Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

В Vitro Увселицивание и Deubiquitination Анализы Нуклеосомальных Хистонов

Published: July 25, 2019 doi: 10.3791/59385
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1, 1, 1,2, 1,2
1Maisonneuve-Rosemont Hospital Research Center and Department of Medicine, University of Montréal, 2Lunenfeld-Tanenbaum Research Institute, Sinai Health System
* These authors contributed equally

Summary

Увселивание является посттрансляционной модификацией, которая играет важную роль в сотовых процессах и жестко координируется дезубикиции. Дефекты в обеих реакциях лежат в основе патологий человека. Мы предоставляем протоколы для проведения убликвитинации и реакции деубиктинации в пробирке с использованием очищенных компонентов.

Abstract

Увселицинация является пост-трансляционной модификацией, которая играет важную роль в различных сигнальных путях и особенно участвует в координации функции хроматина и днк-связанных процессов. Эта модификация включает в себя последовательное действие нескольких ферментов, включая E1 убиквитин-активизирующих, E2 убиквитин-конъюгирующие и E3 убиквитин-лигаза и вспять deubiquitinases (DUBs). Убиквитинация индуцирует деградацию белков или изменение белковой функции, включая модуляцию ферментативной активности, белково-белковое взаимодействие и субклеточную локализацию. Важным шагом в демонстрации убиквитина белка или деубиквитинации является выполнение реакций in vitro с очищенными компонентами. Эффективное убиквитивание и дезиквитинационирование реакций может быть в значительной степени влияет на различные компоненты, используемые, фермент ко-факторы, буферные условия, и характер субстрата.  Здесь мы предоставляем пошаговые протоколы для проведения убиквитинации и реакции на деубиквитивание. Мы иллюстрируем эти реакции с помощью минимальных компонентов мыши Polycomb Репрессивный комплекс 1 (КНР1), BMI1, и RING1B, E3 убиквитин лигаза, что моноубиквитинат гистон H2A на лизин 119. Деубицинация нуклеосомного H2A осуществляется с использованием минимального поликомб репрессивного deubiquitinase (PR-DUB) комплекс, образованный человека deubiquitinase BAP1 и DEUBiquitinase ADaptor (DEUBAD) домена своего кофактора ASXL2. Эти убиквитинации / deubiquitination анализы могут быть проведены в контексте либо рекомбинантных нуклеосом воссозданы с бактериями очищенных белков или родной нуклеосомы очищены от клеток млекопитающих. Мы выделяем тонкости, которые могут оказать значительное влияние на эти реакции, и предлагаем, чтобы общие принципы этих протоколов могли быть быстро адаптированы к другим убиквитинским лигазам И Дюбиквитиназа.

Introduction

Увселивание является одним из наиболее сохранимых пост-трансляционных модификаций и имеет решающее значение для широкого круга организмов, включая дрожжи, растения и позвоночных. Убиквитинация состоит из ковалентной привязанности убиквитина, высоко консервированных 76 аминокислот ный полипептид, для целевой белков и происходит в трех последовательных шагов с участием трех ферментов, т.е., E1-активизирующих, E2-конъюгии и E3 лигазы1, 2,3. Эта посттрансляционная модификация играет центральную роль в широком спектре биологических процессов. Действительно, Лигазы E3, которые обеспечивают специфику реакции, представляют собой большое суперсемейство ферментов и являются наиболее распространенными ферментами системы убиквитин4,5,6. Эффекты убиквитина белка в нистечении зависят от характера модификации: монобиквицинация, мультимонобиквитивание, линейная или разветвленная поликубиквициаляция. Монобиквитинация редко ассоциируется с протеасомальной деградацией, но вместо этого эта модификация участвует в посредничестве различных сигнальных событий. Полиубиквитинация включает в себя N-терминал или остатки лизин в самой молекуле убиквитин, и судьба полиубиквитинаированного белка зависит от того, какие остатки участвуют в расширении цепи убиквитин. Давно известно, что полиубиквитинация при посредничестве лизин 48 убиквитин вызывает протеасомальную деградацию. Напротив, полиубиквитинация через лизин 63 убиквитин часто ассоциируется с активацией белка7,8,9. Как и другие важные пост-трансляционные модификации, убиквитинация обратима, а удаление убиквитина из белков обеспечивается специфическими протеазами, называемыми deubiquitinases (DUBs), которые стали важными регуляторами клеточных процессов 2 , 10. Важно, что многие ДУБ являются узкоспециализированными, и регулировать, через deubiquitination, конкретные субстраты, указывая, что тонкий баланс между убиквитинации и деубиквитинации имеет решающее значение для функции белка. E3s и DUBs, наряду с протеаомой деградации машин и вспомогательных факторов, образуют Убиквитин Proteasome системы (UPS, с генами, с йgt;1200 генов), который регулирует основные пути сигнализации, некоторые из которых связаны с ростом клеток и пролиферации, Определение судьбы клетки, дифференциация, миграция клетки, и смерть клетки. Важно отметить, что дерегулирование нескольких сигнальных каскадов, связанных с убиквитинированием способствует опухолевому и нейродегенерационезу5,11,12,13, 14.

Убиквитинация играет всепроникающую роль в биологии хроматина и ДНК-зависимых процессах15,16,17. Например, монобиквицинирование гистона H2A на лизин 119 (далее H2A K119ub) является критической посттрансляционной модификацией, участвующей в транскрипционных репрессиях и репарации ДНК18,19,20, 21,22. H2A K119ub является катализатором Поликомб Репрессивный комплекс 1 (КНР1), который играет ключевую роль в поддержании эпигенетической информации и высоко сохраняется от drosophila к человеку. Канонические КНР1 состоит в частности, ПО RING1B и BMI1, которые являются ядром E3 убиквитин лигаза комплекса, ответственного за вышеупомянутое событие вездесущности22,23. В Drosophila, H2A монобиквицинация (H2A K118ub, который соответствует H2A K119ub у млекопитающих) меняется DUB Calypso, который взаимодействует с дополнительной секс гребень (ASX) формирования Поликомб-репрессивных DUB (PR-DUB) комплекс24. Орфога цимбаты калипсо, BAP1, является супрессор опухоли удалены или инактивированы в различных злокачественных новообразований человека25,26,27,28, 29 , 30 год , 31 год , 32 год , 33. BAP1 регулирует ДНК-зависимые процессы в ядре и кальций-сигналоцитов опосредованного апоптоза в эндоплазмической ретикулум33,34,35,36, 37 , 38 , 39 , 40 г. , 41 год , 42. BAP1 собирает многодефицитные белковые комплексы, содержащие регуляторы транскрипции, в частности ASXL1, ASXL2 и ASXL3 (ASXLs), три ортологи ASX38,43. ASXLs использовать DEUBiquitinase ADaptor (DEUBAD) домен, также называется ДОмен ASXM, чтобы стимулировать BAP1 DUB деятельности35,36,44. Таким образом, ASXLs играют важную роль в координации активности BAP1 DUB при хроматине и в более широком смысле его функции супрессора опухоли.

Существует несколько методов изучения процессов повсеместного и деубиктивизации. Примечательно, что биохимические анализы с использованием белков, очищенных от бактерий, остаются очень мощными в демонстрации прямого убиквитина или удаления убиквитина из конкретных субстратов. Эти эксперименты могут быть проведены для изучения ряда параметров, таких как определение требования минимальных комплексов, определение кинетических реакций, определение структуры / функциональных отношений, а также понимание влияния патологических генных мутаций. Здесь мы предоставляем протоколы для проведения убиквитинации и дезюквитинационных реакций на хроматина субстратах с очищенными компонентами. В качестве модели системы представлена увселивания в пробирке и деубиктивирование нуклеосомального белка H2A. Бактерии очищенные белки, собранные в минимальных комплексах RING1B/BMI1 и BAP1/DEUBAD, используются для убликвитина или деубиктинации нуклеозомального H2A, соответственно.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. GSH-агарозс сродство Очистка GST-RING1B (1-159)-BMI1 (1-109) E3 Ubiquitin Ligase комплекс

  1. Используйте pGEX6p2rbs-GST-RING1B (1-159 аа) - ИМТ1 (1 -109aa) выражение бактерий построить для преобразования BL21 (DE3) бактерий (см. Таблица материалов)23. Эта конструкция позволяет выражение мины RING1B домена 1-159 слиты с доменом BMI1 1-109 с тегом GST в pGEX-6P-2 позвоночника.
  2. Выполните ночь стартер культуры путем прививки RIL-бактерий, выражающих GST-RING1B (1-159 аа) - BMI1 (1 -109 аа) в 20 мл LB бульон амфибу среды в присутствии 100 мкг /мЛ ампициллин и 50 мкг /мл хлорамфеникол. Инкубировать, встряхивая при 37 градусах Цельсия в одночасье. На следующий день добавьте стартерную культуру в колбу 1 л, содержащую 500 мл свежего бульона LB (1/26 разбавления) с ампициллином и инкубировать культуру в шейкере при 37 кв. м на 2 -4 ч.
  3. Во время инкубации измерьте ОД на уровне 600 нм с помощью спектрофотометра. Когда культура бактерий достигает 0,6 ЕДИНИЦ OD на 600 нм, возьмите 1 мл aliquot в трубке 1,5 мл в качестве неиндуцированного образца. Добавьте 400 мкм изсопропила -D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) в культуру 1 Л, чтобы вызвать экспрессию белка. Инкубировать бактерии при 25 градусах По цельсии в течение 6 ч до ночи.
    1. Centrifuge 1 мл aliquots на 14000 х г в течение 30 с, отбросить супернатант, приостановить гранулы в 200 л из буфера образца Laemmli, и сохранить для SDS-PAGE и Coomassie синий анализ индукции белка.
  4. Перенесите индуцированную культуру бактерий из колбы в чистую бутылку центрифугации и вращайтесь на 3500 х г в течение 15 мин при 4 градусах Цельсия. Откажитесь от супернатанта и resuspend гранулы с 40 мл холодного PBS и спина вниз на 3500 х г в течение 15 минут при 4 градусах Цельсия.
  5. Отбросьте супернатант и заморозьте гранулы при -80 градусов по Цельсию или переходите к следующему шагу. Если белки индуцируются при ожидаемом молекулярном весе, переходим к следующему шагу.
  6. Resuspend гранулы бактерий в 25 мл ледяного лисисбуфера A (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 мМ NaCl, 1 мМ EDTA, 1% NP40, 1 мМ PMSF, 0,5 мМ DTT, и 1/100 анти-протеазный коктейль, содержащий AEBSF, Aprotinin, Бестатин, E-64, Leupeptin, и Пепстатин A). Убедитесь, что все гранулы бактерий повторно. PMSF и анти-протеазный коктейль должны быть свежедобавлены в буфер лиза, только во время лиза бактерий.
    ПРЕДЕКТО: Всегда держите образец на льду.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Лизозим на 100 мкг/мл может быть добавлен для повышения бактерий лиза.
  7. Инкубировать бактерии лизат на льду в течение 15 мин. Используйте зонд звуковой и соникета на 70% выходной амплитуды для 30 s (4-5x), а затем центрифуга на 21000 х г в течение 20 мин при 4 градусах по Цельсию.
    ПРЕДЕКТО: Во время звуковости всегда держите образцы на льду.
  8. Во время центрифугации, возьмите 500 кЛ упакованных GSH-агарозбий (50% шлам) в трубке 15 мл и добавить 10 мл буфера Без PMSF и анти-протеазы. Смешайте кратко и спина на 2500 г в течение 3 мин при 4 градусах Цельсия, повторите этот шаг мыть еще два раза и держать бисер на льду.
  9. После бактериального центрифугирования лизата соберите супернатант и перенесите его в коническую трубку 50 мл. Возьмите аликот 100 л в качестве общего лизата и добавьте 100 зл и 2x буфера образца Laemmli для анализа SDS-PAGE и Coomassie blue.
  10. Фильтр лизат через 0,45 мкм поры шприц фильтр и смешать его с GSH бусы. Инкубировать при 4 градусах Цельсия с встряхиванием в течение 5 ч. Спин вниз бисера на 2500 х г в течение 3 мин, удалить, и сохранить супернатант, как поток через. Вымойте белки-GSH связаны бусы 6 раз (5 мл каждый) с буфером, содержащим анти-протеаз коктейль и PMSF.
  11. После последней стирки перенесите бусины вместе с 10 мл буфера в пустую колонку хроматографии, добавьте 1,5 мл буфера А, содержащего 25 мМ глутатиона, и соберите elution гравитацией в микротрубки 1,5 мл. Повторите процедуру elution 4 раза.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор запасов Глютатион готовится при концентрации 200 мМ в 50 мм Tris-HCl, pH 7.5
  12. Возьмите аликвот по 10 л от каждого из 4 elutions и добавьте 10 зл и 10 зл 2x буфера образца Laemmli. Эти образцы будут использоваться для анализа синего цвета SDS-PAGE и Coomassie для определения наличия и чистоты очищенных белков.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После последнего elution, держать бусы в буфере на 4 кв КС для переработки и будущего использования.
  13. Выберите eluted фракции, показывающие разумное количество очищенных белков для дальнейшего анализа. Сделать небольшие aliquots препарата. Храните очищенные белки при -80 градусов по Цельсию. Как правило, концентрация белка будет варьироваться от 0,5 мкг до 2 мкг на МЛ и образцы могут храниться в этом состоянии.
  14. ФАКТИВ: Сконцентрируйте образец или измените буфер с помощью центробежного фильтра 10K

2. Очистка комплекса deub1/DEUBAD (ASXL2)

  1. Используйте pET30a-His-BAP138 и pDEST-MBP-DEUBAD (ASXL2)35 бактериальных выражений конструкций для преобразования BL21 (DE3) RIL бактерий для производства его-BAP1 и MBP-DEUBAD соответственно.
  2. Выполните две отдельные ночные стартовые культуры, инкубируя Его-BAP1 и MBP-DEUBAD (ASXL2), выражая бактерии в 20 мл бульона LB ампициллина, содержащего 50 мкг/мл хлорамфеникол и соответствующий антибиотик для каждой плазмиды, 100 мкг/ мЛ канамицина или 100 мкг/мл ампициллина соответственно. Поместите на шейкер при 37 градусах Цельсия.
  3. Выполните шаги 1.3-1.6.
  4. Отдохните гранулы бактерий в 25 мл ледяного лисисного буфера B (50 мм Tris pH 7,3, 500 мМ NaCl, 3 мМ-Меркаптоэтанол, 0,2% Тритон X-100, 1 мм PMSF и 1/100 анти-протязный коктейль). Смешайте равные объемы His-BAP1 с lysates MBP-DEUBAD и инкубировать на льду в течение 15 мин. Соникат, а затем центрифугии lysate, как указано в протоколе 1 (шаг 9).
    1. Во время центрифугации, подготовить 500 л упакованы Ni-NTA агарозные бусы (50% суспензии), промывая их три раза с буфером B без PMSF и анти-протеазкоктейль коктейль.
  5. После бактериального центрифугирования лизата соберите супернатант и перенесите его в коническую трубку 50 мл. Возьмите аликот 100 л в качестве общего лизата и добавьте 100 зл и 2x буфера образца Laemmli для анализа SDS-PAGE и Coomassie blue.
  6. Фильтр лизат через 0,45 мкм поры шприц фильтр и смешать его с Ni-NTA бусы. Инкубировать при 4 градусах Цельсия с тряской в течение 5 ч. Спин вниз бисера на 2500 х г в течение 3 мин, удалить, и сохранить супернатант, как поток через.
    1. Вымойте бисер 6 раз (5 мл каждый) с буфером B, содержащим 20 мМ 1,3-Диаза-2,4-циклопентадиен (Имидазол).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сделать складе решение 2 M имидазола на рН 7.3.
  7. После последней стирки перенесите бусы с 10 мл буфера в пустую колонку хроматографии, добавьте 1 мл буфера B, содержащий 200 мМ Имидазола, и соберите elution под действием силы тяжести в микротрубки 1,5 мл, содержащие 10 мл DTT (500 мМ) и 2 л EDTA (500 мМ) , рН: 8). Повторите процедуру elution 4 раза. Возьмите 10 зл и часть каждой долиции и добавьте 10 зл 2x буфера образца Laemmli для анализа SDS-PAGE и Coomassie blue. Объедините желаемые неотвратиемые фракции.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Храните бусы в буфере при 4 градусах По Цельсию для переработки и использования в будущем.
  8. Разбавить элетированный комплекс 3 раза буфером C (50 мм Tris pH 7.3, 300 mM NaCl, 1% Triton X-100, 5 мМ DTT, 1 мМ EDTA, 1 мМ PMSF, и 1/100 протеазы ингибитор коктейль) до инкубации с amylose agarose beads.
    1. Подготовка амилозы агарозбий (500 л упакованы), промывая их 2 раза с буфером C без добавления PMSF и анти-протеазный коктейль. Добавьте бусины к разбавленной elution и инкубировать на ночь при 4 градусах Цельсия.
  9. Центрифуга на 2500 х г в течение 3 мин и держать поток до конца. Вымойте белки-границы бисера с 5 мл буфера C (5-6x).
  10. Храните очищенный комплекс His-BAP1/MBP-DEUBAD на амилоза агаросе бусинв в буфере D (50 мМ HEPES pH 8.0, 50 mM NaCl, 10% Глицерол, и 1 мМ DTT) и храните при -80 градусов по Цельсию. Возьмите 20 л.с. фракции бисера (50% раствора бисера) и добавьте 20 зл 2x буфера образца Laemmli для анализа SDS-PAGE и Coomassie blue.

3. Очистка нуклеосом от клеток HEK293T

  1. Культура HEK293T клеток в полной Dulbecco в модифицированной среде Eagle (DMEM) дополнен5% новорожденных сыворотки теленка (NBS), 2 мМ L-глутамин, и 1% пенициллин / стрептомицин.
  2. Плита около 12 х 106 HEK293T клеток в 20 мл полного средства массовой информации на 15 см культуры блюдо за день до трансфекции (10 блюд были использованы). Перед трансфекцией, изменить среду клетки до 12 мл среды без сыворотки и трансфектать клетки с 21 мкг pCDNA-Flag-H2A с помощью 63 л полиэтиленина (PEI) на 1 мг/мл36. Изменение для завершения среднего 12 ч позже.
  3. Три дня после трансфекции, мыть клетки с 15 мл ледяной PBS (дважды) и собрать их в 3 мл ледяной PBS с помощью клеточного скребок. Центрифуга при 2100 х г в течение 8 мин при 4 градусах По цельсию. Откажитесь от PBS и перейдите к шагу лиза или заморозьте клеточные гранулы при -80 градусов по Цельсию.
  4. Resuspend клеточной гранулы примерно в 10 томах буфера E (50 мм Tris-HCl pH 7.3, 420 mM NaCl, 1% NP-40, 1 mM MgCl2, 1 мМ PMSF, 1/100 протеазио ингибитор коктейль, и 20 мм N-метилмалеймид (NEM) N-метилмалеймид (NEM) имеет решающее значение для ингибирования DUBs, которые совместно очищают с нуклеосомами.
  5. После центрифугирования при 3000 х г в течение 5 мин, отбросить супернатант и resuspend хроматина гранулы в 10 томов буфера E. Mix путем инверсии и центрифуги на 3000 х г в течение 5 мин.
    1. Повторите шаг мытья в другой раз с помощью буфера E и два раза с помощью буфера F "MNase Buffer" (20 мМ Tris-HCl pH 7.5, 100 mM KCl, 2 мМ MgCl2, 1 мМ CaCl2, 0,3 М сахарозы, 0,1% NP-40, 1 мМ PMSF, и 1/100 промеляк коктейль).
      ПРЕДЕКТО: Пелле будет плавать во время стирки и центрифугации.
  6. Приостановите работу хроматина в 5 мл буфера F и обработайте гранулы микрококковой нуклеазой (MNase) (3 U/mL в течение 10 минут при комнатной температуре).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Реакции можно помочь путем смешивания с помощью Dounce Homogenizer.
  7. После инкубации возьмите 40 qL aliquot смеси для анализа нуклеосомальных фрагментов ДНК. Смешайте этот аликот с 40 зл фенола / хлороформа и 20 Зл 6x ДНК-буфер агнатуры, вихрь, спина на 18000 х г в течение 2 мин, и загрузить ДНК на 2% агароса гель.
    1. Когда ДНК преимущественно 147 bp фрагмент, соответствующий мононуклеосомы, остановить реакцию, добавив 5 мМ EDTA в окончательной концентрации.
  8. После центрифугации при 21 000 х г в течение 20 мин при 4 градусах Цельсия, инкубировать растворимые фракции хроматина с анти-флаг афарсной мелина на ночь при 4 градусах Цельсия. Вымойте бусины с 6x Buffer G (50 мм Tris-HCl, рН 7,3, 5 мМ EDTA, 150 мМ NaCl, 1% NP-40, 1 мМ PMSF, 1 мМ DTT, 1/100 протеазы ингибиторы коктейль).
  9. Перенесите бусины с 5 мл буфера G в пустую колонку хроматографии. Выясните пчело-связанные нуклеосомы с 200 мкг/мл пептида флага elution. Используйте буфер elution, состоящий из буфера G, содержащего 200 мкг/мЛ пептических пептидов флага (см. ТаблицаМатериалов) и 1/5 (vol:vol) 1 M Tris, pH 8.0. Выясните нуклеосомы 3x с 260 Злфлаг elution буфера (2 ч каждого elution).
  10. Проверьте 3 elutions, принимая аликот для экстракции фенола хлороформа и загрузить ДНК в 2% агарозный гель. Возьмите 10 зликат каждой фракции elution и добавьте 10 злициев образца буфера Laemmli 2x для sDS-PAGE и Coomassie синий анализ и загрузить каждый elution для западного blot обнаружения вездесущего H2A. Храните elution при -80 градусах по Цельсию. В целом, очищение от клеток человека дает меньшее количество белков, чем от бактерий, с концентрацией от 0,1 до 0,5 мкг /Л.

4. Нуклеозомонная увселипинья асссс с использованием ИМТ1/РИНГ1B E3 Убиквитин Лигазе комплекс

  1. Центрифуга нуклеосомы через 10K пор 0,5 мл центробежных фильтров, чтобы изменить субстрат из элютионного буфера в буфер реакции H (25 мм Трис, рН 7,5; 10 мМ MgCl2, и 5 мМ ATP). Кроме того, коммерчески доступные нуклеосомы могут быть использованы для асссе.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Изменение суспензии субстрата на буфер реакции обеспечивает воспроизводимость и предотвращает потенциальное ингибирование E3 лигаза соединениями, присутствующими в смеси elution Flag.
  2. Инкубировать 1 мкг нуклеосом в 40 л общего объема буфера H. Добавьте фермент Ub Activating (UBE1) (250 нг), Ub (50 нг/Л) и E2 Ub-конъюгирующие ферменты (672 нг) и 1 мкг комплекса BMI1/RING1B E3 ubiquitin ligase. Инкубировать реакцию в течение 3 ч при 37 градусах Цельсия с редкими встряхивания.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Параллельно может осуществляться несколько элементов управления, включая опускание, E1, E2, E3, ATP и убиквитин. Это обеспечивает специфичность реакции вездесущности.
  3. Остановите реакцию, добавив 40 qL 2x буфера образца Laemmli и проанализируйте убиквитивирование гистона H2A K119 с помощью SDS-PAGE и западного промокания, в соответствии со стандартными процедурами. Используйте анти-H2A или анти-H2A K119ub антитела (см. Таблица материалов).

5. В vitro Nucleosomal H2A DUB Анализ с использованием BAP1/DEUBAD

  1. Используйте очищенные нуклеосомы для анализа дезиквитинации in vitro. Отдохните 100-500 нг нуклеосом в 40 мл буфера I (50 мм Tris-HCl, рН 7,3, 1 мМ MgCl2, 50 мм NaCl, и 1 мм DTT). Добавьте 1 мкг бактерий BAP1, очищенных его-BAP1 и MBP-DEUBAD. Выполняй реакцию деубиквитинации в течение 3 ч при 37 градусах Цельсия при случайном встряхивании.
  2. Остановите реакцию in vitro, добавив 40 qL 2x буфера Laemmli и проанализируйте с помощью иммуноблоттинга.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Белки GST-BMI1 и RING1B хорошо вырабатываются в бактериях и могут быть легко извлечены в растворимых фракциях. На рисунке 1A показано синее окрашивание Coomassie для типичной очистки комплекса GST-BMI1-RING1B. Полосы GST-BMI1 и RING1B мигрируют при ожидаемом молекулярном весе, 45 кДа и 13 кДа соответственно. Примечательно, что комплекс лигазов E3 очень однороден с очень низким уровнем загрязняющих веществ белков бактерий и/или продуктов деградации. Кроме того, стойохиометрия очищенного комплекса является оптимальной, так как при соотношении моляров 1:1 интенсивность полосы белка GST-RING1B, как ожидается, будет в два-три раза сильнее, чем у ИМТ1. Аналогичным образом, очистка комплекса His-BAP1/MBP-DEUBAD также привела к относительно высокооднородным препаратам с полосами на 90 кДА и 55 кДа, соответственно(рисунок 1B). Тандемсссии очистки BAP1 и DEUBAD, через никель-агароз и амилоза-агароз соответственно обеспечивает и адекватной стоихиометрии и удаление свободного BAP1 из очищенного комплекса. С другой стороны, очищенная нуклеосомальная фракция по существу состоит из 147bp диапазон, указывающий на наличие высокообогащенной мононуклеосомальной фракции(рисунок 1C). Coomassie синий окрашивания этих очищенных нуклеосом показывает типичный шаблон полосы из четырех гистоновых подразделений со стойхиометрические количества(Рисунок 1D). Коммерчески доступные рекомбинантные мононуклеосомы также отображают аналогичные модели белка и ДНК при мигрировании на SDS-PAGE и гели агарозы соответственно. Следует отметить, что моноубикинетинированные формы H2A и Flag-H2A можно легко отличить на очищенных нуклеосомах HEK293T. Мы использовали рекомбинантные нуклеосомы вместе с E1/E2/Ubiquitin/ATP и заметили, что убиквитинация гистона H2A с комплексом BMI1-RING1B показывает временное увеличение убиквитинаированной формы белка, в то время как уровни неизмененной формы одновременно уменьшилось. Реакция вездесущности является общей, так как практически все белки H2A преобразуются в H2A K119ub(рисунок 1E). С другой стороны, дезобиквитинационный ассоциатив был проведен на родных нуклеосомомы. После инкубации этих нуклеосом с BAP1/DEUBAD, мы наблюдали время-зависимое-сокращение сигнала H2A K119ub(рисунок 1F). Обратите внимание, что две полосы вездесущего H2A, наблюдаемые с анти-H2A K119ub, соответствуют трансзараженным диапазонам Flag-H2A и эндогенной H2A, мигрирующей на диапазонах 30 кДА и 25 кДА соответственно.

Figure 1
Рисунок 1: Очищение, повсеместное и деубиктивирование. (A) Очистка белков GST-RING1B-BMI1 и анализ с использованием голубого окрашивания Coomassie. GST-RING1B-BMI1 были произведены в бактериях и очищены с помощью gst сродство бусины. Для подтверждения чистоты очищения и размера белков, elutions были загружены на 15% SDS-PAGE гель и окрашенные с Coomassie синий. Для определения количества белка используется различное количество BSA. Окрашенный гель был отсканирован для создания фигуры. (B) Очистка комплекса MBP-DEUBAD/His-BAP1. MBP-DEUBAD и HIS-BAP1 были произведены отдельно в бактериях. После лисиса MBP-DEUBAD и HIS-BAP1 были смешаны и очищены с использованием никеля и мальтоза. Очищенный комплекс был загружен на 8% Гель SDS-PAGE и окрашены с Coomassie синий. (C) Очищение мононуклеосомы после лечения MNase. Хроматин из HEK293T, выражающий pcDNA.3 Флаг-H2A был извлечен и обработан MNase для генерации и очищения мононуклеосом. Для подтверждения генерации мононуклеосомного, часть хроматина была взята для экстракции фенола хлороформа и обнаружения при ультрафиолетовом свете. Загрузка на 2% агарозный гель показывает типичный 147 базовых пар фрагмент ДНК свидетельствует о мононуклеосом. (D) Очищенные мононуклеосомы были использованы для Coomassie синий окрашивания. (E) In vitro увселиление нуклеосом. Рекомбинантные нуклеосомы были инкубированы при 37 градусах Цельсия с бактериальным испометным E3 ubiquitin ligase dimer, GST-RING1B/BMI1 и E1/E2/ATP/Ubiquitin, для указанного времени. Моноубики (H2A K119ub) был проанализирован западным блоттингом. (F) Deubiquitination асссhH2A K119ub с использованием BAP1/DEUBAD deubiquitinase комплекса. В пробирке deubiquitination анализы были проведены с использованием бактерий очищенных Его-BAP1/MBP-DEUBAD и млекопитающих очищенных нуклеосом. Реакция была сделана для indicted времен и проанализирована западным blotting. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2: Контроль и обзор протокола. (A) Очищенные млекопитающих BAP1 или его каталитического мертвого мутанта (C91S), а также бактерии очищенных рекомбинантных BAP1 были использованы для H2A deubiquitination на нуклеосомах. Нуклеосомы, инкубированные буфером в одиночку или с помощью elutions, полученных от макета очищения были также включены в качестве контроля. (B) BAP1 не деубицицить H2A K13/K15 которого вездесущность опосредовано RNF168 E3 ligase. Клетки HEK293T были совместно трансфицированы либо H2A K13R/K15R или H2A K118R/K119R вместе с RNF168 для обеспечения повсеместного убликвитирования остатков K13/K15. Очищенные нуклеосомы использовались для дезюквитивания комплексами BAP1. Реакция была остановлена в разное время и подвергнута иммуноблоттингу. (C) Очищение неубиквитинаированных и моноубиквитина DEUBAD в комплексе с BAP1 из клеток млекопитающих. Очищенный комплекс использовался для дезиквитинации на нуклеосомальном H2A K119ub. Реакция была сделана для указанных точек времени и проанализирована западным blotting. (D) BAP1 deubiquitinates H2A K119ub in vivo. Клетки HEK293T были совместно трансинфицированы мутантами H2A или H2A (H2A K118R, K119R, K118R/K119R или K13R/K15R) наряду с конструкциями BAP1 и ASXL2. Два дня после трансфекции, клетки были собраны для иммуноблоттинга с использованием указанных антител. (E) Схематическое представление экспериментального рабочего процесса. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Есть несколько преимуществ создания надежных in vitro убиквитинации и дезиквитинации анализы для белков, представляющих интерес. Эти анализы могут быть использованы для: (i) установить оптимальные условия и определить минимальную потребность в этих реакциях, (ii) определить ферментативные кинетические и биохимические константы, (iii) определить роли кофакторов или ингибиторов, которые могут повлиять на эти реакции, (iv) определить взаимодействия интерфейсов, v) проверить влияние искусственных или связанных с болезнью мутаций и (vi) установить анализ условий, которые могут быть дополнительно использованы для разработки высокой пропускной химический скрининг анализов. Здесь мы иллюстрируют эти анализы, описывая, как мы выполняем BMI1/RING1B-опосредованный H2A вездесущность и BAP1/ASXL-опосредованный H2A deubiquitination на нуклеосомных субстратов.

Убиквитинация гистона H2A может быть повторена в пробирке с использованием минимальных компонентов, так как почти полное убивитое H2A можно наблюдать с помощью комплекса BMI1-RING1B. Следует отметить, что эта реакция проводится на рекомбинантных нуклеосомомы. Они имеют то преимущество, что свободны от других гистонов пост-трансляционных модификаций, которые происходят в клетках млекопитающих. Тем не менее, убиквитинационная реакция также может быть эффективно проведена на родных нуклеосомомы. Если реакция убиквитинации слаба, соотношение ферментов по сравнению с субстратами может быть увеличено для наблюдения оптимальной перевязки убиквитина. Следует отметить, что если deubiquitination реакции или взаимодействия анализы должны быть проведены после субстрата убиквитинации, то убиквитинация может быть непосредственно проведена на бисера связаны субстратов. Убиквитинатированный субстрат может быть восстановлен путем вытягивания вниз и супернатант, содержащий компоненты реакции убиквитинации могут быть отброшены. Однако, когда ферменты должны быть установлены, ферменты должны быть eluted и стойохиометрии компонентов оценивается по размеру исключения хроматографии.

Реакция деубиктинации требует меньше компонентов, чем реакция вездесущности. Тем не менее, очистка только DEUBAD обычно приводит к протеиновым осадкам. Важно отметить, что, когда DEUBAD очищается с BAP1, это значительно увеличивает его растворимость. Следует отметить, что мы предлагаем проводить дезиквитинационные анализы с различными количествами субстрата и ферментного комплекса. Реакцию деубиквитинации может ингибировать избыточное количество хроматина, что, вероятно, может быть объяснено повышенными концентрациями ингибиторов, связанных с нуклеосомами. Мы также наблюдали deubiquitination с избытком свободного BAP1. Таким образом, несколько элементов управления должны быть включены, такие как инкубации нуклеосом с BAP1 в одиночку(рисунок 2A). Важно также отметить, что некоторые DUBs может совместно очистить с хроматином, и даже если мы лечим хроматин с NEM, DUBs может быть частично активированпосле после добавления DTT, который уменьшает каталитический цистеин. Кроме того, металлопротеиназа DUBs также может присутствовать, и эти ферменты нечувствительны к NEM и, таким образом, не ингибируется. Таким образом, дополнительные средства контроля должны быть включены, состоящие только из нуклеосом без добавления ферментов и DUB каталитического мертвого мутанта(рисунок 2A). Следует отметить, что специфика активности BAP1 DUB по отношению к H2A K119ub хорошо документирована и была подтверждена в наших условиях исследования. Мы очищены от нуклеосом HEK293T клеток, выражающих либо H2A K118/K119R, либо H2A K13/K15R. Выражение RNF168 приводит к важному вездесущности на K13/K15. Активность BAP1 DUB наблюдается только на нуклеосомоне, содержащей H2A K13/K15R, соответствующую H2A K119ub(рисунок 2B). Другим соображением является то, что пост-переводные изменения, которые могут иметь решающее значение для ферментатической деятельности, скорее всего, не будут присутствовать в бактериальных белках. Таким образом, в пробирке реакции с использованием компонентов, очищенных от клеток млекопитающих также может рассматриваться35. Например, моноубикиdирование DEUBAD, процесс наблюдается в высших эукариот, в значительной степени способствовать deubiquitinase деятельности BAP135 (Рисунок 2C). Таким образом, можно было бы также рассмотреть вопрос об очищении компонентов из клеток млекопитающих. В дополнение к реакции in vitro, можно контролировать активность BAP1 DUB непосредственно в клетках после трансфекции. Например, трансфекция клеток HEK293T с конструкцией H2A может дать четкий сигнал H2A K119ub из-за его изобилия в клетках. В этих условиях, большинство повсеместнопроисходит на остатках K118/K119, так как мутация этих участков аргинина приводит к полному отсутствию убиквитина H2A (Рисунок 2D). Совместное выражение BAP1 и ASXL2 вместе с H2A позволяет заключить на BAP1 DUB активность в клетках. Однако несколько моментов следует рассматривать как переэкспрессию, что может привести к ошибочным результатам. Таким образом, эти эксперименты должны быть оптимизированы и хорошо контролироваться.

Таким образом, протоколы, описанные здесь, резюмируемые на рисунке 2E, являются простыми, не требуют специализированной инфраструктуры или экспериментальной установки, и могут быть масштабированы для производства значительного количества модифицированных нуклеосом для нескольких применения вниз по течению, включая ферментативные анализы, масс-спектрометрию и белково-белковые анализы взаимодействия.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не заявляют о каких-либо конкурирующих финансовых интересах.

Acknowledgments

Мы благодарим Диану Аджауд за техническую помощь. Эта работа была поддержана грантами Совета по естественным наукам и инженерным исследованиям Канады (2015-2020), Genome Квебек (2016-2019) и Genome Canada (2016-2019) Э.Б.Б.А. является старшим научным сотрудником Фонда Речерче дю Квебек-Санте (ФРЗ-С). Л.М. и Н.С.К. имеют докторскую стипендию от ФРЗ-С. Г.Б. получил докторскую стипендию от Министерства высшего образования и научных исследований Туниса и Фонда Коула.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amylose agarose beads New England Biolabs #E8021
Amicon Ultra 0.5 mL centrifugal filters 10K Sigma-Aldrich #UFC501096
Anti-H2AK119ub (H2Aub) Cell Signaling Technology #8240
Anti-Flag-agarose beads Sigma-Aldrich #A4596
Anti-protease cocktail Sigma-Aldrich #P8340
BL21 (DE3) CodonPlus-RIL bacteria Agilent technologies #230240
DMEM Wisent #319-005-CL
Empty chromatography column Biorad #731-1550
Flag peptide Sigma-Aldrich #F3290
GSH-agarose beads Sigma-Aldrich #G4510
HEK293T ATCC #CRL-3216
Imidazole Sigma-Aldrich #I5513
Micrococcal nuclease (MNase) Sigma-Aldrich #N3755
Ni-NTA agarose beads ThermoFisher Scientific #88221
N-methylmaleimide (NEM) Bioshop #ETM222
Pore syringe filter 0.45 μm Sarstedt #83.1826
Polyethylenimine (PEI) Polysciences Inc #23966-1
pGEX6p2rbs-GST-RING1B(1-159)-Bmi1(1-109) Addgene #63139
Ub Activating Enzyme (UBE1) Boston Biochem #E-305
UBCH5C (UBE2D3) Boston Biochem #E2-627

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ye, Y., Rape, M. Building ubiquitin chains: E2 enzymes at work. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 755-764 (2009).
  2. Komander, D., Clague, M. J., Urbe, S. Breaking the chains: structure and function of the deubiquitinases. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 550-563 (2009).
  3. Ciechanover, A. The unravelling of the ubiquitin system. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16, 322-324 (2015).
  4. Nakayama, K. I., Nakayama, K. Ubiquitin ligases: cell-cycle control and cancer. Nature Reviews Cancer. 6, 369-381 (2006).
  5. Senft, D., Qi, J., Ronai, Z. A. Ubiquitin ligases in oncogenic transformation and cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 18, 69-88 (2018).
  6. Zheng, N., Shabek, N. Ubiquitin Ligases: Structure, Function, and Regulation. Annual Review of Biochemistry. 86, 129-157 (2017).
  7. Iwai, K., Fujita, H., Sasaki, Y. Linear ubiquitin chains. NF-kappaB signalling, cell death and beyond. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15, 503-508 (2014).
  8. Kulathu, Y., Komander, D. Atypical ubiquitylation - the unexplored world of polyubiquitin beyond Lys48 and Lys63 linkages. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13, 508-523 (2012).
  9. Yau, R., Rape, M. The increasing complexity of the ubiquitin code. Nature Cell Biology. 18, 579-586 (2016).
  10. Mevissen, T. E. T., Komander, D. Mechanisms of Deubiquitinase Specificity and Regulation. Annual Review of Biochemistry. 86, 159-192 (2017).
  11. Bedford, L., Lowe, J., Dick, L. R., Mayer, R. J., Brownell, J. E. Ubiquitin-like protein conjugation and the ubiquitin-proteasome system as drug targets. Nature Reviews Drug Discovery. 10, 29-46 (2011).
  12. Minton, K. Inflammasomes: Ubiquitin lines up for inflammasome activity. Nature Reviews Immunology. 14, 580-581 (2014).
  13. Popovic, D., Vucic, D., Dikic, I. Ubiquitination in disease pathogenesis and treatment. Nature Medicine. 20, 1242-1253 (2014).
  14. Upadhyay, A., Amanullah, A., Chhangani, D., Mishra, R., Mishra, A. Selective multifaceted E3 ubiquitin ligases barricade extreme defense: Potential therapeutic targets for neurodegeneration and ageing. Ageing Research Reviews. 24, 138-159 (2015).
  15. Hammond-Martel, I., Yu, H., Affar el, B. Roles of ubiquitin signaling in transcription regulation. Cellular Signalling. 24, 410-421 (2012).
  16. Schwertman, P., Bekker-Jensen, S., Mailand, N. Regulation of DNA double-strand break repair by ubiquitin and ubiquitin-like modifiers. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17, 379-394 (2016).
  17. Uckelmann, M., Sixma, T. K. Histone ubiquitination in the DNA damage response. DNA Repair. 56, 92-101 (2017).
  18. Robzyk, K., Recht, J., Osley, M. A. Rad6-dependent ubiquitination of histone H2B in yeast. Science. 287, 501-504 (2000).
  19. Hwang, W. W., et al. A conserved RING finger protein required for histone H2B monoubiquitination and cell size control. Molecular Cell. 11, 261-266 (2003).
  20. Kim, J., Hake, S. B., Roeder, R. G. The human homolog of yeast BRE1 functions as a transcriptional coactivator through direct activator interactions. Molecular Cell. 20, 759-770 (2005).
  21. Wood, A., et al. an E3 ubiquitin ligase required for recruitment and substrate selection of Rad6 at a promoter. Molecular Cell. 11, 267-274 (2003).
  22. Wang, H., et al. Role of histone H2A ubiquitination in Polycomb silencing. Nature. 431, 873-878 (2004).
  23. Buchwald, G., et al. Structure and E3-ligase activity of the Ring-Ring complex of polycomb proteins Bmi1 and Ring1B. The EMBO Journal. 25, 2465-2474 (2006).
  24. Scheuermann, J. C., et al. Histone H2A deubiquitinase activity of the Polycomb repressive complex PR-DUB. Nature. 465, 243-247 (2010).
  25. Jensen, D. E., et al. BAP1: a novel ubiquitin hydrolase which binds to the BRCA1 RING finger and enhances BRCA1-mediated cell growth suppression. Oncogene. 16, 1097-1112 (1998).
  26. Harbour, J. W., et al. Frequent mutation of BAP1 in metastasizing uveal melanomas. Science. 330, 1410-1413 (2010).
  27. Abdel-Rahman, M. H., et al. GermLine BAP1 mutation predisposes to uveal melanoma, lung adenocarcinoma, meningioma, and other cancers. Journal of Medical Genetics. , (2011).
  28. Bott, M., et al. The nuclear deubiquitinase BAP1 is commonly inactivated by somatic mutations and 3p21.1 losses in malignant pleural mesothelioma. Nature Genetics. 43, 668-672 (2011).
  29. Goldstein, A. M. GermLine BAP1 mutations and tumor susceptibility. Nature Genetics. 43, 925-926 (2011).
  30. Testa, J. R., et al. GermLine BAP1 mutations predispose to malignant mesothelioma. Nature Genetics. 43, 1022-1025 (2011).
  31. Wiesner, T., et al. GermLine mutations in BAP1 predispose to melanocytic tumors. Nature Genetics. 43, 1018-1021 (2011).
  32. Dey, A., et al. Loss of the tumor suppressor BAP1 causes myeloid transformation. Science. 337, 1541-1546 (2012).
  33. Pena-Llopis, S., et al. BAP1 loss defines a new class of renal cell carcinoma. Nature Genetics. 44, 751-759 (2012).
  34. Bononi, A., et al. BAP1 regulates IP3R3-mediated Ca2+ flux to mitochondria suppressing cell transformation. Nature. 546, 549-553 (2017).
  35. Daou, S., et al. Monoubiquitination of ASXLs controls the deubiquitinase activity of the tumor suppressor BAP1. Nature Communications. 9, 4385 (2018).
  36. Daou, S., et al. The BAP1/ASXL2 Histone H2A Deubiquitinase Complex Regulates Cell Proliferation and Is Disrupted in Cancer. The Journal of Biological Chemistry. 290, 28643-28663 (2015).
  37. Mashtalir, N., et al. Autodeubiquitination protects the tumor suppressor BAP1 from cytoplasmic sequestration mediated by the atypical ubiquitin ligase UBE2O. Molecular Cell. 54, 392-406 (2014).
  38. Yu, H., et al. The ubiquitin carboxyl hydrolase BAP1 forms a ternary complex with YY1 and HCF-1 and is a critical regulator of gene expression. Molecular and Cellular Biology. 30, 5071-5085 (2010).
  39. Yu, H., et al. Tumor suppressor and deubiquitinase BAP1 promotes DNA double-strand break repair. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 285-290 (2014).
  40. Dai, F., et al. BAP1 inhibits the ER stress gene regulatory network and modulates metabolic stress response. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, 3192-3197 (2017).
  41. Zhang, Y., et al. BAP1 links metabolic regulation of ferroptosis to tumour suppression. Nature Cell Biology. 20, 1181-1192 (2018).
  42. Kolluri, K. K., et al. Loss of functional BAP1 augments sensitivity to TRAIL in cancer cells. eLife. 7, (2018).
  43. Machida, Y. J., Machida, Y., Vashisht, A. A., Wohlschlegel, J. A., Dutta, A. The deubiquitinating enzyme BAP1 regulates cell growth via interaction with HCF-1. The Journal of Biological Chemistry. , (2009).
  44. Sahtoe, D. D., van Dijk, W. J., Ekkebus, R., Ovaa, H., Sixma, T. K. BAP1/ASXL1 recruitment and activation for H2A deubiquitination. Nature Communications. 7, 10292 (2016).

Tags

Биохимия Выпуск 149 убиквитивание деубиквитация E3 убиквитин лигаза КНР1 deubiquitinase PR-DUB хроматин BAP1 ASXL BMI1 RING1B H2A
В Vitro Увселицивание и Deubiquitination Анализы Нуклеосомальных Хистонов
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Masclef, L., Maxime, U., Ahmed, O.,… More

Masclef, L., Maxime, U., Ahmed, O., Sen Nkwe, N., Barbour, H., Iannantuono, N. V. G., Boubekeur, A., Daou, S., Affar, E. B. In Vitro Ubiquitination and Deubiquitination Assays of Nucleosomal Histones. J. Vis. Exp. (149), e59385, doi:10.3791/59385 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter