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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

Un modelo de ratón ortotópico inducido por hepatocitos oncogénicos que surge en el ajuste de la inflamación hepática y la fibrosis

Published: September 12, 2019 doi: 10.3791/59368
Automatic Translation
*1,2,3, *1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2,3
1Department of Surgery, University of Missouri-Columbia, 2Ellis Fischel Cancer Center, University of Missouri-Columbia, 3Molecular Microbiology and Immunology, University of Missouri-Columbia
* These authors contributed equally

Summary

Aquí, describimos el desarrollo de un modelo murino clínicamente relevante de cáncer de hígado recapitulando las características inmunitarias típicas del cáncer hepatocelular (HCC).

Abstract

La ausencia de un modelo animal clínicamente relevante que aborde las características inmunitarias típicas del cáncer hepatocelular (HCC) ha impedido significativamente el esclarecimiento de los mecanismos subyacentes y el desarrollo de estrategias inmunoterapéuticas innovadoras. Para desarrollar un modelo animal ideal recapitulando HCC humano, los ratones machos inmunocompetentes C57BL/6J reciben primero una inyección de tetracloruro de carbono (CCl4) para inducir fibrosis hepática, luego reciben hepatocitos oncogénicos histológicamente normales de machojoven joven Ratones transgénicos de antígeno SV40 T (TAg) (MTD2) por inoculación intraesplénica (ISPL). Los andrógenos generados en ratones machoreceptores en la pubertad inician la expresión de TAg bajo el control de un promotor específico del hígado. Como resultado, los hepatocitos transferidos se convierten en células cancerosas y forman masas tumorales en el entorno de la fibrosis/cirrosis hepática. Este novedoso modelo imita la iniciación y progresión humana de hCC en el contexto de la fibrosis/cirrosis hepática y refleja las características más típicas de la HCC humana, incluida la disfunción inmune.

Introduction

El cáncer hepatocelular (HCC) es el tipo de cáncer que aumenta más rápidamente en los Estados Unidos (EE.UU.)1,2,3. Cada año, aproximadamente 850.000 nuevos casos se diagnostican4,5 y 700.000 pacientes mueren a causa de esta enfermedad letal6,7,8,9,10 , lo que la convierte en la segunda causa más alta de muerte relacionada con el cáncer en todo el mundo. El manejo de HCC incluye resección quirúrgica, trasplante, ablación, quimioembolización o terapias sistémicas, como sorafenib11. El diagnóstico y el manejo tempranos con resección quirúrgica o trasplante tienen el mayor beneficio de supervivencia global4. Desafortunadamente, la mayoría de los pacientes se presentan en una etapa posterior y requieren tratamiento con ablación, quimioembolización o sorafenib12. Sorafenib, un inhibidor receptor de tirosina quinasa (RTKI), fue aprobado por la Administración de Alimentos y Medicamentos en 2008 como la única terapia de medicamentos sistémicos disponible para el tratamiento de HCC no resecable. Aunque el fármaco sólo proporciona un aumento modesto en la supervivencia global, de 7.9 a 10.7 meses13, proporcionó una nueva estrategia terapéutica que podría ser utilizado para manejar HCC.

Manipular el sistema inmunitario para eliminar los cánceres establecidos es un campo de rápido crecimiento en la investigación del cáncer14. Los estudios de punto de control inmune han avanzado considerablemente el desarrollo de fármacos inmunoterapéuticos en el tratamiento del cáncer15,16. La FDA aprobó el uso de anticuerpos (Abs) contra el antígeno t-linfocitos T citotóxico 4 (CTLA-4), la proteína de muerte celular programada 1 (PD-1), y su ligando PD-L1 para el tratamiento del melanoma, el cáncer de pulmón, el cáncer de cabeza y cuello, y el cáncer de vejiga17, 18 , 19 , 20. Los ensayos clínicos de monoterapia o terapia combinada con uno o varios anticuerpos contra PD-1, PD-L1 o CTLA-4 para el tratamiento de la HCC avanzada están en curso21,22,23,y algunos ensayos han mostrado resultados favorables. En 2017, la FDA otorgó la aprobación acelerada para el anticuerpo anti-PD-1 para tratar a los pacientes con HCC, que son resistentes a sorafenib, pero la tasa de respuesta general de esta terapia es de sólo 14.3%. Otras estrategias no se han traducido en la práctica clínica en este momento24,25. Superar la tolerancia inmune profunda inducida por tumores para mejorar la terapia de punto de control inmune26; predecir la eficacia de la terapia de punto de control inmune; prevenir eventos adversos relacionados con el sistema inmunitario; optimizar la ruta de administración, la dosis y la frecuencia; y encontrar combinaciones efectivas de terapias27,28,29 siguen siendo tareas extremadamente desafiantes.

Hay varios enfoques convencionales utilizados para inducir HCC en modelos de ratón actualmente y se utilizan dependiendo de la pregunta de investigación particular del investigador30. Los modelos de ratón HCC inducidos químicamente con compuestos genotóxicos imitan la neoplasia maligna inducida por lesiones. Los modelos de xenoinjerto a través de la implantación ectópica u ortotópica de líneas celulares HCC son adecuados para la detección de fármacos. Varios ratones modificados genéticamente han sido diseñados para investigar la fisiopatología del HCC. Los ratones transgénicos que expresan genes virales, oncogenes y/o factores de crecimiento permiten la identificación de las vías implicadas en la hepatocarcinogénesis. Debido a las limitaciones inherentes, estos modelos no recapitulan las características inmunitarias típicas que se ven en el HCC humano, lo que ha impedido significativamente el esclarecimiento de los mecanismos subyacentes y el desarrollo de estrategias inmunoterapéuticas innovadoras14 ,15. Recientemente hemos creado un modelo murino clínicamente relevante. Este nuevo modelo no sólo imita la iniciación y progresión humana de HCC, sino que también refleja las características más típicas de la enfermedad humana, incluida la disfunción inmune. Hemos caracterizado sus características biológicas e inmunológicas. Aprovechando este novedoso modelo, hemos explorado diversas estrategias inmunoterapéuticas para tratar HCC31,32,33,34,35,36, 37. Esta plataforma única nos permite estudiar mecanismos de inmunotolerancia inducida por tumores y desarrollar estrategias terapéuticas de prueba de concepto para HCC hacia la posterior traducción clínica.

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Protocol

NOTA: Todo el procedimiento, incluidos los sujetos de animales, ha sido aprobado por la IACUC de la Universidad de Missouri. Todos los ratones recibieron atención humana de acuerdo con los criterios descritos en la "Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio". El siguiente procedimiento para el aislamiento celular y la inoculación se debe realizar en una campana. Todos los artistas deben usar el equipo de protección personal estándar para el manejo de los ratones y tejidos.

1. Inducción de fibrosis hepática y cirrosis con inyección IP de tetracloruro de carbono (CCl4)

NOTA: Vea la Figura 1. (CCl4 es un reactivo altamente peligroso, debe manipularse con cuidado y con guantes resistentes a productos químicos)

  1. Obtener ratones macho C57BL/6J de seis a ocho semanas de edad (ver Tabla de Materiales).
  2. Preparar 10% CCl4 (v/v) solución en aceite de maíz en un tubo centrífugo. Determinar el volumen total en función del número de ratones a inyectar (ver paso 1.6).
  3. Utilice la técnica de manejo de ratones adecuada para seleccionar un ratón para inyección.
  4. Retenga manualmente el ratón con su lado dorsal (abdomen) hacia arriba.
  5. Limpie el lugar de inyección en la pared abdominal del ratón frotando con 70% de alcohol.
  6. Inyectar ratones macho C57BL/6J con 160 ml de 10% CCl4 solución por inyección intraperitoneal (IP) utilizando una aguja desechable de calibre 25.
  7. Asegúrese de que la aguja penetre justo a través de la pared abdominal (aproximadamente 4-5 mm) con bisel hacia arriba y ligeramente inclinado a 15-20 grados.
  8. Inyectar ratones dos veces por semana durante un total de cuatro semanas: cada ratón recibirá un total de ocho inyecciones.
    NOTA: Dos semanas después de la última inyección, los ratones tratados están listos para la inoculación ISPL de hepatocitos oncogénicos de ratones MTD2.

2. Aislar los hepatocitos transgénicos en etiquetas de ratones MTD2 de línea

NOTA: Consulte la Tabla 1 para ver las recetas de la solución.

10x Solución de sal equilibrada de Earle sin Ca o Mg (EBSS sin Ca o Mg) 4 g KCl
68 g NaCl
1.4 g NaH2PO4 H2o
10 g dextrosa
Añadir agua a 1 litro, pH a 4.32
Pasar a través del filtro
Solución 1 20 mL 10x EBSS sin Ca o Mg
44 g NaHCO3
1.33 mL 1.5M Hepes
10 mL de 10 mL EGTA
Añadir agua a 200 ml
Solución 2 100 mL 10x EBSS
2.2 g NaHCO3
6,67 ml 1,5 M Hepes
Añadir agua a 1 litro
0.75% solución de colagenasa 15 mg de colagenasa tipo 1
20 ml de solución 2
Medio completo 2 RPMI
50 mL FBS
5 mL 100x Penicilina-Estreptomicina

Tabla 1: Recetas de solución.

  1. Obtenga la línea MTD2 ratones38 para servir como la fuente de hepatocitos oncogénicos.
  2. Anestetizar ratones MTD2 de 5 semanas de edad usando 2.5% isoflurano.
    NOTA: La anestesia adecuada se comprobará mediante el método de pellizcar de los dedos del dedo del pecho. En resumen, con dos dedos, dar al dedo del ratón / pie un buen apretón. Si no hay reacción de abstinencia, el animal es juzgado lo suficientemente profundo como para comenzar la cirugía.
  3. Cuando esté ndado adecuadamente, coloque los ratones en una posición supina y fije las extremidades con cinta adhesiva para proporcionar una exposición adecuada de la superficie abdominal.
  4. Realizar una incisión de laparotomía de línea media utilizando tijeras a lo largo de la longitud de la línea alba lo suficientemente grande como para proporcionar una exposición adecuada del hígado.
  5. Desplazar los intestinos hacia la izquierda para proporcionar una mejor exposición del hígado y la tríada del portal.
  6. Diseccionar por encima del hígado para exponer la vena cava inferior (IVC).
  7. Ligar el CIV por encima del hígado usando una abrazadera arterial.
  8. Volviendo al borde inferior del hígado, utilice una aguja de mariposa (ver materiales) para obtener acceso IV a la vena porta. Fije el catéter a mano.
  9. Perfundie sucesivamente el hígado del ratón utilizando una jeringa de inyección a 8,9 ml/min con 15 ml de solución 1, 15 ml de solución de colagenasa al 0,75% 2 y 15 ml de solución 2 a través del catéter.
  10. Cosecha el hígado perfundido cortando y tomando la masa tumoral de ratones MTD2 en un tubo cónico de 50 ml con 10-15 ml de PBS.
  11. Retire PBS y lave un tiempo adicional con PBS; no centrifugar en este paso.
  12. Corta el hígado en trozos más pequeños usando tijeras y luego lávate de nuevo con PBS 2x para eliminar la sangre restante.
  13. Añadir 5 ml de medio RPMI completo al tubo cónico y picar continuamente el hígado con tijeras a trozos pequeños (<3 mm)-tejido debe pasar suavemente a través de una pipeta de 5 ml.
  14. Agregue RPMI completo a un volumen final de 30 ml y suspenda el hígado con una pipeta de 5 ml.
  15. Filtrar la solución mixta con un colador de 70 m en un tubo cónico de 50 ml.
  16. Lave el colador varias veces con RPMI completo y ajuste el volumen final a 50 ml añadiendo medio RPMI adicional.
  17. Gire rápidamente la suspensión centrífuga hasta un máximo de 500 rpm; una vez que la velocidad se acelera a 50 x g, la centrífuga debe ser detenida.
  18. Decantar los gránulos sobrenadant y suspender en 20 mL de PBS.
  19. Cuente las celdas usando la exclusión azul de Trypan y un hemocitómetro, luego ajuste la concentración celular a 2.5 x 106/mL para la siguiente inoculación celular.
    NOTA: El rendimiento esperado de 5 gramos de tejido tumoral es de 80 millones de hepatocitos con viabilidad >95%.

3. Inocular los hepatocitos de ratones MTD2 al hígado de ratones salvajes de tipo C57BL/6J por inyección de ISPL

  1. La técnica aséptica debe utilizarse en todos los procedimientos
  2. Anestetizar los ratones macho C57BL/6J tratados con CCl4con 2,5% de isoflurano, los ratones deben ser tratados con lubricante para los ojos para evitar que los ojos se sequen.
  3. Prepare jeringas con 200 ml de hepatocitos inyectables.
  4. Cuando esté ndado adecuadamente, coloque los ratones con el lado izquierdo hacia arriba.
  5. Afeitar todo el flanco izquierdo de los ratones, luego fregar el área, alternando entre 70% de alcohol y betadina tres veces.
  6. Administrar 5 mg/kg de carprofeno subcutaneouly antes de la incisión quirúrgica.
  7. Hacer una incisión de 1 cm en el flanco izquierdo paralelo a lacostilla 13 desde el extremo dorsal que comienza justo debajo del músculo de la columna vertebral.
  8. Identifique el bazo y, a continuación, exteriorícelo con fórceps contundentes.
  9. Sujete el bazo con dos clips de titanio de tamaño medio. Coloque ambos clips entre la arteria esplénica y la vena, deje espacio entre los clips para cortar más tarde después de la inoculación.
    NOTA: El objetivo es aislar el polo inferior del bazo para reducir el riesgo de sembración.
  10. Inyectar 200 l (0,5 millones) de los hepatocitos preparados en el polo inferior del bazo utilizando una aguja de 27 G.
  11. Sujete la rama inferior del pedicular (vasos de poste esplénico inferior) con un clip de tamaño medio.
  12. Corte el bazo entre los dos clips colocados inicialmente.
  13. Retire el polo inferior del bazo que se inyectó directamente con células tumorales.
  14. Utilice 3-0 poliglactina 910 con sutura interrumpida para cerrar la capa muscular interna.
  15. Utilice clips de acero esterilizado para cerrar la capa externa de la piel.
    NOTA: Los clips de acero se prefieren sobre las suturas para evitar que los animales mastiquen suturas, dejando una herida abierta.
  16. Administrar 5 mg/kg de carprofeno por vía subcutánea después de la sutura.
  17. Coloque todos los animales en recuperación en una almohadilla de calentamiento con temperatura controlada y monitoree de cerca hasta que se recuperen completamente de la anestesia.
  18. Dé a los ratones acceso gratuito al agua después de la cirugía. Si el ratón se deshidrata durante la cirugía, administre líquidos subcutáneos (<1 ml).
  19. Retire los clips de piel a los 7-10 días posteriores a la operación.

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Representative Results

Los hepatocitos oncogénicos aislados de ratones transgénicos tag(Figura 2) fueron sembrados en el hígado de ratones de tipo salvaje por inyección intraesplénica(Figura 3). Los hepatocitos trasplantados crecieron con éxito y de forma fiable tumores ortotópicos de HCC(Figura 4) con antígeno específico tumoral SV40 TAg (Figura 5) en el entorno de inflamación hepática y fibrosis (Figura 1).

Figure 1
Figura 1: Esquema para la preparación del modelo de ratón de HCC. El diseño experimental para establecer un modelo murino innovador de HCC. Los ratones C57BL/6J se tratan primero con inyección IP de CCl4 dos veces por semana durante cuatro semanas para inducir fibrosis hepática. Dos semanas después de la última inyección de IP, los ratones tratados con CCl4reciben hepatocitos aislados de ratones machos jóvenes MTD2 a través de la inoculación ISPL. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Aislamiento y purificación de hepatocitos de ratones MTD2 de línea. (A) Los hepatocitos aislados de ratones MTD2 fueron preparados de acuerdo con el protocolo y manchados con trippan azul para detectar la viabilidad y pureza del aislamiento celular.  El panel izquierdo muestra tanto los hepatocitos (flecha negra) como los linfocitos infiltrantes tumorales (flechas rojas) que se aíslan durante la extracción celular.  El panel derecho muestra la población celular restante después de la centrifugación a baja velocidad, incluyendo hepatocitos (flecha negra) y significativamente menos linfocitos infiltrantes de tumores. Ampliación 10x objetivo, barra de escala a 100 m. (B) Los hepatocitos aislados de ratones MTD2 se tiñen con solución azul de trippan antes de la inoculación de ratones de tipo salvaje C57BL/6J.  Se determina que el aislamiento de celdas es correcto si la viabilidad es >95%.  Las celdas muertas se teñirán con el azul trypan (flechas rojas), mientras que las celdas viables no se teñirán (flecha negra).  Ampliación: objetivo de 10x, barra de escala a 100 m. El gráfico de la derecha muestra los resultados del aislamiento celular con >95% de los hepatocitos siendo viables, los datos estadísticos provienen de 5 campos observados diferentes bajo microscopio; barras de error representan +SD. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Inoculación intraesplénica de hepatocitos en el hígado de ratones salvajes de tipo C57BL/6J.  El diseño experimental para la inoculación ISPL de hepatocitos para inducir HCC en ratones C57BL/6J. (1) El bazo se identifica y exterioriza. (2) El bazo se recorta con dos clips de titanio de tamaño medio. (3) Los hepatocitos preparados se inyectan en el polo inferior del bazo. (4) La rama inferior del pediculo (vasos de poste esplénico inferior) se recorta con un clip de tamaño medio. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Desarrollo progresivo del tumor en ratones C57BL/6J después de la inoculación con hepatocitos MTD2. (A) El modelo de tumor ortotópico del carcinoma hepatocelular (HCC) se estableció de acuerdo con el protocolo. Las imágenes anatómicas se tomaron antes de la inoculación y en los cursos de tiempo subsecuenciales. (a) Muestra hígado sano antes de la inoculación con hepatocitos MTD2. (b) Hígado de ratón 3 meses después de la inoculación con evidencia de desarrollo grave del tumor. (c) 3,5 meses después de la inoculación con aumento de la carga tumoral. (d) 4,5 meses después de la inoculación. (e) 6 meses después de la inoculación con evidencia de tumor en todo el hígado. (B) Los nódulos tumorales se cosecharon y pesaron en los puntos de tiempo indicados después de la inoculación con hepatocitos MTD2.  Las barras de error representan +SD. ***P < 0.001, el análisis estadístico se realizó mediante pruebas t.  (C) Imágenes representativas de las secciones hepáticas de tipo salvaje e inoculados mtD2. La tinción de hematoxilina y eosina (H&E) representa la formación de pseudogland (flechas negras). Hay aglomeración nuclear, y las células tumorales son eosinofílicas con altas relaciones núcleo-citoplasma (imagen magnificada). Ampliación: objetivo de 20x, barra de escala a 50 m. Los recuadros en la parte superior derecha se amplifican manualmente. (D) Tinción roja de Sirio que indica una deposición anormal de colágeno, consistente con fibrosis hepática. Ampliación: objetivo de 40x, barra de escala a 20 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Detección específica del gen del antígeno SV40 T en el tumor.  (A) Se recogieron muestras de tejido tumoral y tejido adicionales en ratones de ratones establecidos en tumores.  El ADN genómico se aisló del tejido y las imprimaciones para SV40 T Ag y P53 (control) fueron sintetizadas para PCR convencional. El gen del antígeno SV40 T se detectó en el tejido tumoral, pero no está presente en el tejido normal u otro tejido de los ratones. (B) El tejido tumoral se recogió de ratones portadores de tumores y se manicomió con anticuerpo anti-SV40 T antígeno. El panel izquierdo es un control negativo del tejido hepático sano recogido de ratones ingenuos.  El panel derecho muestra una tinción significativa del antígeno SV40 T del tejido tumoral recolectada de ratones portadores de tumores (color marrón).  Ampliación: objetivo de 40x, barra de escala a 20 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Con este protocolo, hemos establecido un modelo murino fiable y reproducible de HCC que imita la iniciación y progresión humana de HCC. Clínicamente, muchos factores de riesgo inducen sucesivamente lesiones hepáticas, fibrosis hepática, cirrosis y la etapa final del HCC. En nuestro protocolo, la inyección IP de CCl4 se utiliza primero para producir fibrosis hepática en ratones de tipo salvaje, lo que permite que los posteriores hepatocitos oncogénicos formen los tumores en el entorno de la fibrosis hepática. Encontramos que la formación de tumores se produjo con mayor éxito en ratones que recibieron la inoculación de hepatocitos dos semanas después del tratamiento con CCl4, en comparación con los ratones que recibieron inyecciones en otros momentos. Además, encontramos fibrosis hepática se puede detectar hasta cuatro meses después de la inyección de CCl4. Este enfoque da como resultado más del 90% de los ratones que desarrollan tumores de HCC en comparación con los ratones sin exposición a CCl4. En nuestro modelo, los hepatocitos transferidos de ratones MTD2 de línea a ratones C57BL/6J, trafican al hígado donde se incorporan como hepatocitos que expresan TAg como antígeno tisular. El aislamiento de hepatocitos de MTD2 es un paso crítico durante este protocolo. Los hígados de ratón MTD2 se perfunden a fondo con la solución 1 y 2 para eliminar completamente los glóbulos rojos circulantes dentro del hígado. La solución de colagenasa se utiliza para perfumar el hígado a la concentración y velocidad indicadas para generar una digestión hepática adecuada para liberar hepatocitos. El uso de concentraciones más bajas de colagenasa es insuficiente para la digestión, lo que resulta en grumos de hepatocitos. Por el contrario, las altas concentraciones son demasiado duras para el tejido, lo que resulta en una reducción significativa de los hepatocitos viables. También encontramos que la breve centrifugación como se describe en nuestro protocolo es necesaria para mejorar la pureza de los hepatocitos. El espín inferior que usamos para la centrifugación puede precipitar hepatocitos y dejar leucocitos en el sobrenadante basado en la diferencia de densidad de estos dos tipos de células.

El siguiente paso crítico es la ruta para inocular hepatocitos en ratones de tipo salvaje. En nuestros estudios piloto, exploramos varias maneras de llevar a cabo la inoculación de hepatocitos. El exitoso crecimiento tumoral ortotópico en el hígado se ve mejor en ratones que reciben inoculación intraesplénica de hepatocitos oncogénicos a una dosis de medio millón de células por ratón, en comparación con los ratones que reciben células administradas a través de la vena de la cola y intraperitoneal inyección a varias dosis. Estos hallazgos sugieren que el crecimiento ortotópico de HCC es ruta y depende de la dosis. La transformación maligna se produce gradualmente y se limita a la subpoblación de hepatocitos trasplantados en lugar de todo el parénquima hepático. La proliferación celular continua da lugar a que los nódulos tumorales se desarrollen en todo el hígado.

Para que el HCC u otros tipos de cáncer progresen debe evadir el sistema inmunológico; de hecho, evitar la destrucción inmune se considera ahora un sello distintivo del cáncer39. Sin embargo, la falta de antígeno específico para tumores es una barrera crítica para dilucidar los mecanismos subyacentes. En nuestro modelo, TAg se expresa en los tumores, no en otros órganos, que actúa como un antígeno específico del tumor. Además, TAg tiene numerosos epítopos bien definidos que pueden ser reconocidos por las células T CD8 en ratones C57BL/6J. En cuanto al epitope-I de TAg, hemos generado la línea 416 ratones que expresan transgénicamente los receptores de células T para este epítopo34. Apuntar a TAg para examinar la respuesta inmune específica del antígeno tumoral nos permite investigar la vigilancia inmune del tumor durante la iniciación y progresión del tumor, lo que no es posible utilizando modelos inducidos por DEN o manipulación genética. Eleludar los mecanismos subyacentes nos permite identificar células y moléculas críticas que median la tolerancia inmune inducida por tumores. Dirigirse a estos factores clave puede avanzar significativamente en nuestro desarrollo de estrategias inmunoterapéuticas innovadoras contra el CCH. Utilizando este modelo único de HCC y herramientas establecidas, hemos investigado los mecanismos subyacentes a la tolerancia inducida por tumores25,35 y explorado varias inmunoterapias antitumorales basadas en inmunes31,32 , 36 , 37.

En resumen, nuestro modelo murino establecido de HCC refleja algunas características típicas de la enfermedad humana. En nuestro artículo publicado anteriormente, pudimos establecer esto como un modelo tumoral clínicamente relevante que tenía características típicas de HCC humano. Mostramos que los ratones tratados con hepatocitos CCl4 y MTD2 desarrollaron tumores que expresaban antígenos asociados a HCC, AFP y GPC336. Patología determinó que las lesiones en nuestro modelo murino son similares tanto macroscópica como patológicamente a HCC humano. Aprovechando este modelo confiable y las herramientas desarrolladas, podemos estudiar esta compleja enfermedad humana incluyendo información sobre los mecanismos de desarrollo de HCC y el tratamiento clínicamente disponible.

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Disclosures

No hay nadie que declarar.

Acknowledgments

Este trabajo cuenta con el apoyo de NIH/NCI R01 CA164335-01A1 (K. F. Staveley-O'Carroll, PI) y NIH/NCI R01CA208396 (Mark Kester, Guangfu Li, Kevin F. Staveley-O'Carroll).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anesthesia machine VETEQUIP IMPAC6 anesthesia machine for surgery
Butterfly needle BD 8122963 Needle used for liver perfusion
C57BL/6 mice Jackson Lab 000664  mice used in prototol
Carprofen CRESCENT CHEMICAL 20402 carprofen for pain release
Cell Strainer  CORNING REF 431751 Cell strainer, 70µm, for hepatocytes isolation
Centrifuge Beckman Coulter Allegra X-30R centrifuge for cell isolation
Clips  Teleflex Medical REF 523700 Titanium Clips for spleen
Microscope Zeiss Primovert  microscope for cell observation
Mtd2 mice N/A Gift from Dr. William A Held at roswell Park Cancer Institute in 2002, maintained in our lab
Needle BD REF 305109 BD precisionglide needle, 27G x 1/2 (0.4mm x 13mm)
Suture ETHICON J303H coated VICRYL suture
SV40 T Ag antibody Abcam ab16879 anti-SV40 T-antigen antibody for IHC
Syringe BD REF 309626 1 mL TB syringe for cell injection
Trypan blue SIGMA T 8154 Trypan blue solution for cell viability test
Wound clips Reflex reflex9, Part. No. 201-1000 stainless steel wound clips for wound close

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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Cancer Research Número 151 cáncer hepatocelular modelo tumoral ratón modelo murino fibrosis hepática cáncer
Un modelo de ratón ortotópico inducido por hepatocitos oncogénicos que surge en el ajuste de la inflamación hepática y la fibrosis
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Qi, X., Schepers, E., Avella, D., Kimchi, E. T., Kaifi, J. T., Staveley-O'Carroll, K. F., Li, G. An Oncogenic Hepatocyte-Induced Orthotopic Mouse Model of Hepatocellular Cancer Arising in the Setting of Hepatic Inflammation and Fibrosis. J. Vis. Exp. (151), e59368, doi:10.3791/59368 (2019).

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