Nanopmalm sekvensering er en ny teknologi, der giver mulighed for omkostningseffektiv sekventering i fjerntliggende steder og ressourcefattige indstillinger. Her præsenterer vi en protokol til sekvensering af mRNAs fra fuldblod, der er kompatibel med sådanne betingelser.
Sekvensering i fjerntliggende steder og ressourcefattige indstillinger præsenterer unikke udfordringer. Nanopmalm sekvensering kan med held anvendes under sådanne forhold, og blev indsat i Vestafrika under den seneste Ebola virus epidemi, der fremhæver denne mulighed. Ud over de praktiske fordele (lave omkostninger, nem transport og brug af udstyr), giver denne teknologi også grundlæggende fordele i forhold til andengenerations sekvensering tilgange, især den meget lange læse længde, evne til direkte sekvens RNA og realtids tilgængelighed af data. Rå læse nøjagtighed er lavere end med andre sekvensering platforme, som repræsenterer den vigtigste begrænsning af denne teknologi; Dette kan dog delvist afbødes af den høje læse dybde, der genereres. Her præsenterer vi en felt kompatibel protokol til sekventering af mRNAs-kodning for Niemann-pick C1, som er den cellulære receptor for eboldaviruses. Denne protokol omfatter ekstraktion af RNA fra animalske blodprøver, efterfulgt af RT-PCR til målberigelse, barkodning, biblioteks forberedelse og sekvensering af selve køre, og kan let tilpasses til brug med andre DNA-eller RNA-mål.
Sekvensering er et kraftfuldt og vigtigt værktøj inden for biologisk og biomedicinsk forskning. Det giver mulighed for analyse af genomer, genetiske variationer, og RNA Expression profiler, og dermed spiller en vigtig rolle i undersøgelsen af menneske-og dyresygdomme både1,2. Sanger sekventering, en af de ældste metoder til rådighed for DNA sekventering, er stadig rutinemæssigt anvendes til denne dag og har været en hjørnesten af molekylær biologi. I løbet af de seneste 50 år er denne teknologi blevet forbedret for at opnå læse længder på mere end 1.000 NT og en nøjagtighed så høj som 99,999%1. Men sanger sekventering har også begrænsninger. Sekvensering et større sæt af prøver eller analysen af hele genomer med denne metode er tidskrævende og dyrt1,3. Anden generations (næste generations) DNA-sekvente Rings metoder som 454 pyrosekvensering og Illumina-teknologi har gjort det muligt for os at reducere de omkostninger og den arbejdsbyrde, der er nødvendig for sekventering i det seneste årti, betydeligt og har medført en enorm stigning i mængden af biologisk sekvensinformation til rådighed4. Ikke desto mindre er individuelle sekvensering kører ved hjælp af disse andengenerationsteknologier er dyrt, og sekvensering underfelt betingelser er udfordrende, da det nødvendige udstyr er voluminøse og skrøbelige (svarende til sanger sekventering enheder), og ofte er nødt til at kalibreres og serviceres af specialuddannet personale. Også for mange af de anden generations teknologier læse længder er temmelig begrænset, hvilket ofte gør downstream Bioinformatik analyse af disse data udfordrende.
Tredje generations sekvensering ved hjælp af nanopenheder i lommestørrelse (Se tabel over materialer) kan fungere som et alternativ til disse etablerede sekvensering platforme. I disse enheder passerer et enkeltstrenget DNA eller RNA-molekyle gennem en nanopmalm samtidig med en ionisk strøm, som derefter måles af en sensor (figur 1). Da strengen krydser nanopmalmen, detekteres moduleringen af de nukleotider, der er til stede i poren på et givent tidspunkt, og beregningsmæssigt tilbage-oversat til nucleostidsekvensen5. På grund af dette driftsprincip tillader nanopmalm sekvensering både generering af meget lange læsninger (tæt på 1 x 106 nukleotider6) og analyse af sekvensering data i realtid. Stregkodning er muligt ved at knytte definerede nukleotidsekvenser til nukleinsyrer i en prøve, hvilket gør det muligt at analysere flere prøver i en enkelt sekvensering, hvilket øger prøvehastigheden og sænker pr. stikprøve omkostningerne. På grund af deres høje bærbarhed og brugervenlighed er der blevet anvendt nanopudstyr med succes i marken under den seneste epidemi af Ebola virus i Vestafrika, hvilket understreger deres egnethed til hurtig indsættelse i fjerntliggende regioner7 , 8. den er
Her beskriver vi en detaljeret felt kompatibel protokol til sekventering af mRNA-kodning for Niemann-pick C1 (NPC1)-proteinet, som er den forpligte indgangs receptor til filovira såsom ebolsaviruser, og har vist sig at begrænse arter modtagelighed for disse vira9,10. Protokollen omfatter ekstraktion af hele RNA fra blodprøver, specifik forstærkning af NPC1 mRNA ved RT-PCR, barkodning af prøver, biblioteks forberedelse og sekvensering med en nanop-sekvente Rings anordning. Data analyse kan ikke diskuteres på grund af pladsbegrænsninger, selv om nogle grundlæggende retninger er fastsat i de repræsentative resultater; den interesserede læser henvises dog til en tidligere publikation11 for en mere detaljeret beskrivelse af den arbejdsgang, vi brugte, samt for publikationer fra andre12,13,14 for detaljerede oplysninger med hensyn til de analyseværktøjer, der bruges i denne arbejdsgang.
I løbet af de sidste to årtier er sekvensering af biologiske prøver blevet et stadigt vigtigere aspekt af undersøgelser inden for en lang række fagområder. Udviklingen af andengenerations sekvente Rings systemer baseret på sekvensering af en tæt vifte af DNA-funktioner ved hjælp af iterativ cyklusser af enzymatisk manipulation og billedbaseret dataindsamling1 har dramatisk øget gennemløb sammenlignet med traditionelle sanger sekventering teknik, og giver mulighed for analyse af flere prøver samt forskellige nukleinsyre arter i en given prøve i parallel4. Men for de fleste af de almindeligt anvendte andengenerations systemer, er kun korte læsninger produceret, og alle platforme er afhængige af følsom, voluminøse, og dyrt udstyr3,4.
I modsætning til andengenerations sekvente Rings platforme er den sekvente Rings anordning, der anvendes i denne protokol, baseret på nanopmalm teknologi. Her passerer et enkeltstrenget nukleinsyre molekyle gennem en nanopmalm, hvilket resulterer i modulation af en ionisk strøm, der også flyder gennem den samme nanopmalm, og som kan måles og tilbage-oversat for at udlede sekvensen af nukleinsyre molekylet. Denne tredje generations sekvente Rings tilgang indebærer en række fordele i forhold til andre tilgange. De vigtigste fordele, der er direkte relateret til det unikke Arbejdsprincip i denne teknologi er den ekstremt lange læse længde produceret (læse længder på op til 8,8 x 105 nukleotider er blevet rapporteret6), evnen til at sekvens ikke kun DNA, men også RNA direkte, som for nylig blev demonstreret for en komplet influenzavirus genom17, og evnen til at analysere data i realtid, som de bliver genereret, som giver mulighed for hurtig metagenomik påvisning af patogener inden for minutter18. Yderligere praktiske fordele er den ekstremt lille størrelse af nanopmalm sekventering enhed, tillader dens anvendelse i ethvert laboratorium eller på marken missioner til fjerntliggende steder19,20, og den lave pris i forhold til andre sekventering Platforme. Med hensyn til løbende omkostninger, der i øjeblikket en ny flowcelle er nødvendig for hver sekvensering køre, hvilket resulterer i omkostninger på omkring $1.100 per løb for flowcelle og bibliotek forberedelse reagenser. Disse omkostninger kan reduceres i nogle tilfælde ved at vaske og genbruge flowcellen, eller ved at barkodning og sekvensering flere prøver i en enkelt kørsel. Desuden er en ny type af flowcelle i øjeblikket bliver beta-testet af et lille antal laboratorier, som vil kræve brug af en flowcelle adapter (kaldet en “flongle”), og bør betydeligt reducere flowcelle pris og dermed driftsomkostninger.
Den største mangel ved nanopmalm sekvensering forbliver dens nøjagtighed, med en enkelt læse nøjagtighed i intervallet 83 til 86%, der rapporteres6,21,22, og de fleste af de unøjagtigheder, der forårsages af indsættelse/sletninger ( indels)5,21. Men, høj læse dybde kan kompensere for disse unøjagtigheder, og en nylig undersøgelse foreslået baseret på teoretiske overvejelser, at en læse dybde på > 10 kan øge den samlede nøjagtighed til > 99,8%21. Ikke desto mindre vil der være behov for yderligere forbedringer af nøjagtigheden, især hvis analysen skal udføres på et enkelt molekyleniveau i stedet for på et konsensus sekvens niveau. Brugen af 1D2 -teknologien som beskrevet i denne protokol, som er baseret på tilføjelsen af 1d2 -og stregkode adaptere (jf. afsnit 5,5), som resulterer i, at begge dele af et enkelt DNA-molekyle sekvenseres af samme nanopmalm, øger læse nøjagtighed, da oplysninger fra begge DNA-tråde kan anvendes til sekvens bestemmelse. Desuden er en løsningsstrategi, der kan forfølges med henblik på at kombinere fordelene ved nanopmalm sekvensering (særlig lang læse længde) med den højere nøjagtighed af andre sekvensering teknologier, at anvende oplysninger om nanopmalm sekvensering som et stillads, hvilket er derefter poleret ved hjælp af sekvensering data fra andre platforme6.
Den mest kritiske faktor for succesen af protokollen præsenteret her er prøve kvalitet, og især mængden og kvaliteten af det ekstraherede RNA. Korrekt opbevaring og hurtig ekstraktion af RNA hjælper med at opnå et passende RNA-udbytte. Brugen af passende blod opsamlings rør tillader opbevaring af blodprøver i op til en måned, men blodpropper kan være et problem, især når prøverne bliver opbevaret ved forhøjede temperaturer, hvilket kan være tilfældet underfelt betingelser. Det andet kritiske trin er amplificeringen af målsekvenser, og især underfelt betingelser fungerer PCR-reaktioner ofte mindre godt end under standard laboratoriebetingelser7. Til dette formål er omhyggelig primer design og optimering altafgørende for at opnå robust forstærkning. Desuden kan indlejrede PCR-tilgange og touchdown-PCR, som anvendes i denne protokol, øge både specificitet og følsomhed af Target-genamplifikation4,7. Faktisk, i vores erfaringer i Liberia og Guinea med denne teknologi indlejrede protokoller var påkrævet underfelt betingelser med feltprøver selv for primer sæt, som tillod forstærkning af mål fra laboratorieprøver og under laboratorieforhold med en enkelt runde af PCR (7 og ikke-udgivne resultater).
I modsætning til disse mere kritiske skridt, bibliotek forberedelse og sekvensering køre i sig selv er temmelig robuste procedurer. Men underfelt forhold kan praktiske spørgsmål såsom tilgængeligheden af visse dele af udstyret være problematiske. For eksempel er et UV-Spektrofotometer nødvendigt for at bestemme DNA-koncentrationerne forud for Biblioteks klargøring af barkodede prøver. Hvis en sådan anordning ikke er tilgængelig underfelt betingelser, kan en tilsvarende mængde af hver prøve ganske enkelt kombineres for at gøre op med den 45 μL, der kræves til Biblioteks tilberedning, idet forskelle i indlagringsmateriale derefter normalt afbødes af den store antal læsninger. På samme måde kan behovet for internetkonnektivitet for sekvensering køre være et problem, selv om grund-kald ikke længere skal udføres online, men kan gøres lokalt; dog, denne nødvendighed kan fjernes under visse omstændigheder af producenten, hvis det kræves.
Sammenfattende giver den præsenterede protokol mulighed for relativt lave omkostninger sekventering på steder uden adgang til traditionelle sekvente Rings udstyr, herunder i fjerntliggende steder. Det kan nemt tilpasses ethvert mål-RNA eller DNA, hvilket gør det muligt for forskerne at besvare talrige biologiske spørgsmål.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker Allison Groseth for kritisk læsning af manuskriptet. Dette arbejde blev støttet finansielt af det tyske Forbundsministerium for fødevarer og landbrug (BMEL) på grundlag af en afgørelse truffet af Forbundsrepublikken Tysklands parlament gennem forbundskontoret for landbrug og fødevarer (BLE).
1D2 adapter, barcode adapter mix, ABB buffer, elution buffer, RBF buffer, LBB beads | Oxford Nanopore Technologies | SQK-LSK308 | 1D² Sequencing Kit |
blood collection tube with DNA/RNA stabilizing reagent | Zymo Research | R1150 | DNA/RNA Shield – Blood Collection Tube |
blunt/TA ligase master mix | New England Biolabs | M0367S | Blunt/TA Ligase Master Mix |
DNA-low binding reaction tube | Eppendorf | 30108051 | DNA LoBind Tube |
DNase buffer and DNase | ThermoFisher Scientific | 11766050 | SuperScript™ IV VILO™ Master Mix with ezDNase™ Enzyme |
flow cell | Oxford Nanopore Technologies | FLO-MIN105.24 | flow cell R9.4 |
hot start high fidelity DNA polymerase | New England Biolabs | M0493L | Q5 Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase (500 U) |
magnetic beads | Beckman Coulter | A63881 | Agencourt AMPure XP beads |
magnetic rack | ThermoFisher Scientific | 12321D | DynaMag-2 Magnet |
nanopore sequencing device | Oxford Nanopore Technologies | – | MinION Mk 1B |
PCR barcoding kit | Oxford Nanopore Technologies | EXP-PBC001 | PCR Barcoding Kit I (R9) |
reverse transcriptase master mix | ThermoFisher Scientific | 11766050 | SuperScript™ IV VILO™ Master Mix with ezDNase™ Enzyme |
RNA purification spin column, DNA/RNA prep buffer, DNA/RNA wash buffer, DNase I, DNA digestion buffer | Zymo Research | R1151 | Quick-DNA/RNA Blood Tube Kit |
rotating mixer | ThermoFisher Scientific | 15920D | HulaMixer Sample Mixer |
Taq DNA polymerase | New England Biolabs | M0287S | LongAmp Taq 2X Master Mix |
Ultra II End-prep kit | New England Biolabs | E7546S | NEBNext Ultra II End-Repair/dA-tailing Modul |
UV spectrophotometer | Implen | – | NanoPhotometer |
vacuum manifold | Zymo Research | S7000 | EZ-Vac Vacuum Manifold |