Nanopore sekvensering är en ny teknik som möjliggör kostnads effektiv sekvensering i avlägsna platser och resurs fattiga inställningar. Här presenterar vi ett protokoll för sekvensering av mRNAs från helblod som är förenligt med sådana förhållanden.
Sekvensering i avlägsna platser och resurs fattiga inställningar innebär unika utmaningar. Nanopore sekvensering kan framgångs rikt användas under sådana förhållanden, och distribuerades till Västafrika under den senaste Ebola virusepidemin, belyser denna möjlighet. Förutom dess praktiska fördelar (låg kostnad, enkel utrustning transport och användning), ger denna teknik också grundläggande fördelar jämfört med andra generationens sekvenserings metoder, särskilt den mycket långa läslängd, förmåga att direkt sekvens Och i real tid till gång till data. RAW Läs noggrannhet är lägre än med andra sekvenseringsplattformar, som representerar den huvudsakliga begränsningen av denna teknik; Detta kan dock delvis mildras av den höga lästa djupet som genereras. Här presenterar vi ett fältkompatibelt protokoll för sekvensering av mRNAs-kodning för Niemann-Pick C1, som är den cellulära receptorn för Ebolavirus. Detta protokoll omfattar utvinning av RNA från djurblod prover, följt av RT-PCR för mål berikning, streckkoder, bibliotek beredning, och sekvensering köra själv, och kan enkelt anpassas för användning med andra DNA eller RNA mål.
Sekvensering är ett kraftfullt och viktigt verktyg i biologisk och biomedicinsk forskning. Det möjliggör analys av genom, genetiska variationer, och RNA uttrycks profiler, och därmed spelar en viktig roll i utredningen av människor och djur sjukdomar både1,2. Sanger sekvensering, en av de äldsta metoderna som finns för DNA-sekvensering, används fortfarande rutinmässigt i dag och har varit en hörnsten i molekylärbiologi. Under de senaste 50 åren har denna teknik förbättrats för att uppnå Läs längder på mer än 1 000 NT och en noggrannhet så hög som 99,999%1. Men Sanger sekvensering har också begränsningar. Sekvensering av en större uppsättning prover eller analys av hela genom med denna metod är tids krävande och dyra1,3. Andra generationens (nästa generations) DNA-sekvenseringsmetoder som 454 pyrosekvensering och Illumina-teknik har gjort det möjligt för oss att avsevärt minska den kostnad och arbets börda som krävs för sekvensering under det senaste årtiondet, och har lett till en enorm ökning av mängd biologisk sekvensinformation tillgänglig4. Ändå, individuell sekvensering körs med hjälp av dessa andra generationens teknik är dyra, och sekvensering under fält förhållanden är utmanande, eftersom den nödvändiga utrustningen är skrymmande och bräcklig (liknande Sanger sekvensering enheter), och ofta måste kalibreras och servas av specialutbildad personal. Också, för många av andra generationens teknik Läs längder är ganska begränsad, vilket ofta gör nedströms bioinformatik analys av dessa data utmanande.
Tredje generationens sekvensering med hjälp av fickformat nanopore sekvenserings enheter (se material tabell) kan fungera som ett alternativ till dessa etablerade sekvenseringsplattformar. I dessa enheter passerar en enkelsträngad DNA-eller RNA-molekyl genom en nanopore samtidigt med en jonisk ström som sedan mäts med en sensor (figur 1). Som stranda korsar nanopore, detekteras moduleringen av strömmen vid nukleotider gåvan i pore på en given tid, och beräknings mässigt tillbaka-översatt in i nukleotid ordnar5. På grund av denna operativa princip, nanopore sekvensering tillåter både generering av mycket långa läsningar (nära 1 x 106 nukleotider6) och analys av sekvensering data i real tid. Barcoding är möjligt genom att fästa definierade nukleotidsekvenser till nukleinsyror i ett prov, vilket möjliggör analys av flera prover i en enda sekvenserings körning, vilket ökar prov genom strömningen och sänker per prov kostnader. På grund av deras höga bärbarhet och användar vänlighet, har nanopore sekvenserings anordningar använts framgångs rikt på fältet under den senaste tidens Ebola virus sjukdom epidemi i Västafrika, lyfta fram deras lämplighet för snabb utbyggnad i avlägsna regioner7 , och 8.
Här beskriver vi ett detaljerat fältkompatibelt protokoll för sekvensering av mRNA-kodning för Niemann-Pick C1 (NPC1)-proteinet, som är den obligat inträdes receptorn för filovirus såsom Ebolavirus, och har visats begränsa artens känslighet för dessa virus9,10. Protokollet omfattar extraktion av hela RNA från blodprover, specifik förstärkning av NPC1 mRNA av RT-PCR, streckkoder av prover, förberedelse av biblioteket och sekvensering med en nanopore sekvenseringsenhet. Data analys kan inte diskuteras på grund av utrymmes begränsningar, även om vissa grundläggande riktningar finns i representativa resultat; den intresserade läsaren hänvisas dock till en tidigare publikation11 för en mer detaljerad beskrivning av det arbets flöde vi använt, samt till publikationer av andra12,13,14 för detaljerad information analys verktygen som används i detta arbets flöde.
Under de senaste två decennierna har sekvensering av biologiska prover blivit en allt viktigare aspekt av studier inom ett brett spektrum av ämnes områden. Utvecklingen av andra generationens sekvenserings system baserade på sekvensering av ett tätt spektrum av DNA-funktioner med hjälp av iterativa cykler av enzymatisk manipulation och bildbaserad data insamling1 har dramatiskt ökat genomflöde jämfört med traditionella Sanger sekvenserings teknik, och möjliggör analys av flera prover samt olika nukleinsyraarter i ett givet prov i parallell4. Men för de flesta av de vanligaste andra generationens system, endast korta läsningar produceras, och alla plattformar förlitar sig på känslig, skrymmande och dyr utrustning3,4.
I motsats till andra generationens sekvenseringsplattformar baseras sekvenseringsenheten som används i detta protokoll på nanopore-teknik. Här passerar en enkelsträngad nukleinsyra molekyl genom en nanopore, vilket resulterar i modulering av en jonisk ström som också flyter genom samma nanopore, och som kan mätas och tillbaka-översatt att härleda sekvensen av nukleinsyra molekylen. Denna tredje generationens sekvenserings metod förmedlar ett antal fördelar jämfört med andra metoder. De främsta fördelarna som är direkt relaterade till den unika arbets principen för denna teknik är den extremt långa läslängd som produceras (Läs längder upp till 8,8 x 105 nukleotider har rapporter ATS6), förmågan att SEKVENERA inte bara DNA utan också RNA direkt, som nyligen visades för ett komplett influensa virus genom17, och förmågan att analysera data i real tid som de genereras, vilket möjliggör snabb metagenomik detektion av patogener inom minuter18. Ytterligare praktiska fördelar är den extremt lilla storleken på nanopore sekvenserings anordningen, vilket gör att den kan användas i alla laboratorier eller på fält uppdrag till avlägsna platser19,20, och det låga priset i jämförelse med andra sekvensering Plattformar. När det gäller drifts kostnader, för närvarande en ny flöde cell krävs för varje sekvenserings körning, vilket resulterar i kostnader på cirka $1 100 per körning för flödet cell och bibliotek förberedelse reagenser. Dessa kostnader kan i vissa fall reduceras genom tvättning och åter användning av flödes cellen, eller genom att streckkoder och sekvensering av flera prover i en enda körning. Dessutom är en ny typ av flöde cell för närvarande beta-testad av ett litet antal laboratorier, som kommer att kräva användning av ett flöde cell adapter (kallas en “flongle”), och bör avsevärt minska flödet cell pris och därmed löpande kostnader.
Den stora bristen av nanopore sekvensering förblir dess noggrannhet, med enda Läs noggrannhet i intervallet 83 till 86% rapporteras6,21,22, och de flesta av de felaktigheter som orsakas av införande/borttagningar ( indels)5,21. Högt läsdjup kan dock kompensera för dessa felaktigheter, och en nyligen genomförda studie föreslog utifrån teoretiska överväganden att ett Läs djup på > 10 kan öka den totala noggrannheten till > 99,8%21. Det kommer dock att behövas ytterligare förbättringar av noggrannheten, särskilt om analysen ska utföras på en enda molekyl nivå snarare än på en konsensus-sekvensnivå. Användningen av 1D2 -teknik som beskrivs i detta protokoll, som bygger på tillsats av 1d2 och streckkod adaptrar (jfr avsnitt 5,5) som resulterar i båda delarna av en enda DNA-molekyl som sekvenseras av samma nanopore, ökar läsa noggrannhet eftersom information från båda DNA-strängarna kan användas för sekvensbestämning. Ytterligare, en lösning strategi som kan eftersträvas för att kombinera fördelarna med nanopore sekvensering (särskilt lång Läs längd) med högre noggrannhet av andra sekvenserings teknik är att använda nanopore sekvensering information som en byggnads ställning, vilket är sedan poleras med sekvenserings data från andra plattformar6.
Den mest kritiska faktorn för framgången med det protokoll som presenteras här är prov kvalitet, och särskilt mängden och kvaliteten på det extraherade RNA. Korrekt förvaring och snabb utvinning av RNA hjälp att uppnå en adekvat RNA avkastning. Användning av lämpliga blod uppsamlings rör tillåter lagring av blodprover för upp till en månad, men blodkoagulering kan vara ett problem, särskilt när proverna lagras vid förhöjda temperaturer, vilket kan vara fallet under fält förhållanden. Det andra kritiska steget är amplifiering av målsekvenser, och särskilt under fält förhållanden PCR reaktioner ofta utföra mindre bra än under normala laboratorie förhållanden7. För detta ändamål är noggrann primer design och optimering avgörande för att uppnå robust förstärkning. Dessutom kan kapslade PCR-metoder och touchdown PCR, som används i detta protokoll, öka både specificitet och känslighet för målgenamplifiering4,7. I vår erfarenhet i Liberia och Guinea med denna teknik, var det nödvändigt med kapslade protokoll under fält förhållanden med fältprover även för primersatser som tillät förstärkning av mål från laboratorieprover och under laboratorie förhållanden med en enda omgång PCR (7 och opublicerade resultat).
I kontrast till dessa mer kritiska kliver, är Arkiv förberedelsen och sekvenserings körningen sig själv ganska robusta tillvägagångs sätt. Men under fält förhållanden kan praktiska frågor som till gång till vissa delar av utrustningen vara problematiska. Till exempel behövs en UV-spektrofotometer för att bestämma DNA-koncentrationer före bibliotekets beredning av streckkodade prover. Om en sådan anordning inte är tillgänglig under fält förhållanden, kan dock en lika stor volym av varje prov enkelt kombineras för att kompensera för de 45 μL som krävs för att förbereda biblioteket, med skillnader i prov ingångs material som vanligt vis mildras av den stora antal läsningar. På samma sätt kan behovet av Internet anslutning för sekvenserings körningen vara ett problem, även om bas anropande inte längre måste utföras online men kan göras lokalt. emellertid, denna nödvändighet kan avlägsnas under vissa omständigheter av tillverkaren om det behövs.
Sammanfattnings vis tillåter det presenterade protokollet relativt låg kostnads sekvensering på platser utan till gång till traditionell sekvenserings utrustning, inklusive i avlägsna platser. Det kan lätt anpassas till alla mål-RNA eller DNA, vilket gör det möjligt för forskare att besvara många biologiska frågor.
The authors have nothing to disclose.
Författarna tackar Allison Groseth för kritisk läsning av manuskriptet. Detta arbete stöddes ekonomiskt av det tyska federala ministeriet för livsmedel och jordbruk (BMEL) baserat på ett beslut av parlamentet i Förbundsrepubliken Tyskland genom det federala kontoret för jordbruk och livsmedel (BLE).
1D2 adapter, barcode adapter mix, ABB buffer, elution buffer, RBF buffer, LBB beads | Oxford Nanopore Technologies | SQK-LSK308 | 1D² Sequencing Kit |
blood collection tube with DNA/RNA stabilizing reagent | Zymo Research | R1150 | DNA/RNA Shield – Blood Collection Tube |
blunt/TA ligase master mix | New England Biolabs | M0367S | Blunt/TA Ligase Master Mix |
DNA-low binding reaction tube | Eppendorf | 30108051 | DNA LoBind Tube |
DNase buffer and DNase | ThermoFisher Scientific | 11766050 | SuperScript™ IV VILO™ Master Mix with ezDNase™ Enzyme |
flow cell | Oxford Nanopore Technologies | FLO-MIN105.24 | flow cell R9.4 |
hot start high fidelity DNA polymerase | New England Biolabs | M0493L | Q5 Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase (500 U) |
magnetic beads | Beckman Coulter | A63881 | Agencourt AMPure XP beads |
magnetic rack | ThermoFisher Scientific | 12321D | DynaMag-2 Magnet |
nanopore sequencing device | Oxford Nanopore Technologies | – | MinION Mk 1B |
PCR barcoding kit | Oxford Nanopore Technologies | EXP-PBC001 | PCR Barcoding Kit I (R9) |
reverse transcriptase master mix | ThermoFisher Scientific | 11766050 | SuperScript™ IV VILO™ Master Mix with ezDNase™ Enzyme |
RNA purification spin column, DNA/RNA prep buffer, DNA/RNA wash buffer, DNase I, DNA digestion buffer | Zymo Research | R1151 | Quick-DNA/RNA Blood Tube Kit |
rotating mixer | ThermoFisher Scientific | 15920D | HulaMixer Sample Mixer |
Taq DNA polymerase | New England Biolabs | M0287S | LongAmp Taq 2X Master Mix |
Ultra II End-prep kit | New England Biolabs | E7546S | NEBNext Ultra II End-Repair/dA-tailing Modul |
UV spectrophotometer | Implen | – | NanoPhotometer |
vacuum manifold | Zymo Research | S7000 | EZ-Vac Vacuum Manifold |