Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

الهياكل على المستوى الجزيئي بين الوجهين من البوليمرات والجزيئات الحيوية التي تم الكشف عنها عن طريق التحليل الطيفي الاهتزازي لجيل التردد الكلي

Published: August 13, 2019 doi: 10.3791/59380
Automatic Translation
1, 1, 1
1State Key Laboratory of Bioelectronics, School of Biological Science & Medical Engineering, Southeast University

Summary

يجري استخدامها بشكل شامل، مجموع توليد تردد (SFG) التحليل الطيفي الاهتزازي يمكن أن تساعد على الكشف عن سلسلة الترتيب المطابقة والتغيير الهيكلي الثانوي يحدث في البوليمر وواجهات جزيء الحيوي.

Abstract

كمطياف بصري غير خطي من الدرجة الثانية، تم استخدام التحليل الطيفي الاهتزازي لتوليد التردد (SFG) على نطاق واسع في التحقيق في مختلف الأسطح والواجهات. هذه التقنية البصرية غير الغازية يمكن أن توفر المعلومات المحلية على المستوى الجزيئي مع حساسية أحادية الطبقة أو دون طبقة أحادية. نحن هنا نقدم منهجية تجريبية حول كيفية الكشف بشكل انتقائي عن واجهة مدفونة لكل من الجزيئات الكبيرة والجزيئات الحيوية. مع أخذ هذا في الاعتبار، تتم مناقشة الهياكل الثانوية بين الوجهين من الليفية الحريرية وهياكل المياه حول نموذج قصير السلسلة oligonucleotide دوبلكس. الأول يظهر تداخل سلسلة سلسلة أو تأثير الحبس المكاني والثانية يظهر وظيفة الحماية ضد أيونات Ca2 + الناتجة عن البنية الفوقية للعمود الفقري الزقزقة من الماء.

Introduction

تطوير مجموع توليد تردد (SFG) مطيافية الاهتزاز يمكن أن يعود تاريخها إلى العمل الذي قام به شين وآخرون قبل ثلاثين عاما1،2. إن تفرد الانتقائية البينية وحساسية الطبقة دون أحادية اللون يجعل التحليل الطيفي الاهتزازي SFG يحظى بتقدير عدد كبير من الباحثين في مجالات الفيزياء والكيمياء والبيولوجيا وعلوم المواد، الخ3و4 ،5. حاليا، يتم التحقيق في مجموعة واسعة من القضايا العلمية المتعلقة الأسطح والواجهات باستخدام SFG، وخاصة بالنسبة للواجهات المعقدة فيما يتعلق البوليمرات والجزيئات الحيوية، مثل هياكل السلسلة والاسترخاء الهيكلي في دفن واجهات البوليمر، والهياكل الثانوية البروتين، وهياكلالمياه بين الوجهين 9،10،11،12،13،14، 15,16,17,18,19,20,21,22,23, 24،25،26.

لأسطح البوليمر والواجهات، يتم إعداد عينات رقيقة من الافلام عموما عن طريق الطلاء تدور للحصول على الأسطح أو الواجهات المطلوبة. المشكلة تنشأ بسبب تداخل الإشارة من الواجهات اثنين من الأفلام كما أعدت، مما يؤدي إلى إزعاج لتحليل الأطياف SFG جمع27،28،29. في معظم الحالات، إشارة الاهتزاز فقط من واجهة واحدة، إما فيلم / الركيزة أو فيلم / وسيلة أخرى، هو مرغوب فيه. في الواقع، فإن حل هذه المشكلة من السهل جدا، وهي، لتحقيق أقصى قدر تجريبيا من حقول الضوء في واجهة مرغوب فيه وتقليل حقول الضوء في واجهة أخرى. وبالتالي، فإن معاملات فريسنل أو معاملات الحقل المحلي تحتاج إلى أن تحسب من خلال نموذجالافلام الرقيقة وللتحقق من صحتها فيما يتعلق بالنتائج التجريبية 3،9،10،11، 12،13،14،15،30.

ومع أخذ الخلفية المذكورة أعلاه في الاعتبار، يمكن التحقيق في بعض الواجهات البوليمرية والبيولوجية من أجل فهم العلوم الأساسية من المستوى الجزيئي. في ما يلي، مع أخذ ثلاث قضايا بين الوجهين على سبيل المثال: التحقيق بولي (2-هيدروكسي إيثيلميثاكريلات) (PHEMA) السطح وواجهة مدفونة مع الركيزة 9، وتشكيل الهياكل الثانوية الليفية الحرير (SF) على سطح البوليسترين (PS) و هياكل المياه المحيطة نموذج قصيرة السلسلة oligonucleotide دوبلكس16،21، وسوف نعرض كيف أن مطياف SFG الاهتزازي يساعد على الكشف عن هياكل المستوى الجزيئي بين الوجه فيما يتعلق بالعلوم الأساسية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. SFG التجريبية

  1. استخدام نظام بييكونثانية SFG التجارية (جدولالمواد)،والذي يوفر شعاع 1064 نانومتر الأساسية مع عرض نبض من ~ 20 PS وتردد 50 هرتز، استنادا إلى ليزر Nd:YAG.
  2. تحويل الأساسية 1064 نانومتر شعاع في شعاع 532 نانومتر وشعاع 355 نانومتر باستخدام وحدات التوافقية الثانية والثالثة. توجيه شعاع 532 نانومتر مباشرة كشعاع ضوء الإدخال وتوليد المدخلات الأخرى منتصف الأشعة تحت الحمراء (IR) شعاع تغطي نطاق التردد من 1000 إلى 4000 سم-1 من خلال توليد البارامترية البصرية (OPG) / التضخيم البصري البارامتري (OPA)/ عملية توليد تردد الفرق (DFG).
  3. تعيين زوايا الحادث من اثنين من الحزم الإدخال لتكون 53 درجة (الأشعة تحت الحمراء) و 64 درجة (مرئية)، على التوالي، مقابل سطح عادي.
  4. للكشف عن هياكل البوليمر بين الوجه (إما واجهة الفيلم / الركيزة أو الفيلم / واجهة متوسطة أخرى)، واستخدام ssp (ق الاستقطاب شعاع تردد مجموع، ق الاستقطاب شعاع مرئي وP-الاستقطاب شعاع الأشعة تحت الحمراء) وتركيبات الاستقطاب PPP.
  5. للكشف عن الهياكل الثانوية البروتين بين الوجهين والهياكل المائية المحيطة الحمض النووي، إلى جانب Ssp وPPP، تم استخدام spp chiral وPSP تركيبات الاستقطاب.
  6. لضمان عدم تلف العينات، السيطرة على الأشعة تحت الحمراء وطاقات النبض المرئية لتكون ~ 70 و ~ 30 mJ، على التوالي. تم عرض مخطط لعملية SFG مع الرسم التخطيطي لمستوى الطاقة في الشكل 1. ويبين الشكل 2 نظام SFG في غرفتنا النظيفة.

2. معاملات فريسنل

  1. استخدم المنشور بالزاوية اليمنى كركائز لجميع التجارب التي تمت مناقشتها هنا. هناك اثنين من الواجهات لفيلم البوليمر على الركيزة الصلبة، أي سطح البوليمر في الهواء والبوليمر / واجهة الركيزة. كلاهما يمكن أن تولد إشارات SFG منذ يتم كسر التماثل انعكاس في كلا الواجهات. ولذلك، فإن طيف SFG الذي تم جمعه هو طيف متدخل. ومع ذلك، فإن معاملات الحقل المحلي أو معاملات Fresnel في الواجهات اثنين يمكن أن تكون قابلة للتعديل عن طريق تغيير زوايا الحادث أو سمك الفيلم واحد في وقت واحد أو في وقت واحد31،32. وهذا يوفر الفرصة لنا للتحقيق في إشارة الاهتزاز SFG من واجهة واحدة فقط. هنا، تم أخذ فيلم PHEMA على المنشور CaF2 كمثال9.
  2. كما هو موضح في الشكل3، استخدم هندسة المنشور الزاوية اليمنى للكشف عن إشارات SFG المتولدة من فيلم PHEMA السفلي. يتم التعبير عن كثافة الناتج SFG في وضع ينعكس كما
    Equation 1(1)
    حيث Equation 2 يشير إلى شد الحساسية غير الخطية الفعالة من الدرجة الثانية.
    Equation 2يتكون من ثلاثة أجزاء، وهي واجهة المنشور /البوليمر، والواجهة المتوسطة البوليمر/القاع (متوسط أسفل يشمل الغاز، السائل أو الصلبة.) والخلفية غير الرنانة، كما هو مبين في المعادلة التالية.
    Equation 3(2)
    هنا يمكن أن يكون متوسط أسفل الهواء والماء أو أي شيء آخر. يمثل F معامل فريسنل المقابل المسؤول عن تصحيح الحقل المحلي.
  3. تطبيق نموذج رقيقة الفيلم لحساب معاملات فريسنل في هذه الحالة. هنا فقط قصيرة حساب قدّمت إجراءات.
    1. لواجهة المنشور / البوليمر، واستخدام
      Equation 4(3)
      Equation 5(4)
      Equation 6(5)
      ويرد أدناه معنى كل معلمة مبينة.
      1. ωi يدل على تردد شعاع.
      2. tp و ts تدل على معاملات الإرسال الإجمالية ويمكن التعبير عنها على أنها
        Equation 7(6)
        Equation 8(7)
      3. tp12 و ts12 يشيرإلى معاملات الإرسال الخطي للشعاع الضوئي في واجهة المنشور/البوليمر.
      4. rp23 و rs23 يشيران إلى معاملات انعكاس خطية لشعاع الضوء في الواجهة البوليمرية/المتوسطة.
      5. α يمثل الفرق المرحلة بين شعاع عاكس وشعاع عاكس الثانوية بعد أن ينتشر عبر البوليمر رقيقة الفيلم ومن ثم يعكس مرة أخرى، والتي يمكن التعبير عنها كما
        Equation 9(8)
      6. يمثل الطول الموجي للشعاع الضوئي وd هو سمك فيلم البوليمر.
      7. Φ1 وΦ 2 تمثل زوايا الحادث في واجهة المنشور / البوليمر والبوليمر / واجهة متوسطة على التوالي.
      8. ن1 و ن2 تمثل مؤشرات الانكسار من المنشور والبوليمر الفيلم على التوالي.
      9. n12 يمثل المؤشرات الانكسارية للطبقات البوليمرية بين الوجهين للمنشور/ البوليمر.
    2. للبوليمر / واجهة متوسطة، واستخدام
      Equation 10(9)
      Equation 11(10)
      Equation 12(11)
      1. يمثل Δ الفرق المرحلة من الحقول الكهربائية الخفيفة في اثنين من الواجهات.
      2. نظرًا لأن عرض النبض لعوارض الإدخال لدينا هو ~20 رطل، يمكن إهمال الخطأ من تأخير الوقت المرتبط بتأثير التشتت.
      3. التعبير عن هذا الفرق المرحلة للإخراج SFG، يمكن كتابة المدخلات المرئية والحزم الأشعة تحت الحمراء المدخلات بشكل منفصل كما
        Equation 13(12)
        Equation 14(13)
        Equation 15(14)
         
  4. من المناقشة أعلاه، لنظام المنشور البوليمر فيلم المتوسطة (1-2-3)، والتعبير عن مجموع معاملات فريسنل للالمنشور / البوليمر والبوليمر / واجهات متوسطة كما المعادلات التالية، لSSP وPPP مجموعات الاستقطاب . وبطبيعة الحال، تعتبر كل من الواجهات السمتية متساوي ة.
    1. بالنسبة لواجهة المنشور/البوليمر، يتم عرض تعبيرات معاملات الفريسنل الإجمالية لكل من تركيبات الاستقطاب Ssp وPPP على النحو التالي.
      1. بالنسبة لـ ssp، فإن المعادلة هي
        Equation 16(15)
      2. وبالنسبة لـ PPP، فإن المعادلة
        Equation 5(16)
        Equation 5(17)
        Equation 5(18)
        Equation 5(19)
         
      3. t10 و t01 يشيران إلى معاملات الإرسال الخطية في الهواء/المنشور والمنشور/الهواء على التوالي.
    2. بالنسبة للواجهة البوليمرية/المتوسطة، يتم وصف تعبيرات معاملات الفريسنل الإجمالية لكل من تركيبات الاستقطاب Ssp وPPP على النحو التالي.
      1. بالنسبة لـ ssp، فإن المعادلة هي
        Equation 21(20)
      2. بالنسبة لـ PPP، تكون المعادلات
        Equation 5(21)
        Equation 5(22)
        Equation 5(23)
        Equation 5(24)
           
         
  5. بعد حساب معاملات فريسنل باستخدام النموذج الساندويتشي، رسمها كدالة لسمك الفيلم، كما هو موضح في الشكل 4.
    ملاحظة: في هذه الحالة، هناك نطاق سمك لجمع إشارة SFG من CaF2 المنشور / PHEMA واجهة مع مساهمة مهملة من واجهة أخرى، وهو حوالي 150 نانومتر. وبالمثل، يمكن اختيار سمك مناسب للكشف عن واجهة PHEMA/أسفل المتوسطة مع مساهمة مهملة من CaF2 المنشور / PHEMA واجهة.

3. Cهيرال SFG مزيج الاستقطاب

  1. للواجهة achiral العادية، عادة، استخدم C-v التماثل من حيث متوسط الفرقة33،34. مع عملية التماثل انعكاس، يمكن استنتاج غير صفري من الدرجة الثانية غير الخطية حساسية الشد المكونات، والتي هي جxxz،جxzx،جzxx،جyyz،جyzy،جزي و جzzz (و يمكن تقليل المصطلحات الموجودة بشكل أكبر إذا تم افتراض وجود واجهة متساوية، مما يعني أن x وy متشابهان). ومع ذلك، بالنسبة للواجهة chiral، فإن الوضع سيكون مختلفا. واجهة تشيرال تمتلك التماثل C، يسمح فقط عملية التماثل دوران. في هذه الحالة، إلى جانب المصطلحات الشيرال العادية، فإن أكثر من الدرجة الثانية غير الخطية حساسية تكون غير صفرية، والتي يمكن أن تسمى المصطلحات chiral، وهي جzyx،جzxy و cyzx تحت النظر في غير الإلكترونية صدي. لذلك، باستخدام PSP، PPS وتركيبات الاستقطاب SPP، يمكن جمع الأطياف SFG chiral33،34.

4. إعداد عينة

  1. إعداد فيلم PHEMA
    1. حل مسحوق PHEMA (انظر جدولالمواد) في الإيثانول اللامائية لإعداد الحل مع 2 الوزن٪ و 4 الوزن٪ على التوالي.
    2. قبل ترسب أفلام PHEMA، نقع CaF2 المنشور الزاوية اليمنى في المذيبات التولوين أولا ثم غسلها مع الإيثانول والماء النقي جدا (18.2 MΩ·cm).
    3. بعد ذلك، قم بتعريض الركائز (CaF2 المنشور بالزاوية اليمنى) لبلازما الأكسجين لإزالة الملوثات العضوية المحتملة بواسطة منظف البلازما (انظر جدولالمواد).
      1. تشغيل أولا على منظف البلازما ووضع الركائز في ذلك.
      2. ثم تشغيل مضخة فراغ لفراغ المكنسة. إدخال الأكسجين في ذلك.
      3. وأخيرا تعيين 4 دقائق للتنظيف. بعد ذلك، الحفاظ على ركائز نظيفة لإعداد الفيلم PHEMA متتابعة.
      4. ثم إعداد الأفلام PHEMA على المنشور CaF2 من قبل معطف تدور (انظر جدول المواد). ضبط سمك الفيلم من قبل تركيز الحل وسرعة الدوران.
        1. تعطيل المنشور CaF2 على قرص مص من تدور المغطي.
        2. إسقاط قطرة واحدة من محلول PHEMA أعدت من قبل على ركائز نظيفة في 1500 دورة في الدقيقة لمدة 1 دقيقة (سمك الفيلم 2 wt٪ ل 100 نانومتر و 4 wt٪ ل 200 نانومتر).
      5. أنيال جميع الأفلام PHEMA أعدت في فرن فراغ في 80 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
  2. إعداد الليفية الحريرية (SF)
    ملاحظة: اعتُمد البروتوكول الذي اقترحه كابلان وآخرون35.
    1. ضع 7.5 غرام من شرنقة الحرير من B. موري في كربونات الصوديوم الغليان (Na2CO3,0.02 M) محلول مائي (3 لتر) لمدة 30 دقيقة.
    2. اغسل SF الليفي الذي تم الحصول عليه بالماء منزوع الأيونات ثلاث مرات تحت التحريك من أجل إزالة جزيئات السيريسين وترك جزيئات SF فقط في العينة الليفية.
    3. جفّف عينة SF الليفية في فرن فراغ عند 60 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
    4. بعد ذلك، حل عينة SF الليفية degummed في بروميد الليثيوم (LiBr، 9.3 M) حل مائي (1 غرام من SF تم حلها في ~ 4 مل من محلول LiBr.) وحضانة في 60 درجة مئوية لمدة 2 ساعة تحت التحريك.
    5. دياليب الحل SF ضد الماء منزوع الأيونات (3500 أكياس غسيل الكلى دا) لمدة 3 أيام لإزالة LiBr المذاب. تغيير المياه منزوعة الأيونات الجديدة ثلاث مرات كل يوم. وأخيرا تخزين الحل SF معالجتها في 4 درجة مئوية لتجارب SFG في وقت لاحق.
  3. إعداد سلسلة قصيرة oligonucleotide دوبلكس
    1. طلب عينة oligonucleotide التي تقطعت بها السبل واحدة مع 3'-نهاية المعدلة من الكوليسترول ثلاثي الإيثيلين غليكول (تشول-TEG) (5 '-GCTTCCGAAGGTCGA-3') من شركة تجارية (انظر جدولالمواد) وكذلك واحدة تكميلية. لكل حبلا واحد، حل 10 نمول من مسحوق عينة في 0.5 مل من الماء النقي جدا. ثم مزجها معا لتشكيل حل oligonucleotide دوبلكس (10 نمول / مل).
    2. مزيج 2 ملغ من 1,2-ديبالميتويل-سن-غليسيرو-3-فوسفوليوكولين (DPPC) و 2 ملغ من DPPC deuterated (د-DPPC) وحلها في 1 مل من الكلوروفورم لإعداد محلول الدهون.
    3. إعداد طبقة أحادية من DPPC وd-DPPC بواسطة حوض لانغموير -Blodgett (LB)
      1. قم بإرفاق المنشور CaF2 بالزاوية اليمنى إلى حامل عينة محلي الصنع مع وجه منشور واحد مغموس عمودياً في البيئة المائية لحوض LB.
      2. بعد ذلك، حقن محلول الدهون المختلطة التي أعدت قبل على سطح الماء حتى وصل الضغط السطحي قيمة معينة أقل من 34 mN·m−1.
      3. بعد إيقاف مستويات الضغط السطحي، استخدم حاجزين تفلون لضغط الطبقة الأحادية للدهون بنسبة 5 مم/دقيقة حتى يتم التوصل إلى ضغط سطحي قدره 34 منوم·م−1.
      4. رفع المنشور مع أحادية الدهون من الماء بمعدل 1 ملم / دقيقة عموديا.
    4. إعداد أحادية الدهون الأخرى
      1. لتسهيل تجميع oligonucleotide دوبلكس وجزيئات الدهون عن طريق التفاعل الكاره للماء (الكولسترول وسلسلة الألكيل الدهون)، وخلط حل oligonucleotide دوبلكس مع محلول الدهون في نسبة الأضراس من 1:100 (oligonucleotide إلى الدهون).
      2. حقن الدهون المختلطة ومحلول oligonucleotide دوبلكس على سطح الماء في حاوية تفلون محلية الصنع حتى تم التوصل إلى ضغط سطح 34 mN·m−1.
    5. وأخيرا، وضع أحادية الدهون في الجزء السفلي من المنشور في اتصال مع أحادية الدهون مع oligonucleotides دوبلكس إدراجها على سطح الماء لتشكيل العينة النهائية لقياس SFG.
  4. [لورنتز] معادلة
    1. استخدم معادلة Lorentz لتناسب أطياف SFG لاستخراج المعلومات الاهتزازية لوضع اهتزازي معين.
      Equation 26(25)
      حيث Equation 27 يمثل كثافة وضع الاهتزاز qth، Equation 28 يمثل تردد Equation 29 رنانة، يدل على عرض نصف Equation 30 في نصف الحد الأقصى (HWHM) ويمثل تردد المسح الضوئي من شعاع الأشعة تحت الحمراء الحادث.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

وفي الجزء المتعلق بمعامل فريسنل من قسم المراسم، أظهرنا أنه من الممكن نظرياً الكشف بصورة انتقائية عن واجهة واحدة فقط في وقت واحد. هنا، تجريبيا، أكدنا أن هذه المنهجية صحيحة أساسا، كما هو مبين في الشكل 5 والشكل 6.

يظهر الشكل 5 هيكل PHEMA المدفون بين الوجهين بعد تسرب المياه مع فيلم هيدروجيل PHEMA 150 نانومتر والشكل 6 يظهر الهيكل السطحي في الماء مع فيلم هيدروجيل PHEMA 430 نانومتر~ . وتتوافق اللوحتان ألف وباء مع النطاقين CH وCO على التوالي لكلا الرقمين. في واجهة مدفونة، جميع القمم الاهتزازية التي لوحظت حادة وواضحة. والسبب هو أن الركيزة CaF2 على نحو سلس ولا يمكن اختراقها من قبل جزيئات PHEMA، مما يؤدي إلى واجهة CaF2/PHEMA حادة. ومع ذلك، على السطح، لأن جزيئات الماء يمكن أن تتفاعل مع PHEMA وتنتشر في الجزء الأكبر، فإن واجهة PHEMA / المياه ليست حادة مثل واحد دفن. ولذلك، لوحظت ملامح طيفية مختلفة لهذين الواجهات.

Figure 1
الشكل 1 . إظهار تخطيطي لعملية SFG (اللوحة اليسرى) مع الرسم التخطيطي لانتقال الطاقة (اللوحة اليمنى). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2 . نظام SFG في المختبر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3 . يُظهر المخطط مسار انتشار الضوء في المنشور لتجربة SFG. الأرقام 0، 1، 2 و 3 تمثل الهواء، المنشور، PHEMA والمتوسط السفلي (يمكن أن يكون متوسط أسفل الهواء، الصلبة أو السائلة.)، على التوالي. مستنسخة من لي، X.; لي, B.; تشانغ, X.; لي، C.؛ قوه, Z.; تشو, D.; Lu, X. Macromolecules 2016, 49, 3116−3125 (ref 9). حقوق الطبع والنشر 2016 الجمعية الكيميائية الأمريكية. تم تعديل هذا الرقم من [9]. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4 . معاملات فريسنل المحسوبة كدالة لسمك الفيلم لهندسة المنشور في الماء لتركيبات الاستقطاب SSP وPPP. تتوافق اللوحات من A1 إلى C1 مع نطاق CH وتتوافق اللوحات من A2 إلى C2 مع نطاق CO. مستنسخة من لي، X.; لي, B.; تشانغ, X.; لي، C.؛ قوه, Z.; تشو, D.; Lu, X. Macromolecules 2016, 49, 3116−3125 (ref 9). حقوق الطبع والنشر 2016 الجمعية الكيميائية الأمريكية. تم تعديل هذا الرقم من [9].

Figure 5
الشكل 5 . ssp وPPP الأطياف من واجهة CaF2/ PHEMA بعد التعرض للمياه. A: CH وOH مجموعة؛ B: مجموعة CO. المنحنيات السوداء هي النتائج المجهزة باستخدام معادلة لورنتز. وقد تم تعويض الأطياف من أجل الوضوح. مستنسخة من لي، X.; لي, B.; تشانغ, X.; لي، C.؛ قوه, Z.; تشو, D.; Lu, X. Macromolecules 2016, 49, 3116−3125 (ref 9). حقوق الطبع والنشر 2016 الجمعية الكيميائية الأمريكية. تم تعديل هذا الرقم من [9].

Figure 6
الشكل 6 . ssp وPPP أطياف سطح PHEMA على CaF2 المنشور. A: CH وOH مجموعة؛ B: مجموعة CO. وقد وضعت العينة في اتصال مع الماء. المنحنيات السوداء هي النتائج المجهزة باستخدام معادلة لورنتز. وقد تم تعويض الأطياف من أجل الوضوح. مستنسخة من لي، X.; لي, B.; تشانغ, X.; لي، C.؛ قوه, Z.; تشو, D.; Lu, X. Macromolecules 2016, 49, 3116−3125 (ref 9). حقوق الطبع والنشر 2016 الجمعية الكيميائية الأمريكية. تم تعديل هذا الرقم من [9].

Figure 7
الشكل 7 . تطبيع chiral(PSP) SFG الأطياف في أميد الأول (لوحة A) و N-H (لوحة B) نطاقات لPS / SF حل (90 ملغ / مل) واجهة قبل وبعد إضافة الميثانول. النقاط هي البيانات التجريبية والخطوط الصلبة هي المنحنيات المجهزة. تم تعويض الأطياف للوضوح. مستنسخة من لي، X.; دنغ، غ. ما، ل. Lu, X.; Langmuir 2018, 34, 9453−9459 (ref 16). حقوق الطبع والنشر 2018 الجمعية الكيميائية الأمريكية. تم تعديل هذا الرقم من [16].

Figure 8
الشكل 8 . تطبيع chiral(PSP) SFG الأطياف في أميد الأول (لوحة A) و N-H (لوحة B) نطاقات لPS / SF حل (1 ملغ / مل) واجهة قبل وبعد إضافة الميثانول. النقاط هي البيانات التجريبية والخطوط الصلبة هي المنحنيات المجهزة (الأزرق). تم تعويض الأطياف للوضوح. مستنسخة من لي، X.; دنغ، غ. ما، ل. Lu, X.; Langmuir 2018, 34, 9453−9459 (ref 16). حقوق الطبع والنشر 2018 الجمعية الكيميائية الأمريكية. تم تعديل هذا الرقم من [16].

Figure 9
الشكل 9 . Achiral(ssp,A) وchiral(spp,B) SFG الأطياف لثنائية الدهون ثنائية الدهون المزدوجة الراسية في اتصال مع حلول Ca 2+ مع تركيزات مختلفة (من 0.6 mM إلى 6 mM). تم تركيب نقاط البيانات تقريبًا باستخدام معادلة لورنتز. تم عرض تغيير المنطقة المتكاملة للإشارات الاهتزازية المياه كدالة لتركيز Ca2+ (ssp,C; spp,D). وقد تم تطبيع جميع الأطياف وتعويضها من أجل الوضوح. مستنسخة من لي، X.; ما، ل. Lu, X.; Langmuir 2018, 34, 14774−14779 (ref 21). حقوق الطبع والنشر 2018 الجمعية الكيميائية الأمريكية. تم تعديل هذا الرقم من [21].

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وللتحقيق في المعلومات الهيكلية من المستوى الجزيئي، تتمتع الحكومة الاتحادية الانتقالية بمزاياها المتأصلة (أي حساسية الطبقة الأحادية أو دون أحادية الطبقة والانتقائية بين الوجهين)، والتي يمكن تطبيقها لدراسة مختلف الواجهات، مثل الواجهات الصلبة/الصلبة والصلبة/ السائل، الصلبة / الغاز، السائل / الغاز، السائل / السائل واجهات. وعلى الرغم من أن صيانة المعدات والمحاذاة البصرية لا تزال انبتعدة للوقت، فإن المردود كبير من حيث أنه يمكن الحصول على المعلومات التفصيلية على المستوى الجزيئي على الأسطح والواجهات.

سبر بولي (2-هيدروكسيإيثيل ميثاكريلات) السطح ودفن واجهة فيالحل: كما أظهرنا أعلاه، يمكن تعديل معاملات حقل الضوء. يمكننا تأكيد هذا تجريبياً في واجهة مدفونة مع الركيزة، لأن سطح الركيزة CaF2 على نحو سلس ولا يمكن اختراقها من قبل جزيئات PHEMA، وهذه الواجهة هي واحدة حادة. ومع ذلك، على السطح مع الماء، يمكن لجزيئات الماء التفاعل مع جزيئات PHEMA وتنتشر في الجزء الأكبر. وبالتالي هذه الواجهة ضبابية، وليس حادة مثل واحد دفن. ولذلك، سيتم ملاحظة مختلف الملامح الطيفية SFG لهذه الواجهات اثنين. وقد أثبتت بياناتSFG التجريبية ذلك، مما يشير إلى القدرة على التحقيق الانتقائي في الواجهة المدفونة مع الركيزة أو السطح في الحل.

التفاعل بين السلاسل أو تأثير الحبس على تشكيل الهياكل الثانوية الليفيةالحريرية : عامل رئيسي هو التركيز التداخل الحرج (C*). بالنسبة لـ SF، C* هو ~ 1.8 ملغ/مل. تجريبيا، للحصول على حل SF من ~ 90 ملغ /مل (أعلاه C *)، لم يتم الكشف عن إشارات الاهتزاز ية (PSP) SFG في حل SF / PS واجهة ما لم يتم إضافة عامل تحفيز الميثانول، كما هو مبين في الشكل 7. ولكن، للحصول على حل SF من ~ 1 ملغ /مل (أدناه C *)، تشيرال (PSP) SFG إشارات الاهتزاز يمكن الكشف عنها مباشرة دون إضافة الميثانول، كما هو مبين في الشكل 8، مما يشير إلى أن الهياكل الثانوية المطلوبة قد شكلت بالفعل في SF حل / PS واجهة. وبما أن C* هو تركيز عتبة لتداخل سلسلة السلسلة، فإن التفاعل بين سلسلة السلسلة أو الحبس المكاني يجب أن يؤخذ كعامل منظم هنا لتشكيل هياكل ثانوية SF في الواجهة.

المياه الهياكل الجزيئية المحيطة قصيرة سلسلة Oligonucleotide دوبلكس: لقصيرة سلسلة oligonucleotide دوبلكس في محلول المياه، والمياه تشيرال SFG إشارات الاهتزاز تتوافق مع طبقة الترطيب من العمود الفقري تشيرال في الأخدود طفيفة . Achiral المياه SFG إشارات الاهتزاز تتوافق في الغالب مع طبقة المياه المحيطة سلسلة دوبلكس oligonucleotide وثنائية (العمود الفقري تشيرال من طبقة المياه يساهم أيضا)33. في نطاق تركيز Ca2+ من 0.6 إلى 6 mM، كما هو موضح في الشكل 9، وجدنا، لم يكن هناك تغيير واضح للإشارات الاهتزازية المياه الزقزقة من حيث تركيز Ca2+. ومع ذلك، تأثرت إشارات اهتزازية المياه achiral بشدة عندما تم تغيير تركيز Ca2+ . وهذا يشير إلى أن العمود الفقري تشيرال من طبقة المياه ملزمة بشكل وثيق إلى دوبلكس oligonucleotide قد تحمي oligonucleotide من أيونات Ca2 + ، في الحالة البيولوجية العادية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدينا ما نكشف عنه

Acknowledgments

وقد تم دعم هذه الدراسة من قبل برنامج الدولة للتنمية الرئيسية للبحوث الأساسية في الصين (2017YFA0700500) والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (21574020). صناديق البحوث الأساسية للجامعات المركزية، وهو مشروع ممول من تطوير البرنامج الأكاديمي ذي الأولوية لمؤسسات جيانغسو للتعليم العالي (PAPD) والمركز الوطني للعروض الإيضاحية للهندسة الطبية الحيوية التجريبية كما حظي التعليم (جامعة جنوب شرق) بتقدير كبير.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC)  Avanti Polar Lipids, Inc. 850355P-1g
Anhydrous ethanol Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 100092680 ≥99.7%
CaF2 prism Chengdu YaSi Optoelectronics Co., Ltd.
Calcium chloride anhydrous Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 10005817 ≥96.0%
deuterated DPPC (d-DPPC) Avanti Polar Lipids, Inc. 860345P-100mg
Electromagnetic oven Zhejiang Supor Co., Ltd C21-SDHCB37
Langmuir-Blodgett (LB) trough KSV NIMA Co., Ltd. KN 2003
Lithium bromide anhydrous Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 20056926
Milli-Q synthesis system Millipore Ultrapure water
Plasma cleaner Chengdu Mingheng Science&Technology Co., Ltd PDC-MG Oxygen plasma cleaning
Poly(2-hydroxyethyl methacrylate) (PHEMA) Sigma-Aldrich Co., LLC. 192066 MSDS Mw = 300 000
Polystyrene Sigma-Aldrich Co., LLC. 330345 MSDS Mw = 48 kDa and Mn = 47 kDa
Silk cocoons From Bombyx mori
Single complementary strand of oligonucleotide Nanjing Genscript Biotechnology Co., Ltd. H03596 5'-CGAAGGCTTCCAGCT-3'
Single strand of oligonucleotide Nanjing Genscript Biotechnology Co., Ltd. H04936  3¢-end modified by cholesterol-triethylene glycol(Chol-TEG) (5¢-GCTTCCGAAGGTCGA-3¢)
Sodium carbonate anhydrous Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 10019260 ≥99.8%
Spin-coater Institute of Microelectronics of the Chinese Academy of Sciences KW-4A For the prepartion of ploymer films 
Step profiler Veeco DEKTAK 150 For the measurement of film thickness
Sum frequency generation (SFG) vibrational spectroscopy system EKSPLA A commercial picosecond SFG system

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shen, Y. R. Optical Second Harmonic Generation at Interfaces. Annual Review of Physical Chemistry. 40, 327-350 (1989).
  2. Shen, Y. R. Surface properties probed by second-harmonic and sum-frequency generation. Nature. 337, 519-525 (1989).
  3. Lu, X., et al. Studying Polymer Surfaces and Interfaces with Sum Frequency Generation Vibrational Spectroscopy. Analytical Chemistry. 89 (1), 466-489 (2017).
  4. Chen, X., Clarke, M. L., Wang, J., Chen, Z. Sum Frequency Generation Vibrational Spectroscopy Studies on Molecular Conformation and Orientation of Biological Molecules at Interfaces. International Journal of Modern Physics B. 19 (4), 691-713 (2005).
  5. Eisenthal, K. B. Liquid Interfaces Probed by Second-Harmonic and Sum-Frequency Spectroscopy. Chemical Reviews. 96 (4), 1343-1360 (1996).
  6. Richmond, G. L. Molcular Bonding and Interactions at Aqueous Surfaces as Probed by Vibrational Sum Frequency Spectroscopy. Chemical Reviews. 102 (8), 2693-2724 (2002).
  7. Wang, H., Gan, W., Lu, R., Rao, Y., Wu, B. Quantitative spectral and orientational analysis in surface sum frequency generation vibrational spectroscopy(SFG-VS). International Reviews in Physical Chemistry. 24 (2), 191-256 (2007).
  8. Shultz, M. J., Schnitzer, C., Simonelli, D., Baldelli, S. Sum frequency generation spectroscopy of the aqueous interface: Ionic and soluble molecular solutions. International Reviews in Physical Chemistry. 19 (1), 123-153 (2010).
  9. Li, X., et al. Detecting Surface Hydration of Poly(2-hydroxyethyl methacrylate) in Solution in situ. Macromolecules. 49, 3116-3125 (2016).
  10. Li, X., Lu, X. Evolution of Irreversibly Absorbed Layer Promotes Dewetting of Polystyrene Film on Sapphire. Macromolecules. 51, 6653-6660 (2018).
  11. Lu, X., Spanninga, S. A., Kristalyn, C. B., Chen, Z. Surface Orientation of Phenyl Groups in Poly(sodium 4-styrenesulfonate) and in Poly(sodium 4-styrenesulfonate): Poly(3,4-ethylenedioxythiophene) Mixture Examined by Sum Frequency Generation Vibrational Spectroscopy. Langmuir. 26 (17), 14231-14235 (2010).
  12. Lu, X., Clarke, M. L., Li, D., Wang, X., Chen, Z. A Sum Frequency Generation Vibrational Study of the Interference Effect in Poly(n-butyl methacrylate) Thin Films Sandwiched between Silica and Water. Journal of Physical Chemistry C. 115, 13759-13767 (2011).
  13. Lu, X., et al. Directly Probing Molecular Ordering at the Buried Polymer/Metal Interface 2: Using P-Polarized Input Beams. Macromolecules. 45, 6087-6094 (2012).
  14. Lu, X., Myers, J. N., Chen, Z. Molecular Ordering of Phenyl Groups at the Buried Polystyrene/Metal Interface. Langmuir. 30, 9418-9422 (2014).
  15. Li, B., Lu, X., Ma, Y., Han, X., Chen, Z. Method to Probe Glass Transition Temperatures of Polymer Thin Films. ACS Macro Letters. 4, 548-551 (2015).
  16. Li, X., Deng, G., Ma, L., Lu, X. Interchain Overlap Affects Formation of Silk Fibroin Secondary Structure on Hydrophobic Polystyrene Surface Detected via Achiral/Chiral Sum Frequency Generation. Langmuir. 34, 9453-9459 (2018).
  17. Kai, S., Li, X., Li, B., Han, X., Lu, X. Calcium-dependent hydrolysis of supported planar lipids was triggered by honey bee venom phospholipase A2 with the right orientation at the interface. Physical Chemistry Chemical Physics. 20, 63-67 (2018).
  18. Wang, J., Buck, S., Chen, Z. Sum Frequency Generation Vibrational Spectroscopy Studies on Protein Adsorption. Journal of Physical Chemistry B. 106, 11666-11672 (2002).
  19. Wang, J., et al. Detection of Amide I Signals of Interfacial Proteins in Situ Using SFG. Journal of American Chemical Society. 125, 9914-9915 (2003).
  20. Nguyen, K. T., et al. Probing the Spontaneous Membrane Insertion of a Tall-Anchored Membrane Protein by Sum Frequency Generation Spectroscopy. Journal of American Chemistry Society. 132, 15112-15115 (2010).
  21. Li, X., Ma, L., Lu, X. Calcium Ions Affect Water Molecular Structures Surrounding an Oligonucleotide Duplex as Revealed by Sum Frequency Generation Vibrational Spectroscopy. Langmuir. , (2018).
  22. Sartenaer, Y., et al. Sum-frequency generation spectroscopy of DNA monolayers. Biosensors & Bioelectronics. 22, 2179-2183 (2007).
  23. Asanuma, H., Noguchi, H., Uosaki, K., Yu, H. Metal Cation-induced Deformation of DNA Self-Assembled Monolayers on Silicon: Vibrational Sum Frequency Generation Spectroscopy. Journal of American Chemistry Society. 130, 8016-8022 (2008).
  24. Howell, C., Schmidt, R., Kurz, V., Koelsch, P. Sum-frequency-generation spectroscopy of DNA films in air and aqueous environments. Biointerphases. 3 (3), FC47 (2008).
  25. Walter, S. R., Geiger, F. M. DNA on Stage: Showcasing Oligonucleotides at Surfaces and Interfaces with Second Harmonic and Vibrational Sum Frequency Generation. Journal of Physical Chemistry Letters. 1, 9-15 (2010).
  26. Li, Z., Weeraman, C., Azam, M. S., Osman, E., Gibbs-Davis, J. The thermal reorganization of DNA immobilized at the silica/buffer interface: a vibrational sum frequency generation investigation. Physical Chemistry Chemical Physics. 17, 12452-12457 (2015).
  27. Lambert, A. G., Neivandt, D. J., Briggs, A. M., Usadi, E. W., Davies, P. B. Interference Effects in Sum Frequency Spectra from Monolayers on Composite Dielectric/Metal Substrates. Journal of Physical Chemistry B. 106, 5461-5469 (2002).
  28. Tong, Y., et al. Interference effects in the sum frequency generation spectra of thin organic films. I. Theoretical modeling and simulation. Journal of Chemical Physics. 133, 034704 (2010).
  29. McGall, S. J., Davies, P. B., Neivandt, D. J. Interference Effects in Sum Frequency Vibrational Spectra of Thin Polymer Films: An Experimental and Modeling Investigation. Journal of Physical Chemistry B. 108, 16030-16039 (2004).
  30. Li, B., et al. Interfacial Fresnel Coefficients and Molecular Structures of Model Cell Membranes: From a Lipid Monolayer to a Lipid Bilayer. Journal of Physical Chemistry C. 118, 28631-28639 (2014).
  31. Zhou, J., Anim-Danso, E., Zhang, Y., Zhou, Y., Dhinojwala, A. Interfacial Water at Polyurethane-Sapphire Interface. Langmuir. 31 (45), 12401-12407 (2015).
  32. Gautam, K. S., et al. Molecular Structure of Polystyrene at Air/Polymer and Solid/Polymer Interfaces. Physical Review Letters. 85 (18), 3854-3857 (2000).
  33. Yan, E. Y., Fu, L., Wang, Z., Liu, W. Biological Macromolecules at Interfaces Probed by Chiral Vibrational Sum Frequency Generation Spectroscopy. Chemical Reviews. 114, 8471-8498 (2014).
  34. Belkin, M. A., Kulakov, T. A., Ernst, K. H., Yan, L., Shen, Y. R. Sum-Frequency Vibrational Spectroscopy on Chiral Liquids: A Novel Technique to Probe Molecular Chirality. Physical Review Letters. 85, 4474 (2000).
  35. Rockwood, D. N., et al. Materials fabrication from Bombyx mori silk fibroin. Nature Protocols. 6, 1612-1631 (2011).

Tags

الكيمياء الحيوية، العدد 150، التقنيات والمعدات التحليلية والتشخيصية والعلاجية، تقنيات ومعدات التحقيق، الظواهر والعمليات، الظواهر الفيزيائية، الكيمياء والمواد، الكيمياء والمواد (عام)، غير العضوية، العضوية والفيزيائية الكيمياء، الفيزياء، الفيزياء الذرية والجزيئية، البصريات، SFG، معاملات فريسنل، هياكل على المستوى الجزيئي بين الوجهين، البوليمرات، الجزيئات الحيوية، بنية الزقزقة، الحبس المكاني
الهياكل على المستوى الجزيئي بين الوجهين من البوليمرات والجزيئات الحيوية التي تم الكشف عنها عن طريق التحليل الطيفي الاهتزازي لجيل التردد الكلي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Li, X., Ma, L., Lu, X. Interfacial… More

Li, X., Ma, L., Lu, X. Interfacial Molecular-level Structures of Polymers and Biomacromolecules Revealed via Sum Frequency Generation Vibrational Spectroscopy. J. Vis. Exp. (150), e59380, doi:10.3791/59380 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter