Nanopore अनुक्रमण एक उपंयास प्रौद्योगिकी है कि दूरदराज के स्थानों और संसाधन गरीब सेटिंग्स में लागत प्रभावी अनुक्रमण की अनुमति देता है । यहाँ, हम पूरी रक्त कि ऐसी स्थितियों के साथ संगत है से mRNAs के अनुक्रमण के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं ।
दूरस्थ स्थानों और संसाधन-गरीब सेटिंग्स में Sequencing अद्वितीय चुनौतियां प्रस्तुत करता है । ऐसी परिस्थितियों में नैनोकोर अनुक्रमण का सफलतापूर्वक उपयोग किया जा सकता है, और हाल ही में इबोला वायरस महामारी के दौरान पश्चिम अफ्रीका में तैनात किया गया था, इस संभावना को रेखांकित करते हुए । अपने व्यावहारिक लाभ के अलावा (कम लागत, उपकरण परिवहन और उपयोग की आसानी), इस तकनीक को भी दूसरी पीढ़ी के अनुक्रमण दृष्टिकोण पर मौलिक लाभ प्रदान करता है, विशेष रूप से बहुत लंबे समय तक पढ़ने की लंबाई, सीधे अनुक्रम करने की क्षमता आरएनए, और डेटा की वास्तविक समय उपलब्धता । रॉ पढ़ें सटीकता अंय अनुक्रमण प्लेटफार्मों, जो इस तकनीक की मुख्य सीमा का प्रतिनिधित्व करता है के साथ तुलना में कम है; हालांकि, यह आंशिक रूप से उत्पन्न उच्च पठन गहराई से शमन कर सकते हैं । यहाँ, हम Niemann-पिक C1, जो ebolaviruses के लिए सेलुलर रिसेप्टर है के लिए एन्कोडिंग mRNAs के अनुक्रमण के लिए एक क्षेत्र संगत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं. इस प्रोटोकॉल में पशु रक्त नमूनों से शाही सेना का निष्कर्षण शामिल है, लक्ष्य संवर्धन, बारकोडिंग, पुस्तकालय तैयार करने के लिए आरटी-पीसीआर द्वारा पीछा किया, और अनुक्रमण ही चलाने के लिए, और आसानी से अन्य डीएनए या आरएनए लक्ष्यों के साथ उपयोग के लिए अनुकूलित कर सकते हैं ।
अनुक्रमण जैविक और जैव चिकित्सा अनुसंधान में एक शक्तिशाली और महत्वपूर्ण उपकरण है । यह जीनोम, आनुवंशिक विविधताओं, और आरएनए अभिव्यक्ति प्रोफाइल के विश्लेषण की अनुमति देता है, और इस तरह1,2एक जैसे मानव और पशु रोगों की जांच में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है । , डीएनए अनुक्रमण के लिए उपलब्ध सबसे पुराने तरीकों में से एक sanger अनुक्रमण, अभी भी नियमित रूप से इस दिन के लिए प्रयोग किया जाता है और आणविक जीव विज्ञान के एक कोने पत्थर किया गया है । पिछले ५० वर्षों में, इस तकनीक को पढ़ने की लंबाई को प्राप्त करने के लिए सुधार किया गया है १,००० से अधिक nt और एक सटीकता ९९.९९९%1के रूप में उच्च के रूप में । हालांकि, सेंगर सीक्वेसिंग की भी सीमाएं हैं । नमूनों का एक बड़ा सेट या इस विधि के साथ पूरे जीनोम के विश्लेषण के अनुक्रमण समय लेने वाली और महंगी1,3है । दूसरी पीढ़ी (अगली पीढ़ी) डीएनए अनुक्रमण विधियों जैसे ४५४ pyrosequencing और Illumina प्रौद्योगिकी के रूप में हमें काफी लागत और पिछले एक दशक में अनुक्रमण के लिए आवश्यक कार्यभार को कम करने की अनुमति दी है, और में एक जबरदस्त वृद्धि करने के लिए नेतृत्व किया है जैविक अनुक्रम जानकारी उपलब्ध की राशि4। फिर भी, व्यक्तिगत अनुक्रमण इन दूसरी पीढ़ी के प्रौद्योगिकियों का उपयोग कर चलाता है महंगे हैं, और क्षेत्र की स्थितियों के तहत अनुक्रमण चुनौतीपूर्ण है, के रूप में आवश्यक उपकरण भारी और नाजुक है (Sanger अनुक्रमण उपकरणों के समान), और अक्सर कैलिब्रेट किया और विशेष रूप से प्रशिक्षित कर्मियों द्वारा सेवित । इसके अलावा, दूसरी पीढ़ी के कई प्रौद्योगिकियों के लिए पढ़ें-लंबाई बल्कि सीमित है, जो अक्सर इन डेटा चुनौतीपूर्ण के बहाव bioसूचनाविज्ञान विश्लेषण करता है ।
पॉकेट-आकार नैनोकोर अनुक्रमण उपकरणों का उपयोग कर तीसरी पीढ़ी के अनुक्रमण ( सामग्री तालिकादेखें) इन स्थापित sequencing प्लेटफार्मों के लिए एक विकल्प के रूप में सेवा कर सकते हैं । इन युक्तियों में एक एकल-असहाय डीएनए या आरएनए अणु नैनोपोर से एक साथ एक आयनिक धारा के साथ गुजरता है जिसे फिर एक संवेदक द्वारा मापा जाता है (चित्र 1) । जैसे-किनारा नैनोपोर को traverses करता है, किसी भी दिए गए समय में ताकना में मौजूद न्यूकोटाइड द्वारा वर्तमान के मॉडुलन का पता लगाया जाता है, और कंप्यूटेट्युट को न्यूकोटाइडअनुक्रम में वापस-अनुवादित किया जाता है । इस परिचालनात्मक सिद्धांत के कारण, नैनोकोर अनुक्रमण बहुत लंबी reads की दोनों पीढ़ी (1 x 106 न्यूनाभिकोटाइड6के करीब) और वास्तविक समय में अनुक्रमण डेटा के विश्लेषण की अनुमति देता है । बारकोडिंग एक नमूना है, जो एक एकल अनुक्रमण चलाने में कई नमूनों के विश्लेषण की अनुमति देता है, इस प्रकार नमूना throughput बढ़ रही है और प्रति नमूना लागत को कम करने में न्यूमिक एसिड के लिए परिभाषित न्यूकोटाइड दृश्यों संलग्न द्वारा संभव है. उनकी उच्च पोर्टेबिलिटी और उपयोग में आसानी के कारण, पश्चिम अफ्रीका में हाल ही में इबोला वायरस रोग महामारी के दौरान नैनोकोर सीक्वेंसिंग उपकरणों का सफलतापूर्वक उपयोग किया गया है, जिससे सुदूर क्षेत्रों में त्वरित तैनाती के लिए उनकी उपयुक्तता पर प्रकाश डाला गया है7 , ८।
यहाँ, हम एक विस्तृत क्षेत्र-संगत प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए mRNA एंकोडिंग के अनुक्रमण Niemann-लेने C1 (NPC1) प्रोटीन है, जो अबाध्यकारी प्रवेश रिसेप्टर ऐसे ebolaviruses के रूप में filoवायरसों के लिए है, और प्रजातियों के लिए संवेदनशीलता को सीमित करने के लिए दिखाया गया है ये वायरस9,10। प्रोटोकॉल रक्त नमूनों से पूरे शाही सेना के निष्कर्षण शामिल है, आरटी द्वारा NPC1 mRNA के विशिष्ट प्रवर्धन-पीसीआर, नमूनों की बारकोडिंग, पुस्तकालय तैयारी और एक नैनोकोर अनुक्रमण डिवाइस के साथ अनुक्रमण । डेटा विश्लेषण अंतरिक्ष सीमाओं के कारण चर्चा नहीं की जा सकती, हालांकि कुछ बुनियादी दिशाओं प्रतिनिधि परिणामों में प्रदान की जाती हैं; हालांकि, रुचि पाठक एक पिछले प्रकाशन11 के लिए एक और अधिक विस्तृत विवरण के लिए कार्यप्रवाह हम इस्तेमाल किया, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से दूसरों के प्रकाशन के लिए भेजा है12,13,14 विस्तृत जानकारी के लिए इस वर्कफ़्लो में उपयोग किए गए विश्लेषण उपकरणों के बारे में ।
पिछले दो दशकों के दौरान, जैविक नमूनों की सीक्वेंसिंग विषय क्षेत्रों की विस्तृत श्रृंखला में अध्ययन का एक उत्तरोत्तर महत्वपूर्ण पहलू बन गया है । डीएनए सुविधाओं के एक घने सरणी के अनुक्रमण पर आधारित दूसरी पीढ़ी के अनुक्रमण प्रणालियों के विकास एंजाइमी हेरफेर और छवि आधारित डेटा अधिग्रहण के पुनराकर्षक चक्र का उपयोग कर नाटकीय रूप से throughput की तुलना में वृद्धि हुई है पारंपरिक sanger अनुक्रमण तकनीक, और समानांतर4में एक दिए गए नमूने में कई नमूनों के रूप में के रूप में अच्छी तरह से विभिंन न्यूक्लिक एसिड प्रजातियों के विश्लेषण की अनुमति देता है । हालांकि, आमतौर पर इस्तेमाल किया दूसरी पीढ़ी के सिस्टम के अधिकांश के लिए, केवल लघु पढ़ता है उत्पादित कर रहे हैं, और सभी प्लेटफार्मों संवेदनशील, भारी, और महंगे उपकरण3,4पर भरोसा करते हैं ।
दूसरी पीढ़ी के अनुक्रमण प्लेटफार्मों के विपरीत, इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया अनुक्रमण डिवाइस नैनोपोर प्रौद्योगिकी पर आधारित है । यहाँ एक एकल-असहाय न्यूइक अम्ल अणु नैनोकोर के माध्यम से गुजरता है, जिसके परिणामस्वरूप आयनिक धारा का मॉडुलन होता है, जो उसी नैनोपोर के माध्यम से प्रवाहित होता है, और जिसे मापा जा सकता है और न्यूकॉलिक अम्ल अणु के अनुक्रम का अनुमान लगाने के लिए वापस अनूदित किया जाता है । यह तीसरी पीढ़ी के अनुक्रमण दृष्टिकोण अंय दृष्टिकोण से अधिक लाभ की एक संख्या प्रदान करता है । मुख्य लाभ है कि सीधे इस प्रौद्योगिकी के अद्वितीय काम कर रहे सिद्धांत से संबंधित है बहुत लंबे समय तक पढ़ने की लंबाई का उत्पादन कर रहे है (८.८ इसके अलावा आरएनए सीधे, जो हाल ही में एक पूर्ण इंफ्लूएंजा वायरस जीनोम के लिए प्रदर्शन किया गया था17, और वास्तविक समय में डेटा का विश्लेषण करने की क्षमता के रूप में वे उत्पंन किया जा रहा है, जो18मिनट के भीतर रोगजनकों की तेजी से metagenomics पता लगाने की अनुमति देता है । अतिरिक्त व्यावहारिक लाभ नैनोकोर अनुक्रमण डिवाइस के अत्यंत छोटे आकार के हैं, किसी भी प्रयोगशाला में या दूरदराज के स्थानों के लिए क्षेत्र मिशन पर इसके उपयोग की अनुमति19,20, और अन्य अनुक्रमण की तुलना में कम कीमत प्लेटफार्मों. चल रहे लागत के संदर्भ में, वर्तमान में एक नया प्रवाह सेल प्रत्येक अनुक्रमण चलाने के लिए आवश्यक है, जो प्रवाह सेल और पुस्तकालय तैयारी अभिकर्मकों के लिए प्रति रन के बारे में $१,१०० की लागत में परिणाम है । इन लागत को धोने और प्रवाह सेल reusing द्वारा कुछ मामलों में कम किया जा सकता है, या बारकोडिंग और एक ही रन में एकाधिक नमूनों अनुक्रमण द्वारा । इसके अलावा, प्रवाह सेल के एक उपंयास प्रकार वर्तमान में किया जा रहा है बीटा-प्रयोगशालाओं की एक छोटी संख्या है, जो एक प्रवाह सेल अनुकूलक के उपयोग की आवश्यकता होगी द्वारा परीक्षण (कहा जाता है एक “flongle”), और काफी प्रवाह सेल मूल्य कम करना चाहिए और इस तरह की लागत चल रहा है ।
नैनोकोर अनुक्रमण की प्रमुख कमी अपनी सटीकता बनी हुई है, ८३ से ८६% की श्रेणी में एक पढ़ने की शुद्धता के साथ6,21,22की रिपोर्ट की जा रही है, और inaccuracies के अधिकांश प्रविष्टि/ indels)5,21। हालांकि, उच्च पढ़ा गहराई इन अशुद्धियों के लिए क्षतिपूर्ति कर सकते हैं, और एक ताजा अध्ययन सैद्धांतिक विचार के आधार पर सुझाव दिया कि > 10 की एक पढ़ने की गहराई समग्र सटीकता > 99.8%21वृद्धि हो सकती है । फिर भी, सटीकता में और सुधार की आवश्यकता होगी, विशेष रूप से यदि विश्लेषण एक अणु स्तर पर नहीं बल्कि एक आम सहमति अनुक्रम स्तर पर किया जाना है । इस प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में 1D2 प्रौद्योगिकी का उपयोग, जो 1 डी2 और बारकोड एडेप्टर (cf. धारा ५.५) के अलावा एक ही डीएनए अणु के दोनों किस्में में परिणाम एक ही नैनोकोर द्वारा sequenced किया जा रहा है के आधार पर है, बढ़ता पढ़ने सटीकता दोनों डीएनए किस्में से सूचना के बाद से अनुक्रम निर्धारण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इसके अलावा, एक workaround रणनीति है कि क्रम में अंय अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों के उच्च सटीकता के साथ नैनोपोर अनुक्रमण (विशेष रूप से लंबे समय से पढ़ने की लंबाई) के लाभ गठबंधन के लिए एक पाड़, जो है के रूप में नैनोकोर अनुक्रमण जानकारी का उपयोग करने के लिए पीछा किया जा सकता है तब अंय प्लेटफॉर्म्स6से sequencing डेटा का उपयोग करके पॉलिश ।
प्रोटोकॉल की सफलता के लिए सबसे महत्वपूर्ण कारक यहां प्रस्तुत नमूना गुणवत्ता, और विशेष रूप से राशि और निकाले गए शाही सेना की गुणवत्ता है । आरएनए का उचित भंडारण और शीघ्र निष्कर्षण एक पर्याप्त आरएनए उपज प्राप्त करने में मदद करते हैं । उपयुक्त रक्त संग्रह ट्यूबों के उपयोग के लिए एक महीने के लिए रक्त के नमूनों के भंडारण की अनुमति देता है, लेकिन रक्त के थक्के एक मुद्दा हो सकता है, विशेष रूप से जब नमूने ऊंचा तापमान है, जो क्षेत्र की स्थितियों के तहत मामला हो सकता है पर संग्रहीत किया जा रहा है । दूसरा महत्वपूर्ण कदम लक्ष्य अनुक्रम के प्रवर्धन है, और विशेष रूप से क्षेत्र की स्थिति के तहत पीसीआर प्रतिक्रियाओं अक्सर कम अच्छी तरह से मानक प्रयोगशाला की स्थिति7के तहत प्रदर्शन । इस उद्देश्य के लिए, सावधान प्राइमर डिजाइन और अनुकूलन मजबूत प्रवर्धन प्राप्त करने के लिए सर्वोपरि है । इसके अतिरिक्त, नेस्टेड पीसीआर दृष्टिकोण और टचडाउन पीसीआर, के रूप में इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया, दोनों विशिष्टता और लक्ष्य जीन प्रवर्धन4,7की संवेदनशीलता में वृद्धि कर सकते हैं । वास्तव में, इस प्रौद्योगिकी के साथ लाइबेरिया और गिनी में हमारे अनुभव में नेस्टेड प्रोटोकॉल क्षेत्र के नमूनों के साथ क्षेत्र की स्थिति के तहत भी प्राइमर सेट जो प्रयोगशाला के नमूनों से लक्ष्य के प्रवर्धन की अनुमति दी और प्रयोगशाला के साथ शर्तों के तहत आवश्यक थे पीसीआर के एक दौर (7 और अप्रकाशित परिणाम) ।
इन अधिक महत्वपूर्ण कदम के विपरीत, पुस्तकालय तैयारी और अनुक्रमण चलाने के बजाय मजबूत प्रक्रियाओं रहे हैं । हालांकि, क्षेत्र परिस्थितियों के तहत व्यावहारिक मुद्दों जैसे उपकरणों के कुछ टुकड़ों की उपलब्धता समस्याग्रस्त किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, एक यूवी स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के लिए डीएनए सांद्रता निर्धारित करने से पहले की जरूरत है पुस्तकालय barcoded नमूनों की तैयारी । हालांकि, इस तरह के एक उपकरण क्षेत्र की स्थिति के तहत उपलब्ध नहीं होना चाहिए, प्रत्येक नमूने का एक समान मात्रा बस को ४५ μl पुस्तकालय तैयारी के लिए आवश्यक बनाने के लिए संयुक्त किया जा सकता है, नमूना इनपुट सामग्री में मतभेदों के साथ तो आम तौर पर बड़े द्वारा शमन किया जा रहा reads की संख्या । इसी तरह, अनुक्रमण चलाने के लिए इंटरनेट कनेक्टिविटी की आवश्यकता एक मुद्दा हो सकता है, भले ही आधार-कॉलिंग अब ऑनलाइन प्रदर्शन किया है, लेकिन स्थानीय रूप से किया जा सकता है; हालांकि जरूरत पड़ने पर निर्माता द्वारा कुछ परिस्थितियों में इस अनिवार्यता को दूर किया जा सकता है ।
संक्षेप में, प्रस्तुत प्रोटोकॉल दूरदराज के स्थानों में सहित पारंपरिक अनुक्रमण उपकरण, के लिए कोई उपयोग के साथ स्थानों में अपेक्षाकृत कम लागत अनुक्रमण की अनुमति देता है. यह आसानी से किसी भी लक्ष्य आरएनए या डीएनए के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, इस प्रकार शोधकर्ताओं कई जैविक सवालों का जवाब देने के लिए अनुमति ।
The authors have nothing to disclose.
लेखकों पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए एलीसन Groseth धंयवाद । इस काम को आर्थिक रूप से जर्मन संघीय मंत्रालय के खाद्य और कृषि (BMEL) संघीय कृषि और खाद्य (BLE) के लिए कार्यालय के माध्यम से संघीय गणराज्य की संसद के एक निर्णय के आधार पर द्वारा समर्थित किया गया था ।
1D2 adapter, barcode adapter mix, ABB buffer, elution buffer, RBF buffer, LBB beads | Oxford Nanopore Technologies | SQK-LSK308 | 1D² Sequencing Kit |
blood collection tube with DNA/RNA stabilizing reagent | Zymo Research | R1150 | DNA/RNA Shield – Blood Collection Tube |
blunt/TA ligase master mix | New England Biolabs | M0367S | Blunt/TA Ligase Master Mix |
DNA-low binding reaction tube | Eppendorf | 30108051 | DNA LoBind Tube |
DNase buffer and DNase | ThermoFisher Scientific | 11766050 | SuperScript™ IV VILO™ Master Mix with ezDNase™ Enzyme |
flow cell | Oxford Nanopore Technologies | FLO-MIN105.24 | flow cell R9.4 |
hot start high fidelity DNA polymerase | New England Biolabs | M0493L | Q5 Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase (500 U) |
magnetic beads | Beckman Coulter | A63881 | Agencourt AMPure XP beads |
magnetic rack | ThermoFisher Scientific | 12321D | DynaMag-2 Magnet |
nanopore sequencing device | Oxford Nanopore Technologies | – | MinION Mk 1B |
PCR barcoding kit | Oxford Nanopore Technologies | EXP-PBC001 | PCR Barcoding Kit I (R9) |
reverse transcriptase master mix | ThermoFisher Scientific | 11766050 | SuperScript™ IV VILO™ Master Mix with ezDNase™ Enzyme |
RNA purification spin column, DNA/RNA prep buffer, DNA/RNA wash buffer, DNase I, DNA digestion buffer | Zymo Research | R1151 | Quick-DNA/RNA Blood Tube Kit |
rotating mixer | ThermoFisher Scientific | 15920D | HulaMixer Sample Mixer |
Taq DNA polymerase | New England Biolabs | M0287S | LongAmp Taq 2X Master Mix |
Ultra II End-prep kit | New England Biolabs | E7546S | NEBNext Ultra II End-Repair/dA-tailing Modul |
UV spectrophotometer | Implen | – | NanoPhotometer |
vacuum manifold | Zymo Research | S7000 | EZ-Vac Vacuum Manifold |