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JoVE Journal Biochemistry
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Biochemistry

Grenzflächenphysikalische Strukturen von Polymeren und Biomakromolekülen, die über sum frequency generation Vibrational Spectroscopy aufgedeckt werden

Published: August 13, 2019 doi: 10.3791/59380
Automatic Translation
1, 1, 1
1State Key Laboratory of Bioelectronics, School of Biological Science & Medical Engineering, Southeast University

Summary

Die umfassende Nutzung der SUM-Frequenzerzeugung (SFG) kann dazu beitragen, die Kettenkonformationsreihenfolge und den sekundären Strukturwandel an Polymer- und Biomakromolekülschnittstellen aufzudecken.

Abstract

Als nichtlineare optische Spektroskopie zweiter Ordnung wurde die SUM-Frequenzerzeugung (SFG) in der Untersuchung verschiedener Oberflächen und Schnittstellen weit verbreitet eingesetzt. Diese nicht-invasive optische Technik kann die lokalen molekularen Informationen mit Monolayer- oder Submonolayer-Empfindlichkeit versorgen. Wir bieten hier experimentelle Methoden an, wie die vergrabene Schnittstelle sowohl für Makromoleküle als auch für Biomakromoleküle selektiv erkannt werden kann. Vor diesem Hintergrund werden grenzflächenförmige Sekundärstrukturen von Seidenfibroin und Wasserstrukturen um Modell-Kurzketten-Oligonukleotid-Duplex diskutiert. Erstere zeigt eine Kettenüberlappung oder räumliche Einschließungswirkung und letztere zeigt eine Schutzfunktion gegen die Ca 2+-Ionen, die sich aus dem chiralen Wirbelsäulenüberbau von Wasser ergeben.

Introduction

Die Entwicklung der Summenfrequenzerzeugung (SFG) Schwingungsspektroskopie kann auf die Arbeit von Shen et al. vor dreißig Jahren1,2zurückdatiert werden. Die Einzigartigkeit der Grenzflächenselektivität und Submonolayer-Empfindlichkeit macht die SFG-Schwingungsspektroskopie von einer großen Anzahl von Forschern aus den Bereichen Physik, Chemie, Biologie und Materialwissenschaft usw. geschätzt3,4 ,5. Derzeit wird ein breites Spektrum wissenschaftlicher Fragen im Zusammenhang mit Oberflächen und Schnittstellen mit SFG untersucht, insbesondere für komplexe Schnittstellen in Bezug auf Polymere und Biomakromoleküle, wie z.B. die Kettenstrukturen und die strukturelle Entspannung an der vergrabene Polymerschnittstellen, die Proteinsekundärstrukturen und die Grenzflächenwasserstrukturen9,10,11,12,13,14, 15,16,17,18,19,20,21,22,23, 24,25,26.

Für Polymeroberflächen und -schnittstellen werden Dünnschichtproben in der Regel durch Spin-Beschichtung hergestellt, um die gewünschten Oberflächen oder Schnittstellen zu erhalten. Das Problem ergibt sich aus der Signalstörung der beiden Schnittstellen der vorbereiteten Filme, was zu Unannehmlichkeiten bei der Analyse der gesammelten SFG-Spektren27,28,29führt. In den meisten Fällen ist das Schwingungssignal nur von einer einzigen Schnittstelle, entweder Film/Substrat oder Film/das andere Medium, wünschenswert. Eigentlich ist die Lösung für dieses Problem ganz einfach, nämlich die Lichtfelder an der wünschenswerten Schnittstelle experimentell zu maximieren und die Lichtfelder an der anderen Schnittstelle zu minimieren. Daher müssen die Fresnel-Koeffizienten oder die lokalen Feldkoeffizienten über das Dünnschichtmodell berechnet und in Bezug auf die experimentellen Ergebnisse3,9,10,11, 12,13,14,15,30.

Unter Berücksichtigung des obigen Hintergrunds könnten einige polymere und biologische Schnittstellen untersucht werden, um die Grundlagenforschung auf molekularer Ebene zu verstehen. Im Folgenden, unter Deriddrei grenzflächenfragen als Beispiele: Sondierung Poly(2-Hydroxyethylmethacrylat) (PHEMA) Oberfläche und vergrabene Schnittstelle mit Substrat9, Bildung von Seidenfibroin (SF) Sekundärstrukturen auf der Polystyrol (PS) Oberfläche und Wasserstrukturen, die das Modell Kurzketten-Oligonukleotid Duplex16,21umgeben, zeigen wir, wie die SFG-Schwingungsspektroskopie hilft, die grenzflächenförmigen molekularen Strukturen im Zusammenhang mit der zugrunde liegenden Wissenschaft aufzudecken.

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Protocol

1. SFG experimentell

  1. Verwenden Sie ein kommerzielles Picosecond SFG-System (Tabelle der Materialien), das einen grundlegenden 1064 nm Strahl mit einer Pulsbreite von 20 ps und einer Frequenz von 50 Hz, basierend auf einem Nd:YAG-Laser, bietet.
  2. Konvertieren Sie den basisgebischen 1064 nm-Strahl in einen 532 nm-Strahl und einen 355 nm-Strahl mit Hilfe von zweiten und dritten harmonischen Modulen. Führen Sie den 532 nm-Strahl direkt als Eingangslichtstrahl und erzeugen Sie den anderen Eingangs-Mittelinfrarotstrahl (IR) über den Frequenzbereich von 1000 bis 4000 cm-1 durch die optische parametrische Erzeugung (OPG)/optische parametrische Verstärkung (OPA)/ Differenzfrequenzgenerierung (DFG).
  3. Legen Sie die Einfallswinkel von zwei Eingangsstrahlen auf 53° (IR) bzw. 64° (sichtbar) gegenüber der Oberflächennormale fest.
  4. Um die Polymergrenzflächenstrukturen (entweder Film/Substrat-Schnittstelle oder Film/die andere mittlere Schnittstelle) zu erkennen, verwenden Sie ssp (s-polarisierte Summenfrequenzstrahl, s-polarisierter sichtbarer Strahl und p-polarisierter Infrarotstrahl) und ppp Polarisationskombinationen.
  5. Um die Grenzflächenproteinsekundärstrukturen und Wasserstrukturen, die die DNA umgeben, zu erkennen, wurden neben ssp und ppp auch chirale Spp- und psp-Polarisationskombinationen verwendet.
  6. Um sicherzustellen, dass die Proben nicht beschädigt wurden, steuern Sie die Infrarot- und sichtbaren Pulsenergien auf 70 bzw. 30 mJ. Ein Schaltplan des SFG-Prozesses mit dem Energiepegeldiagramm wurde in Abbildung 1dargestellt. Abbildung 2 zeigt das SFG-System in unserem Reinraum.

2. Fresnel-Koeffizienten

  1. Verwenden Sie rechtwinklige Prismen als Substrate für alle hier diskutierten Experimente. Es gibt zwei Schnittstellen für einen Polymerfilm auf dem festen Substrat, d.h. Polymeroberfläche in Luft und Polymer/Substrat-Schnittstelle. Beide können SFG-Signale erzeugen, da die Inversionssymmetrie an beiden Schnittstellen unterbrochen ist. Daher ist ein gesammeltes SFG-Spektrum ein gestörtes. Die lokalen Feldkoeffizienten oder die Fresnel-Koeffizienten an den beiden Schnittstellen können jedoch durch Variation der Einfallswinkel oder der Filmdicke nacheinander oder gleichzeitig31,32einstellbar werden. Dies bietet uns die Möglichkeit, das SFG-Schwingungssignal von nur einer Schnittstelle aus zu sondieren. Hier wurde der PHEMA-Film auf dem CaF2 Prisma als Beispiel9genommen.
  2. Wie in Abbildung 3gezeigt, verwenden Sie die rechtwinklige Prismengeometrie, um die SFG-Signale zu erkennen, die aus der unteren PHEMA-Folie erzeugt werden. Die SFG-Ausgangsintensität im reflektierten Modus wird als
    Equation 1(1)
    wobei Equation 2 der effektive nichtlineare Anfälligkeitstensor zweiter Ordnung bezeichnet wird.
    Equation 2besteht aus drei Teilen, nämlich der Prisma/Polymer-Schnittstelle, der Polymer-/Bodenmittelschnittstelle (unteres Medium enthält Gas, flüssigkeit oder fest.) und dem nicht resonanten Hintergrund, wie in der folgenden Gleichung dargestellt.
    Equation 3(2)
    Hier könnte das untere Medium Luft, Wasser oder etwas anderes sein. F stellt den entsprechenden Fresnel-Koeffizienten dar, der für die lokale Feldkorrektur verantwortlich ist.
  3. Wenden Sie in diesem Fall ein Dünnschichtmodell an, um die Fresnel-Koeffizienten zu berechnen. Hier werden nur kurze Berechnungsverfahren vorgestellt.
    1. Für die Prisma/Polymer-Schnittstelle
      Equation 4(3)
      Equation 5(4)
      Equation 6(5)
      Die Bedeutung der einzelnen dargestellten Parameter wird unten dargestellt.
      1. I bezeichnet die Strahlfrequenz.
      2. t und ts bezeichnen die Gesamttransmissionskoeffizienten und können als
        Equation 7(6)
        Equation 8(7)
      3. tp12 und ts12 bezeichnen die linearen Transmissionskoeffizienten des Lichtstrahls an der Prisma/Polymer-Schnittstelle.
      4. rp23 und rs23 bezeichnen die linearen Reflexionskoeffizienten des Lichtstrahls an der Polymer-/Mittelschnittstelle.
      5. • stellt die Phasendifferenz zwischen einem reflektierenden Strahl und seinem sekundären Reflexionsstrahl dar, nachdem er sich über den Polymer-Dünnfilm ausbreitet und dann zurück reflektiert, der als
        Equation 9(8)
      6. stellt die Wellenlänge des Lichtstrahls dar und d ist die Polymerschichtdicke.
      7. Die Einfallswinkel an der Prisma-Polymer-Schnittstelle bzw. der Polymer-/Medium-Schnittstelle stellen die Einfallswinkel dar.
      8. n1 und n2 stellen die Brechungsindizes des Prismas bzw. der Polymerfolie dar.
      9. n12 stellt die Brechungsindizes der Polymergrenzflächenschichten für das Prisma/Polymer dar.
    2. Für die Polymer/Medium-Schnittstelle
      Equation 10(9)
      Equation 11(10)
      Equation 12(11)
      1. - stellt die Phasendifferenz der elektrischen Lichtfelder an zwei Schnittstellen dar.
      2. Da die Pulsbreite für unsere Eingangsstrahlen 20 ps beträgt, kann der Fehler aus der Zeitverzögerung, die mit dem Dispersionseffekt verbunden ist, vernachlässigt werden.
      3. Der Ausdruck einer solchen Phasendifferenz für den Ausgang SFG, den sichtbaren Eingang und die Eingangs-Infrarotstrahlen kann separat als
        Equation 13(12)
        Equation 14(13)
        Equation 15(14)
         
  4. Aus der obigen Diskussion, für das Prisma-Polymer-Film-Medium (1-2-3) System, drücken Sie die gesamten Fresnel-Koeffizienten für das Prisma/Polymer und Polymer/Medium-Schnittstellen als die folgenden Gleichungen, für ssp- und ppp-Polarisationskombinationen aus. . Natürlich gelten beide Schnittstellen als azimutal isotrop.
    1. Für die Prisma/Polymer-Schnittstelle werden die Ausdrücke der gesamten Fresnel-Koeffizienten für ssp- und ppp-Polarisationskombinationen wie folgt dargestellt.
      1. Für sspist die Gleichung
        Equation 16(15)
      2. Und für pppist die Gleichung
        Equation 5(16)
        Equation 5(17)
        Equation 5(18)
        Equation 5(19)
         
      3. t10 und t01 bezeichnen die linearen Transmissionskoeffizienten an den Luft-Prisma- bzw. Prismen-/Luftschnittstellen.
    2. Für die Polymer/Medium-Schnittstelle werden die Ausdrücke der gesamten Fresnel-Koeffizienten für ssp- und ppp-Polarisationskombinationen wie folgt beschrieben.
      1. Für sspist die Gleichung
        Equation 21(20)
      2. Für pppsind die Gleichungen
        Equation 5(21)
        Equation 5(22)
        Equation 5(23)
        Equation 5(24)
           
         
  5. Nach der Berechnung der Fresnel-Koeffizienten unter Verwendung des Sandwichmodells zeichnen Sie sie in Abhängigkeit von der Filmdicke, wie in Abbildung 4dargestellt.
    HINWEIS: In diesem Fall gibt es einen Dickenbereich zum Sammeln des SFG-Signals von der CaF2 Prisma/PHEMA-Schnittstelle mit vernachlässigbarem Beitrag von der anderen Schnittstelle, der etwa 150 nm beträgt. Ebenso kann eine geeignete Dicke für die Detektion der PHEMA/Bodenmittelschnittstelle mit vernachlässigbarem Beitrag aus der CaF2 Prisma/PHEMA-Schnittstelle gewählt werden.

3. Chirale SFG Polarisationskombination

  1. Für die normale achirale Schnittstelle verwenden Sie häufig die C-V-Symmetrie in Bezug auf den Ensembledurchschnitt33, 34. Mit der Operation der Inversionssymmetrie können die nichtlinearen Anfälligkeits-Tensorkomponenten ungleich Null abgeleitet werden, die cxxz, cxzx, czxx, cyyz, cyzy, czyy und czzz (die bestehende Begriffe können weiter reduziert werden, wenn von einer isotropen Schnittstelle ausgegangen wird, d.h. x und y sind identisch). Bei der chiralen Schnittstelle wird die Situation jedoch anders sein. Die chirale Schnittstelle besitzt die C-Symmetrie, nur die Rotationssymmetrieoperation ist zulässig. In diesem Fall werden neben den normalen achiralen Begriffen mehr nichtlineare Anfälligkeiten zweiter Ordnung ungleich Null sein, was als chirale Begriffe bezeichnet werden kann, nämlich czyx, czxy und cyzx unter Berücksichtigung nicht-elektronischer Begriffe. Resonanz. Daher können mit psp, pps und spp Polarisationskombinationen chirale SFG-Spektren gesammelt werden33,34.

4. Probenvorbereitung

  1. Vorbereitung von PHEMA-Folie
    1. PHEMA-Pulver (siehe Materialtabelle) in wasserfreiem Ethanol auflösen, um die Lösung mit 2 Gew. bzw. 4 Gew.-% herzustellen.
    2. Vor der Abscheidung der PHEMA-Folien die CaF2 Rechtwinkelprismen zunächst in das Tolululuus-Lösungsmittel einweichen und dann mit Ethanol und Reinstwasser (18,2 cm) waschen.
    3. Anschließend setzen Sie die Substrate (CaF2 Rechtwinkelprismen) Sauerstoffplasma aus, um mögliche organische Verunreinigungen durch Plasmareiniger zu entfernen (siehe Tabelle der Materialien).
      1. Schalten Sie zuerst den Plasmareiniger ein und legen Sie die Substrate hinein.
      2. Schalten Sie dann die Vakuumpumpe ein, um den Reiniger zu saugen. Geben Sie den Sauerstoff darin ein.
      3. Stellen Sie schließlich 4 Minuten für die Reinigung ein. Danach die sauberen Substrate für die sequenzielle PHEMA-Folienvorbereitung aufbewahren.
      4. Dann bereiten Sie die PHEMA-Filme auf den CaF2 Prismen mit einem Spincoater vor (siehe Materialtabelle). Passen Sie die Folienstärken durch die Lösungskonzentration und Spingeschwindigkeit an.
        1. Immobilisieren Sie das CaF2 Prisma auf der Saugscheibe des Spincoaters.
        2. Lassen Sie einen Tropfen der zuvor vorbereiteten PHEMA-Lösung bei 1.500 Rpm für 1 min auf die sauberen Substrate (Foliendicke 2 Gewand% für 100 nm und 4 Gew.-% für 200 nm).
      5. Alle vorbereiteten PHEMA-Folien im Vakuumofen bei 80 °C über Nacht anneal.
  2. Herstellung von Seidenfibroin (SF)
    HINWEIS: Das von Kaplan et al.35 vorgeschlagene Protokoll wurde angenommen.
    1. 7,5 g Seidenkokons von B. mori in das kochende Natriumcarbonat (Na2CO3, 0,02 M) wässrige Lösung (3 L) für 30 min. Entfernen Sie die faserige SF in einen sauberen Behälter.
    2. Waschen Sie die erhaltene faserige SF dreimal unter Rühren mit entionisiertem Wasser, um die Sericinmoleküle zu entfernen und nur die SF-Moleküle in der faserigen Probe zu lassen.
    3. Die faserige SF-Probe über Nacht bei 60 °C im Vakuumofen trocknen.
    4. Anschließend die degummed faserige SF-Probe in einer wässrigen Lithiumbromidlösung (LiBr, 9,3 m) auflösen (1 g SF wurde in 4 ml LiBr-Lösung gelöst) und bei 60 °C für 2 h unter Rühren inkubieren.
    5. Dialyze die SF-Lösung gegen entionisiertes Wasser (3.500 Da Dialysebeutel) für 3 Tage, um die gelöste LiBr zu entfernen. Wechseln Sie dreimal täglich neues entionisiertes Wasser. Schließlich die verarbeitete SF-Lösung bei 4 °C für spätere SFG-Experimente aufbewahren.
  3. Herstellung von kurzkettigem Oligonukleotid-Duplex
    1. Bestellen Sie die einsträngige Oligonukleotidprobe mit ihrer 3'-End-modifizierten durch Cholesterin-Triethylenglykol (Chol-TEG) (5'-GCTTCCGAAGGTCGA-3') von einem Handelsunternehmen (siehe Materialtabelle) sowie der komplementären. Für jeden einzelnen Strang 10 nmol des Probenpulvers in 0,5 ml Reinstwasser auflösen. Mischen Sie sie dann zu der Duplex-Oligonukleotidlösung (10 nmol/mL).
    2. Mischen Sie 2 mg 1,2-Dipalmitoyl-Sn-Glycero-3-Phosphocholin (DPPC) und 2 mg deuterated DPPC (d-DPPC) und lösen Sie sie in 1 ml Chloroform auf, um die Lipidlösung vorzubereiten.
    3. Herstellung der DPPC & d-DPPC Monolayer durch einen Langmuir-Blodgett (LB) Trog
      1. Befestigen Sie das rechtwinklige CaF2 Prisma an einem hausgemachten Probenhalter mit einer Prismenfläche, die senkrecht in die wässrige Umgebung des LB-Trogs getaucht ist.
      2. Anschließend die vorbereitete gemischte Lipidlösung auf die Wasseroberfläche injizieren, bis der Oberflächendruck einen bestimmten Wert unter 34 mN'merreichthat.
      3. Verwenden Sie nach dem Abschalten des Oberflächendrucks zwei Teflonbarrieren, um die Lipidmonoschicht im Verhältnis 5 mm/min zu komprimieren, bis ein Oberflächendruck von 34 mN'm'1 erreicht ist.
      4. Heben Sie das Prisma mit einer Lipid-Monoschicht mit einer Geschwindigkeit von 1 mm/min vertikal aus dem Wasser.
    4. Zubereitung der anderen Lipidmonoschicht
      1. Um die Montage des Duplexoligonukleotids und der Lipidmoleküle über die hydrophobe Wechselwirkung (Cholesterin und eine Lipidalkylkette) zu erleichtern, mischen Sie die Duplex-Oligonukleotidlösung mit der Lipidlösung in einem Molverhältnis von 1:100 (Oligonukleotid Lipid).
      2. In jizieren Sie die gemischte Lipid- und Duplex-Oligonukleotid-Lösung in einen hausgemachten Teflonbehälter auf die Wasseroberfläche, bis ein Oberflächendruck von 34 mNm1 erreicht ist.
    5. Schließlich setzen Sie die Lipid-Monoschicht an der Unterseite des Prismas in Kontakt mit der Lipid-Monoschicht mit eingelegten Duplex-Oligonukleotiden auf der Wasseroberfläche, um die letzte Probe für die SFG-Messung zu bilden.
  4. Lorentz-Gleichung
    1. Verwenden Sie die Lorentz-Gleichung, um die SFG-Spektren anzupassen, um die Schwingungsinformationen für einen bestimmten Schwingungsmodus zu extrahieren.
      Equation 26(25)
      wobei Equation 27 die Intensität des qth-Vibrationsmodus, die Equation 28 Resonanzfrequenz, Equation 29 die Halbbreite bei halbmaximaler Equation 30 (HWHM) und die Scanfrequenz des einfallenden IR-Strahls darstellt.

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Representative Results

Im Fresnel-Koeffiziententeil des Protokollabschnitts haben wir gezeigt, dass es theoretisch möglich ist, selektiv nur eine einzige Schnittstelle gleichzeitig zu erkennen. Hier haben wir experimentell bestätigt, dass diese Methode grundsätzlich korrekt ist, wie in Abbildung 5 und Abbildung 6dargestellt.

Abbildung 5 zeigt die vergrabene Grenzflächen-PHEMA-Struktur nach Wassereinbruch mit einem PHEMA-Hydrogelfilm im Wert von 150 nm und Abbildung 6 zeigt die Oberflächenstruktur in Wasser mit einem PHEMA-Hydrogelfilm von 430 nm. Die Panels A und B entsprechen den CH- und CO-Bereichen für beide Abbildungen. An der vergrabenen Schnittstelle sind alle beobachteten Schwingungsspitzen scharf und klar. Der Grund dafür ist, dass das CaF2 Substrat glatt ist und nicht von PHEMA-Molekülen durchdrungen werden kann, was zu einer scharfen CaF2/PHEMA-Schnittstelle führt. Da Wassermoleküle jedoch mit PHEMA interagieren und in die Masse diffundieren können, wäre die PHEMA/Wasser-Schnittstelle nicht so scharf wie die vergrabene. Daher werden für diese beiden Schnittstellen unterschiedliche Spektralprofile beobachtet.

Figure 1
Abbildung 1 . Schematische Darstellung des SFG-Prozesses (linkes Panel) mit dem Energiewende-Diagramm (rechtes Panel). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2 . Das SFG-System im Labor. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3 . Schematic zeigt den Lichtausbreitungspfad im Prisma für das SFG-Experiment. Die Zahlen 0, 1, 2 und 3 stellen die Luft, das Prisma, das PHEMA und das untere Medium (das untere Medium kann Luft, fest oder flüssig sein) darstellen. Reproduziert aus Li, X.; Li, B.; Zhang, X.; Li, C.; Guo, Z.; Zhou, D.; Lu, X. Macromolecules 2016, 49, 3116-3125 (Ref. 9). Copyright 2016 American Chemical Society. Diese Zahl wurde von [9] geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4 . Berechnete Fresnel-Koeffizienten in Abhängigkeit von der Foliendicke für die Prismengeometrie in Wasser für ssp- und ppp-Polarisationskombinationen. Die Panels A1 bis C1 entsprechen dem CH-Bereich und die Panels A2 bis C2 dem CO-Bereich. Reproduziert aus Li, X.; Li, B.; Zhang, X.; Li, C.; Guo, Z.; Zhou, D.; Lu, X. Macromolecules 2016, 49, 3116-3125 (Ref. 9). Copyright 2016 American Chemical Society. Diese Zahl wurde von [9] geändert.

Figure 5
Abbildung 5 . ssp- und ppp-Spektren der CaF2/PHEMA-Schnittstelle nach Wassereinwirkung. A: CH- und OH-Bereich; B: CO-Bereich. Die schwarzen Kurven sind die angepassten Ergebnisse mit Lorentz-Gleichung. Die Spektren wurden aus Gründen der Übersichtlichkeit ausgeglichen. Reproduziert aus Li, X.; Li, B.; Zhang, X.; Li, C.; Guo, Z.; Zhou, D.; Lu, X. Macromolecules 2016, 49, 3116-3125 (Ref. 9). Copyright 2016 American Chemical Society. Diese Zahl wurde von [9] geändert.

Figure 6
Abbildung 6 . ssp- und ppp-Spektren der PHEMA-Oberfläche auf CaF 2-Prisma. A: CH- und OH-Bereich; B: CO-Bereich. Die Probe wurde mit Wasser in Berührung gebracht. Die schwarzen Kurven sind die angepassten Ergebnisse mit Lorentz-Gleichung. Die Spektren wurden aus Gründen der Übersichtlichkeit ausgeglichen. Reproduziert aus Li, X.; Li, B.; Zhang, X.; Li, C.; Guo, Z.; Zhou, D.; Lu, X. Macromolecules 2016, 49, 3116-3125 (Ref. 9). Copyright 2016 American Chemical Society. Diese Zahl wurde von [9] geändert.

Figure 7
Abbildung 7 . Normalisierte chirale (psp) SFG-Spektren im Amid I (Panel A) und N-H (Panel B) Für die PS/SF-Lösung (90 mg/ml) Schnittstelle vor und nach dem Hinzufügen von Methanol. Die Punkte sind experimentelle Daten und die durchgezogenen Linien sind die angepassten Kurven. Spectra wurden aus Gründen der Übersichtlichkeit versetzt. Reproduziert aus Li, X.; Deng, G.; Ma, L.; Lu, X.; Langmuir 2018, 34, 9453-9459 (Ref. 16). Copyright 2018 American Chemical Society. Diese Zahl wurde von [16] geändert.

Figure 8
Abbildung 8 . Normalisierte chirale (psp) SFG-Spektren im Amid I (Panel A) und N-H (Panel B) Für die PS/SF-Lösung (1 mg/ml) Schnittstelle vor und nach dem Hinzufügen von Methanol. Die Punkte sind experimentelle Daten und die durchgezogenen Linien sind die angepassten Kurven (blau). Spectra wurden aus Gründen der Übersichtlichkeit versetzt. Reproduziert aus Li, X.; Deng, G.; Ma, L.; Lu, X.; Langmuir 2018, 34, 9453-9459 (Ref. 16). Copyright 2018 American Chemical Society. Diese Zahl wurde von [16] geändert.

Figure 9
Abbildung 9 . Achirale (ssp, A) und chirale (spp, B) SFG Spektren für die Duplex-Oligonukleotid-verankerten Lipid-Bilayer in Kontakt mit den Ca2+ Lösungen mit unterschiedlichen Konzentrationen (von 0,6 mM bis 6 mM). Die Datenpunkte wurden ungefähr mit der Lorentz-Gleichung angepasst. Die Änderung des integrierten Bereichs für die Wasserschwingungssignale in Abhängigkeit von der Ca2+ Konzentration wurde vorgestellt (ssp, C; spp, D). Alle Spektren wurden normalisiert und aus Gründen der Übersichtlichkeit versetzt. Reproduziert aus Li, X.; Ma, L.; Lu, X.; Langmuir 2018, 34, 14774–14779 (Ref. 21). Copyright 2018 American Chemical Society. Diese Zahl wurde von [21] geändert.

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Discussion

Um die strukturellen Informationen von molekularer Ebene aus zu untersuchen, hat SFG seine inhärenten Vorteile (z.B. Monolayer- oder Submonolayer-Empfindlichkeit und Grenzflächenselektivität), die zur Untersuchung verschiedener Schnittstellen, wie z. B. der fest/fest Flüssigkeit, Feststoff/Gas, Flüssigkeit/Gas, Flüssigkeit/Flüssigkeitsschnittstellen. Obwohl die Wartung der Geräte und die optische Ausrichtung noch zeitaufwändig sind, ist der Gewinn insofern erheblich, als die detaillierten molekularen Informationen an den Oberflächen und Schnittstellen abgerufen werden können.

Sondierung Poly (2-Hydroxyethylmethacrylat) Oberfläche und begrabenschnittstelle in Lösung: Wie wir oben gezeigt haben, können die Lichtfeldkoeffizienten eingestellt werden. Wir können dies experimentell bestätigen. An der vergrabenen Schnittstelle mit dem Substrat, da die CaF2 Substratoberfläche glatt ist und nicht von PHEMA-Molekülen durchdrungen werden kann, ist diese Schnittstelle scharf. An der Oberfläche mit Wasser können Wassermoleküle jedoch mit PHEMA-Molekülen interagieren und in die Masse diffundieren. Daher ist diese Schnittstelle verschwommen, und nicht so scharf wie die vergrabene. Daher würden für diese beiden Schnittstellen unterschiedliche SFG-Spektralprofile beobachtet. Unsere experimentellen SFG-Daten haben dies bewiesen und die Fähigkeit angedeutet, die vergrabene Schnittstelle mit dem Substrat oder der Oberfläche in Lösung selektiv zu untersuchen.

Interchain Interaction or Confinement effect on Formation of Silk Fibroin Secondary Structures: Ein Schlüsselfaktor ist die kritische überlappende Konzentration (C*). Für SF beträgt C* 1,8 mg/ml. Experimentell wurden für die SF-Lösung von 90 mg/ml (über C*) keine chiralen (psp) SFG-Schwingungssignale an der SF-Lösung/PS-Schnittstelle nachgewiesen, es sei denn, ein induzierendes Mittel-Methanol wurde hinzugefügt, wie in Abbildung 7dargestellt. Für die SF-Lösung von 1 mg/ml (unter C*) können jedoch chirale (psp) SFG-Schwingungssignale ohne Zugabe von Methanol direkt erkannt werden, wie in Abbildung 8dargestellt, was darauf hinweist, dass die geordneten Sekundärstrukturen bereits am SF gebildet wurden. Lösung/PS-Schnittstelle. Da C* eine Schwellenkonzentration für die Kettenkettenüberlappung ist, ist hier die Ketten-Ketten-Interaktion oder die räumliche Einschließung als regulierender Faktor für die Bildung von SF-Sekundärstrukturen an der Schnittstelle zu betrachten.

Wassermolekulare Strukturen um kurzkettiges Oligonukleotid Duplex: Für ein kurzkettiges Oligonukleotid-Duplex in der Wasserlösung entsprechen chirales Wasser SFG-Vibrationssignale der Hydratationsschicht der chiralen Wirbelsäule in der Mollrille . Achiral wasser SFG Vibrationssignale entsprechen meist der Wasserschicht, die die Oligonukleotid-Duplexkette und die Bilayer (die chirale Wirbelsäule der Wasserschicht trägt ebenfalls dazu bei)33. In einem Ca 2+-Konzentrationsbereich von 0,6 bis 6 mM, wie in Abbildung 9dargestellt, ergaben wir, dass sich die chiralen Wasserschwingungssignale in Bezug auf die Ca2+-Konzentration nicht offensichtlich veränderten. Die achiralen Wasserschwingungssignale wurden jedoch stark beeinflusst, als die Ca 2+-Konzentration geändert wurde. Dies deutet darauf hin, dass die chirale Wirbelsäule der Wasserschicht, die eng an das Oligonukleotidduplex bindet, das Oligonukleotid vor den Ca2+-Ionen im normalen biologischen Zustand schützen kann.

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Disclosures

Wir haben nichts zu verraten.

Acknowledgments

Diese Studie wurde vom State Key Development Program for Basic Research of China (2017YFA0700500) und der National Natural Science Foundation of China (21574020) unterstützt. The Fundamental Research Funds for the Central Universities, ein Projekt, das von der prioritären akademischen Programmentwicklung der Jiangsu-Hochschuleinrichtungen (PAPD) und des Nationalen Demonstrationszentrums für experimentelle biomedizinische Technik finanziert wird Auch die Bildung (Southeast University) wurde sehr geschätzt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC)  Avanti Polar Lipids, Inc. 850355P-1g
Anhydrous ethanol Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 100092680 ≥99.7%
CaF2 prism Chengdu YaSi Optoelectronics Co., Ltd.
Calcium chloride anhydrous Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 10005817 ≥96.0%
deuterated DPPC (d-DPPC) Avanti Polar Lipids, Inc. 860345P-100mg
Electromagnetic oven Zhejiang Supor Co., Ltd C21-SDHCB37
Langmuir-Blodgett (LB) trough KSV NIMA Co., Ltd. KN 2003
Lithium bromide anhydrous Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 20056926
Milli-Q synthesis system Millipore Ultrapure water
Plasma cleaner Chengdu Mingheng Science&Technology Co., Ltd PDC-MG Oxygen plasma cleaning
Poly(2-hydroxyethyl methacrylate) (PHEMA) Sigma-Aldrich Co., LLC. 192066 MSDS Mw = 300 000
Polystyrene Sigma-Aldrich Co., LLC. 330345 MSDS Mw = 48 kDa and Mn = 47 kDa
Silk cocoons From Bombyx mori
Single complementary strand of oligonucleotide Nanjing Genscript Biotechnology Co., Ltd. H03596 5'-CGAAGGCTTCCAGCT-3'
Single strand of oligonucleotide Nanjing Genscript Biotechnology Co., Ltd. H04936  3¢-end modified by cholesterol-triethylene glycol(Chol-TEG) (5¢-GCTTCCGAAGGTCGA-3¢)
Sodium carbonate anhydrous Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 10019260 ≥99.8%
Spin-coater Institute of Microelectronics of the Chinese Academy of Sciences KW-4A For the prepartion of ploymer films 
Step profiler Veeco DEKTAK 150 For the measurement of film thickness
Sum frequency generation (SFG) vibrational spectroscopy system EKSPLA A commercial picosecond SFG system

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References

  1. Shen, Y. R. Optical Second Harmonic Generation at Interfaces. Annual Review of Physical Chemistry. 40, 327-350 (1989).
  2. Shen, Y. R. Surface properties probed by second-harmonic and sum-frequency generation. Nature. 337, 519-525 (1989).
  3. Lu, X., et al. Studying Polymer Surfaces and Interfaces with Sum Frequency Generation Vibrational Spectroscopy. Analytical Chemistry. 89 (1), 466-489 (2017).
  4. Chen, X., Clarke, M. L., Wang, J., Chen, Z. Sum Frequency Generation Vibrational Spectroscopy Studies on Molecular Conformation and Orientation of Biological Molecules at Interfaces. International Journal of Modern Physics B. 19 (4), 691-713 (2005).
  5. Eisenthal, K. B. Liquid Interfaces Probed by Second-Harmonic and Sum-Frequency Spectroscopy. Chemical Reviews. 96 (4), 1343-1360 (1996).
  6. Richmond, G. L. Molcular Bonding and Interactions at Aqueous Surfaces as Probed by Vibrational Sum Frequency Spectroscopy. Chemical Reviews. 102 (8), 2693-2724 (2002).
  7. Wang, H., Gan, W., Lu, R., Rao, Y., Wu, B. Quantitative spectral and orientational analysis in surface sum frequency generation vibrational spectroscopy(SFG-VS). International Reviews in Physical Chemistry. 24 (2), 191-256 (2007).
  8. Shultz, M. J., Schnitzer, C., Simonelli, D., Baldelli, S. Sum frequency generation spectroscopy of the aqueous interface: Ionic and soluble molecular solutions. International Reviews in Physical Chemistry. 19 (1), 123-153 (2010).
  9. Li, X., et al. Detecting Surface Hydration of Poly(2-hydroxyethyl methacrylate) in Solution in situ. Macromolecules. 49, 3116-3125 (2016).
  10. Li, X., Lu, X. Evolution of Irreversibly Absorbed Layer Promotes Dewetting of Polystyrene Film on Sapphire. Macromolecules. 51, 6653-6660 (2018).
  11. Lu, X., Spanninga, S. A., Kristalyn, C. B., Chen, Z. Surface Orientation of Phenyl Groups in Poly(sodium 4-styrenesulfonate) and in Poly(sodium 4-styrenesulfonate): Poly(3,4-ethylenedioxythiophene) Mixture Examined by Sum Frequency Generation Vibrational Spectroscopy. Langmuir. 26 (17), 14231-14235 (2010).
  12. Lu, X., Clarke, M. L., Li, D., Wang, X., Chen, Z. A Sum Frequency Generation Vibrational Study of the Interference Effect in Poly(n-butyl methacrylate) Thin Films Sandwiched between Silica and Water. Journal of Physical Chemistry C. 115, 13759-13767 (2011).
  13. Lu, X., et al. Directly Probing Molecular Ordering at the Buried Polymer/Metal Interface 2: Using P-Polarized Input Beams. Macromolecules. 45, 6087-6094 (2012).
  14. Lu, X., Myers, J. N., Chen, Z. Molecular Ordering of Phenyl Groups at the Buried Polystyrene/Metal Interface. Langmuir. 30, 9418-9422 (2014).
  15. Li, B., Lu, X., Ma, Y., Han, X., Chen, Z. Method to Probe Glass Transition Temperatures of Polymer Thin Films. ACS Macro Letters. 4, 548-551 (2015).
  16. Li, X., Deng, G., Ma, L., Lu, X. Interchain Overlap Affects Formation of Silk Fibroin Secondary Structure on Hydrophobic Polystyrene Surface Detected via Achiral/Chiral Sum Frequency Generation. Langmuir. 34, 9453-9459 (2018).
  17. Kai, S., Li, X., Li, B., Han, X., Lu, X. Calcium-dependent hydrolysis of supported planar lipids was triggered by honey bee venom phospholipase A2 with the right orientation at the interface. Physical Chemistry Chemical Physics. 20, 63-67 (2018).
  18. Wang, J., Buck, S., Chen, Z. Sum Frequency Generation Vibrational Spectroscopy Studies on Protein Adsorption. Journal of Physical Chemistry B. 106, 11666-11672 (2002).
  19. Wang, J., et al. Detection of Amide I Signals of Interfacial Proteins in Situ Using SFG. Journal of American Chemical Society. 125, 9914-9915 (2003).
  20. Nguyen, K. T., et al. Probing the Spontaneous Membrane Insertion of a Tall-Anchored Membrane Protein by Sum Frequency Generation Spectroscopy. Journal of American Chemistry Society. 132, 15112-15115 (2010).
  21. Li, X., Ma, L., Lu, X. Calcium Ions Affect Water Molecular Structures Surrounding an Oligonucleotide Duplex as Revealed by Sum Frequency Generation Vibrational Spectroscopy. Langmuir. , (2018).
  22. Sartenaer, Y., et al. Sum-frequency generation spectroscopy of DNA monolayers. Biosensors & Bioelectronics. 22, 2179-2183 (2007).
  23. Asanuma, H., Noguchi, H., Uosaki, K., Yu, H. Metal Cation-induced Deformation of DNA Self-Assembled Monolayers on Silicon: Vibrational Sum Frequency Generation Spectroscopy. Journal of American Chemistry Society. 130, 8016-8022 (2008).
  24. Howell, C., Schmidt, R., Kurz, V., Koelsch, P. Sum-frequency-generation spectroscopy of DNA films in air and aqueous environments. Biointerphases. 3 (3), FC47 (2008).
  25. Walter, S. R., Geiger, F. M. DNA on Stage: Showcasing Oligonucleotides at Surfaces and Interfaces with Second Harmonic and Vibrational Sum Frequency Generation. Journal of Physical Chemistry Letters. 1, 9-15 (2010).
  26. Li, Z., Weeraman, C., Azam, M. S., Osman, E., Gibbs-Davis, J. The thermal reorganization of DNA immobilized at the silica/buffer interface: a vibrational sum frequency generation investigation. Physical Chemistry Chemical Physics. 17, 12452-12457 (2015).
  27. Lambert, A. G., Neivandt, D. J., Briggs, A. M., Usadi, E. W., Davies, P. B. Interference Effects in Sum Frequency Spectra from Monolayers on Composite Dielectric/Metal Substrates. Journal of Physical Chemistry B. 106, 5461-5469 (2002).
  28. Tong, Y., et al. Interference effects in the sum frequency generation spectra of thin organic films. I. Theoretical modeling and simulation. Journal of Chemical Physics. 133, 034704 (2010).
  29. McGall, S. J., Davies, P. B., Neivandt, D. J. Interference Effects in Sum Frequency Vibrational Spectra of Thin Polymer Films: An Experimental and Modeling Investigation. Journal of Physical Chemistry B. 108, 16030-16039 (2004).
  30. Li, B., et al. Interfacial Fresnel Coefficients and Molecular Structures of Model Cell Membranes: From a Lipid Monolayer to a Lipid Bilayer. Journal of Physical Chemistry C. 118, 28631-28639 (2014).
  31. Zhou, J., Anim-Danso, E., Zhang, Y., Zhou, Y., Dhinojwala, A. Interfacial Water at Polyurethane-Sapphire Interface. Langmuir. 31 (45), 12401-12407 (2015).
  32. Gautam, K. S., et al. Molecular Structure of Polystyrene at Air/Polymer and Solid/Polymer Interfaces. Physical Review Letters. 85 (18), 3854-3857 (2000).
  33. Yan, E. Y., Fu, L., Wang, Z., Liu, W. Biological Macromolecules at Interfaces Probed by Chiral Vibrational Sum Frequency Generation Spectroscopy. Chemical Reviews. 114, 8471-8498 (2014).
  34. Belkin, M. A., Kulakov, T. A., Ernst, K. H., Yan, L., Shen, Y. R. Sum-Frequency Vibrational Spectroscopy on Chiral Liquids: A Novel Technique to Probe Molecular Chirality. Physical Review Letters. 85, 4474 (2000).
  35. Rockwood, D. N., et al. Materials fabrication from Bombyx mori silk fibroin. Nature Protocols. 6, 1612-1631 (2011).

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Grenzflächenphysikalische Strukturen von Polymeren und Biomakromolekülen, die über sum frequency generation Vibrational Spectroscopy aufgedeckt werden
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Li, X., Ma, L., Lu, X. Interfacial… More

Li, X., Ma, L., Lu, X. Interfacial Molecular-level Structures of Polymers and Biomacromolecules Revealed via Sum Frequency Generation Vibrational Spectroscopy. J. Vis. Exp. (150), e59380, doi:10.3791/59380 (2019).

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