進行性腫瘍の発症(A)肝細胞癌(HCC)または子宮外腫瘍モデルは、プロトコルに従って確立された。解剖画像は、接種前およびサブシーケンシャルタイムコースで撮影された。(a) MTD2肝細胞の接種前に健康な肝臓を示す。(b) マウス肝臓 3ヶ月後に腫瘍の総発症の証拠を有する。(c) 腫瘍負担の増加に伴い接種後3.5ヶ月。(d) 接種後4.5ヶ月。(e) 肝臓全体に腫瘍の証拠を接種してから6ヶ月後。(B)腫瘍結節を採取し、MTD2肝細胞を接種した後に示された時点で計量した。 誤差バーは+SD.***P < 0.001を表し、統計分析はt-検定によって行われた。 (C)野生型およびMTD2接種肝切除の代表的な画像。ヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)染色は、シュードグランド形成(黒い矢印)を描写する。核群集があり、腫瘍細胞は高い核対細胞質比を有する好酸球である(拡大画像)。倍率 = 20 倍の目的、スケール バー = 50 μm。右上のインセットはさらに手動で増幅されます。(D)シリウス赤色染色は、異常なコラーゲン沈着を示し、肝線維症と一致する。倍率:40倍の目的、スケールバー= 20 μm.この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:腫瘍におけるSV40T抗原遺伝子の特異的検出。 (A)腫瘍組織およびマウス全体の追加組織試料を、腫瘍樹立マウスから採取した。 ゲノムDNAは、SV40TAgおよびP53(対照)の両方について組織およびプライマーから単離し、従来のPCR用に合成した。SV40 T抗原遺伝子は腫瘍組織で検出されたが、マウスの正常組織または他の組織のいずれにも存在しない。(B)腫瘍組織を腫瘍性マウスから採取し、抗SV40T抗原抗体で染色した。左パネルは、ナイーブマウスから採取された健康な肝臓組織からの陰性対照である。 右パネルは、腫瘍を有するマウスから採取した腫瘍組織の有意なSV40 T抗原染色(茶色色)を示す。 倍率 = 40倍の目標、スケールバー = 20 μm.この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
このプロトコルにより、ヒトHCCの開始と進行を模倣するHCCの信頼性と再現性の高いマウスモデルを確立しました。臨床的には、多くの危険因子が肝損傷、肝線維症、肝硬変およびHCCの最終段階を連続的に誘導する。我々のプロトコルでは、CCl4のIP注射は、最初に野生型マウスで肝線維症を生成するために使用され、その後の発生性肝細胞が肝線維症の設定で腫瘍を形成することを可能にする。CCl4治療の2週間後に肝細胞接種を受けたマウスでは、他の時点で注射を受けたマウスと比較して、腫瘍形成が最も成功したことがわかった。さらに、CCl4注射後4ヶ月以内に肝線維症を検出できることがわかった。このアプローチは、CCl4に曝露せずにマウスと比較してHCC腫瘍を発症するマウスの90%以上をもたらす。我々のモデルでは、ラインMTD2マウスからC57BL/6Jマウスに移された肝細胞は、TAgを組織抗原として発現する肝細胞として組み込まれる肝臓へのトラフィックである。MTD2からの肝細胞の単離は、このプロトコルの間に重要なステップです。MTD2マウス肝臓は、肝臓内の循環赤血球を完全に除去するために溶液1および2で完全に浸透している。コラゲナーゼ溶液は、肝細胞を放出するために適切な肝臓消化を生成するために示された濃度と速度で肝臓を浸透させるために使用されます.コラゲナゼの低濃度の使用は消化に不十分であり、肝細胞の塊をもたらす。対照的に、高濃度は組織に過酷であり、生存可能な肝細胞の有意な減少をもたらす。また、肝細胞の純度を向上させるためには、プロトコルに記載されている短い遠心分離が必要であることがわかります。遠心分離に使用した低いスピンは、これらの2種類の細胞の密度差に基づいて肝細胞を沈殿させ、上清中に白血病を残すことができます。
次の重要なステップは、野生型マウスに肝細胞を接種するための経路です。パイロット研究では、肝細胞接種を行う様々な方法を検討しました。肝臓における正常なオルソトピック腫瘍増殖は、尾静脈および食肉内投与を介して投与されたマウスと比較して、マウス当たり半分の百万細胞の用量で発血性肝細胞の内球内接種を受けるマウスで最もよく見られる。様々な用量で注射。これらの知見は、正所性HCCの成長が経路および用量依存性であることを示唆している。悪性転換は徐々に起こり、肝臓の無腎臓ではなく移植肝細胞の亜集団に限定される。継続的な細胞増殖は、肝臓全体で発症する腫瘍節をもたらす。
HCCや他の癌が進行するためには、免疫システムを回避する必要があります。実際には、免疫破壊を避けることは、現在、癌39の特徴と考えられています。しかし、腫瘍特異的抗原の欠如は、基礎となるメカニズムを解明するための重要な障壁である。我々のモデルでは、TAgは腫瘍特異的抗原として作用する他の器官ではなく、腫瘍で発現される。また、TAgは、C57BL/6JマウスのCD8 T細胞によって認識することができる多数の明確に定義されたエピトープを有する。TAgエピトープ-Iに関しては、このエピトープ34に対してT細胞受容体をトランスジェニカルに発現するライン416マウスを生成した。腫瘍抗原特異的免疫応答を調べるためにTAgを標的とすることで、DENまたは遺伝子操作によって誘導されるモデルを用いることができない腫瘍開始および進行中の腫瘍免疫サーベイランスを調べることができる。根本的なメカニズムを解明することで、腫瘍誘発性免疫トレランスを媒知り、重要な細胞や分子を同定することができます。これらの重要な要因を標的にすることは、HCCに対する革新的な免疫療法戦略の開発を大幅に進めることができます。このユニークなHCCモデルと確立されたツールを使用して、我々は腫瘍誘発耐性25、35の根底にあるメカニズムを調査し、様々な免疫ベースの抗腫瘍免疫療法31、32を探索しました,36歳,37.
要約すると、HCCの確立されたマウスモデルは、ヒト疾患のいくつかの典型的な特徴を反映している。以前に公開された記事では、ヒトHCCの典型的な特徴を有する臨床的に関連する腫瘍モデルとしてこれを確立することができました。CCl4およびMTD2肝細胞で治療したマウスがHCC関連抗原、AFPおよびGPC336を発現する腫瘍を発症したことを示した。病理学は、我々のマウスモデルの病変がヒトHCCとマクロ的および病理学的に類似していることを決定した。この信頼性の高いモデルと開発されたツールを活用して、HCC開発のメカニズムや臨床的に利用可能な治療のメカニズムに関する洞察を含む、この複雑なヒト疾患を研究することができます。
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Disclosures
宣言する人は一人もいます。
Acknowledgments
この作品は、NIH/NCI R01 CA164335-01A1(K. F. ステーブリー・オキャロル、PI)およびNIH/NCI R01CA208396(マーク・ケスター、グアンフー・リー、ケビン・F・ステーブリー・オキャロル)によってサポートされています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia machine | VETEQUIP | IMPAC6 | anesthesia machine for surgery |
| Butterfly needle | BD | 8122963 | Needle used for liver perfusion |
| C57BL/6 mice | Jackson Lab | 000664 | mice used in prototol |
| Carprofen | CRESCENT CHEMICAL | 20402 | carprofen for pain release |
| Cell Strainer | CORNING | REF 431751 | Cell strainer, 70µm, for hepatocytes isolation |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Allegra X-30R | centrifuge for cell isolation |
| Clips | Teleflex Medical | REF 523700 | Titanium Clips for spleen |
| Microscope | Zeiss | Primovert | microscope for cell observation |
| Mtd2 mice | N/A | Gift from Dr. William A Held at roswell Park Cancer Institute in 2002, maintained in our lab | |
| Needle | BD | REF 305109 | BD precisionglide needle, 27G x 1/2 (0.4mm x 13mm) |
| Suture | ETHICON | J303H | coated VICRYL suture |
| SV40 T Ag antibody | Abcam | ab16879 | anti-SV40 T-antigen antibody for IHC |
| Syringe | BD | REF 309626 | 1 mL TB syringe for cell injection |
| Trypan blue | SIGMA | T 8154 | Trypan blue solution for cell viability test |
| Wound clips | Reflex | reflex9, Part. No. 201-1000 | stainless steel wound clips for wound close |
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