Summary
ユビキチン化は、細胞プロセスで重要な役割を果たし、デュビキチン化によって緊密に調整される翻訳後修飾です。両方の反応の欠陥は、人間の病理の下にある。精製成分を用いてインビトロでユビキチン化・デュビキチン化反応を行うためのプロトコルを提供します。
Abstract
ユビキチン化は、様々なシグナル伝達経路において重要な役割を果たし、クロマチン機能とDNA関連プロセスの調整に特に関与する翻訳後修飾である。この修飾は、E1ユビキチン活性化、E2ユビキチン結合およびE3ユビキチン-リガゼを含むいくつかの酵素の逐次作用を伴い、デュビキチナーゼ(DUB)によって逆転される。ユビキチン化は、酵素活性の変調、タンパク質とタンパク質の相互作用および細胞下局在化を含むタンパク質機能の分解またはタンパク質機能の変化を誘発する。タンパク質ユビキチン化またはデュビキチン化を実証する上で重要なステップは、精製された成分を用いてインビトロ反応を行うことです。有効なユビキチン化およびデュビキチン化反応は、使用される異なる成分、酵素共因子、緩衝条件、および基板の性質によって大きく影響を受ける可能性があります。 ここでは、ユビキチン化およびデュビキチン化反応を行うためのステップバイステップのプロトコルを提供する。これらの反応は、マウスポリコム抑圧複合体1(PRC1)、BMI1、およびRING1B、リジン119上のヒストンH2Aを単一ユビキチン化するE3ユビキチンリゲスを用いて示す。ヌクレオソームH2Aのデュビキチン化は、ヒトデュビキチネーゼBAP1およびDEUBiquitinaseeAAptor(DEUBAD)ドメインの共因子ASXL2によって形成された最小限のポリコム抑圧デュビキチネーゼ(PR-DUB)複合体を用いて行われる。これらのユビキチン化/デュビキチン化アッセイは、細菌精製タンパク質または哺乳動物細胞から精製された天然核ソームで再構成された組換えヌクレオソームのいずれかの文脈で行うことができる。我々は、これらの反応に重大な影響を及ぼす可能性のある複雑さを強調し、これらのプロトコルの一般的な原理が他のE3ユビキチンリガスおよびデュビキチナーゼに迅速に適応できることを提案する。
Introduction
ユビキチン化は、翻訳後の最も保存された修飾の1つであり、酵母、植物、脊椎動物を含む多種多様な生物にとって重要です。ユビキチンは、高度に保存された76アミノ酸ポリペプチドであるユビキチンの共生結合から成り、タンパク質を標的とし、3つの酵素、すなわち、E1活性化、E2-共役およびE3リゲス1を含む3つの順次ステップで起こる。 2,3.この翻訳後の改変は、生物学的プロセスの広いスペクトルで中心的な役割を果たしています。実際、反応の特異性を提供するE3リチウムは、酵素の大きなスーパーファミリーを構成し、ユビキチン系4、5、6の最も豊富な酵素である。タンパク質ユビキチン化の下流効果は、単一ユビキチン化、多単一ビキチン化、線形または分岐ポリユビキチン化の性質に依存する。モノウビキチン化はプロテアソーム分解と関連することはほとんどないが、代わりにこの修飾は様々なシグナルイベントの媒次に関与する。ポリウビキチン化は、ユビキチン分子自体のN末端またはリジン残基を含み、ポリユビキチン化タンパク質の運命は、ユビキチン鎖拡張に関与する残基に依存する。ユビキチンのリジン48によって媒介されるポリウビキチン化がプロテアソーム分解を誘導することを長い間知られている。反対に、ユビキチンのリジン63を介したポリウビキチン化は、しばしばタンパク質活性化7、8、9と関連している。他の重要な翻訳後修飾と同様に、ユビキチンは可逆的であり、タンパク質からのユビキチン除去は、細胞プロセスの重要な調節剤として出現したドゥビキチナーゼ(DUB)と呼ばれる特定のプロテアーゼによって保証される。2,10.重要なことに、多くのDUBは高度に専門化されており、また、デュビキチン化を通じて、特定の基質を調節し、タンパク質機能に対するユビキチン化とデュビキチン化の微妙なバランスが重要であることを示す。E3とDUBは、プロテアソーム分解機構およびアクセサリ因子と共に、主要なシグナル伝達経路を調節するユビキチンプロテアソームシステム(UPS、>1200遺伝子)を形成し、そのうちのいくつかは細胞増殖および増殖に関連する。細胞の運命の決定、分化、細胞移動、および細胞死。重要なことに、ユビキチン化を伴ういくつかのシグナル伝達カスケードの規制緩和は、腫瘍形成および神経変性疾患5、11、12、13を促進する。14.
ユビキチン化は、クロマチン生物学およびDNA依存プロセス15、16、17において広範な役割を果たす。例えば、リジン119上のヒストンH2Aの単一化化(以下、H2A K119ub)は、転写抑圧およびDNA修復18、19、20に関与する重要な翻訳後修飾である。 21、22。H2A K119ubは、エピジェネティック情報の維持に重要な役割を果たし、ショウジョウバエからヒトへの高度に保存されているポリコム抑圧複合体1(PRC1)によって触媒される。正規PRC1は、特に、上記のユビキチン化イベント22、23を担うコアE3ユビキチンリゲス複合体であるリング1BおよびBMI1によって構成される。ショウジョウバエでは、H2Aモノビキチン化(哺乳類のH2A K119ubに相当するH2A K118ub)は、ポリコム抑圧DUB(PR-DUB)複合体24を形成する追加のセックスコーム(ASX)と相互作用するDUBカリプソによって逆転される。カリプソの哺乳類のオルソログ、BAP1は、様々なヒト悪性腫瘍25、26、27、28、および様々なヒト悪性腫瘍において削除または不活性化された腫瘍抑制剤である。 29歳,30歳,31歳,32歳,33.BAP1は、小プラズム網膜33、34、35、36、核およびカルシウムシグナル伝達媒介アポトーシスにおけるDNA依存的プロセスを調節する。37歳,38歳,39歳,40歳,41歳,42.BAP1は、特にASXL1、ASXL2およびASXL3(ASXLs)、ASX38、43の3つのオルソログを含むマルチサブユニットタンパク質複合体を組み立てる。AsxLsは、DEUビクチネーゼアダプター(DEUBAD)ドメインを使用し、ASXMドメインとも呼び、BAP1 DUB活性35、36、44を刺激する。したがって、APLはクロマチンにおけるBAP1 DUB活性を調整する上で重要な役割を果たし、より広範に腫瘍抑制機能を果たす。
ユビキチン化およびデュビキチン化プロセスを研究するいくつかの方法が存在します。.特に、細菌から精製されたタンパク質を用いて生化学的アッセイは、特定の基質からのユビキチンの直接ユビキチン化または除去を実証する上で非常に強力なままである。これらの実験は、最小限の複合体の要件の決定、反応運動学の決定、構造/機能関係の定義、病理学的影響の理解などのパラメータの範囲を調査するために行うことができます。遺伝子の突然変異。ここでは、精製成分を用いてクロマチン基質に対してユビキチン化およびデュービキチン化反応を行うプロトコルを提供する。モデルシステムとして、ヌクレオソームH2Aタンパク質のインビトロユビキチン化およびデュビキチン化が提示される。RING1B/BMI1およびBAP1/DEUBADの最小限の複合体で組み立てられた細菌精製タンパク質は、それぞれヌクレオソームH2Aのユビキチン化またはデュビキチン化に使用されます。
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Protocol
1. GSH-アガロース親和性浄化 GST-RING1B(1-159)-BMI1(1-109) E3ユビキチン・リガセ・コンプレックス
- pGEX6p2rbs-GST-RING1B (1-159 aa) - BMI1(1-109aa)細菌発現構築物を使用してBL21(DE3)細菌を形質転換する(材料の表を参照)23。この構成により、pGEX-6P-2バックボーンにGSTタグを持つBMI1ドメイン1-109に融合したマウスリング1Bドメイン1-159の発現が可能になります。
- 100 μg/mLアンピシリンおよび50 μg/mLクロラムフェニコールの存在下でLBブロス培地の20mLでGST-RING1B(1-159 aa)-BMI1(1-109 aa)を発現するRIL-細菌を接種して一晩スターター培養を行う。一晩37°Cで振ってインキュベートします。翌日、500mLの新鮮なLBブロス培地(1/26希釈)を含む1Lフラスコにスターター培養をアンピシリンで加え、シェーカーで培養を2~4時間37°Cでインキュベートします。
-
インキュベーション時間中に、分光光度計で600nmでODを測定します。細菌培養が600nmで0.6 OD単位に達した場合、非誘導サンプルとして1,5mLチューブに1mLのアリコートを取ります。1L培養物にイソプロピルβ-D-1-チオガラクピラノシド(IPTG)の400μMを添加し、タンパク質発現を誘導する。バクテリアを25°Cで6時間から一晩インキュベートします。
- 1 mLアリコートを14,000 x gで30sで遠心分離し、上清を廃棄し、Laemmliサンプルバッファーの200μLでペレットを再懸濁し、SDS-PAGEおよびコマシーブルーのタンパク質誘導分析のために保ちます。
- 誘導細菌培養をフラスコからクリーン遠心ボトルに移し、3,500 x gで15分間4°Cでスピンダウンします。上清を廃棄し、40 mLの冷たいPBSでペレットを再懸濁し、4°Cで15分間3,500 x gでスピンダウンします。
- 上清を捨て、-80°Cでペレットを凍結するか、次のステップに進みます。タンパク質が期待される分子量で誘導される場合は、次のステップに進みます。
- 冷たいリシスバッファーA(50 mMトリス-HCl pH 7.5、25mLの細菌ペレットを再ステーペンド、 100 mM NaCl、 1 mM EDTA、1% NP40、1 mM PMSF、0.5 mM DTT、および AEBSF、アプロチニン、ベスタチン、E-64、ルペプチン、ペプスタチン A を含む 1/100 抗プロテアーゼカクテル) すべての細菌ペレットが再懸濁していることを確認します。PMSFおよび抗プロテアーゼカクテルは、細菌リシスの時にのみ、ライシスバッファーに新たに添加する必要があります。
注意:常に氷の上にサンプルを保管してください。
注:100 μg/mLのリソザイムを添加して細菌のライシスを増強することができます。 - 15分間氷の上で細菌を吸収し、プローブ超音波装置と超音波処理器を30s(4-5x)の70%の出力振幅で使用し、その後4°Cで20分間21,000 x gで遠心分離機を使用します。
注意:超音波処理中は、常に氷の上にサンプルを保管してください。 - 遠心分離の間、15 mLチューブに500 μLパックされたGSH-アガロースビーズ(50%スラリー)を取り、PMSFおよび抗プロテアーゼなしでバッファAの10 mLを追加します。短く混ぜ、4°Cで3分間2,500gで回転させ、この洗浄工程をもう2回繰り返し、ビーズを氷の上に置きます。
- 細菌リサート遠心分離に続いて、上清を収集し、50 mL円錐形チューブに移します。総リサートとして100 μLのアリコートを取り、SDS-PAGEおよびクーマッシーブルー分析用に2x Laemmliサンプルバッファーの100 μLを追加します。
- 0.45 μmの細孔シリンジフィルターを通してリサートを濾過し、GSHビーズと混ぜます。4 °Cで4°Cでインキュベートし、5時間振ってビーズを2,500 x gで3分間スピンダウンし、取り出し、流れとして上清を保存します。タンパク質-GSH結合ビーズを6回(各5mL)、抗プロテアーゼカクテルおよびPMSFを含むバッファーAで洗浄する。
- 最後の洗浄後、10mLのバッファーとともにビーズを空のクロマトグラフィーカラムに移し、25mMグルタチオンを含む1.5mLバッファーAを追加し、重力による溶出を1.5mLマイクロチューブに集めます。溶出手順を4回繰り返します。
注:グルタチオンストック溶液は、50 mMトリス-HCl、pH 7.5で200mM濃度で調製 - 4つの溶出液のそれぞれから10 μLのアリコートを取り、2x Laemmliサンプルバッファーの10 μLを追加します。これらのサンプルは、精製タンパク質の存在と純度を決定するために、SDS-PAGEおよびクーマッシーブルー分析に使用されます。
注:最後の溶出に続いて、リサイクルと将来の使用のために4°Cでビーズをバッファに保管してください。 - さらなる分析のために精製タンパク質の合理的な量を示すeluted画分を選択してください。準備の小さなアリコートを作ります。精製したタンパク質を-80°Cに保存します。通常、タンパク質濃度はμL当たり0.5μgから2μgの範囲であり、サンプルはこの状態で保存することができます。
- オプション:10K遠心フィルターユニットを使用してサンプルまたは変更バッファを濃縮
2. BAP1/DEUBAD(ASXL2)デュビキチナゼ複合体の精製
- pET30a+-His-BAP138およびpDEST-MBP-DEUBAD(ASXL2)35の細菌発現構造を使用して、HIS-BAP1およびMBP-DEUBADの生産のためにBL21(DE3)RIL細菌をそれぞれ変換します。
- 50 μg/mLクロラムフェニコルを含むアンピシリン培地のLBブロスの20mLで細菌を発現するHis-BAP1およびMBP-DEUBAD(ASXL2)をインキュベートすることにより、2つの別々の一晩スターター培養を行い、各プラスミド、100 μg/それぞれ100μg/mLのカナマイシンまたは100μg/mLのmL。37°Cでシェーカーに置きます。
- 手順 1.3 ~ 1.6 を実行します。
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冷たいリシスバッファーB(50 mMトリスpH 7.3、500 mM NaCl、3 mM β-メルカプトエタノール、0.2%トリトンX-100、1mM PMSFおよび1/100抗プロテアーゼカクテル)の25mLで細菌ペレットを再中断します。HIS-BAP1の同量をMBP-DEUBADと混合し、氷上で15分間インキュベートし、プロトコル1に示すようにライサテを遠心分離します(ステップ9)。
- 遠心分離の間、PMSFおよび抗プロテアーゼカクテルなしでバッファーBでそれらを3回洗浄することにより、500 μLパックされたNi-NTAアガロースビーズ(50%スラリー)を調製します。
- 細菌リサート遠心分離に続いて、上清を収集し、50 mL円錐形チューブに移します。総リサートとして100 μLのアリコートを取り、SDS-PAGEおよびクーマッシーブルー分析用に2x Laemmliサンプルバッファーの100 μLを追加します。
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0.45 μmの細孔シリンジフィルターを通してリサートを濾過し、Ni-NTAビーズと混ぜます。4°Cで4°Cでインキュベートし、5時間振ってビーズを2,500 x gで3分間スピンダウンし、取り出し、流れとして上清を保存します。
- 20 mM 1,3-Diaza-2,4-シクロペンタジエン(イミダゾール)を含むバッファーBでビーズを6回(各5mL)洗います。
注:pH 7.3で2Mイミダゾールのストック溶液を作ります。
- 20 mM 1,3-Diaza-2,4-シクロペンタジエン(イミダゾール)を含むバッファーBでビーズを6回(各5mL)洗います。
- 最後の洗浄後、10 mLのバッファーを持つビーズを空のクロマトグラフィーカラムに移し、200mMイミダゾールを含む1mLバッファーBを追加し、10 μL DTT(500mM)と2μL EDTA(500mM)を含む1.5mLマイクロチューブに重力による溶出を収集します。,pH:8)溶出手順を4回繰り返す。各溶出率の10 μLを取り、SDS-PAGEおよびCoomassieブルー分析用に2x Laemmliサンプルバッファーの10 μLを追加します。目的の eluted 分数をプールします。
注:リサイクルと将来の使用のために4 °Cでビーズをバッファに保管してください。 -
アミロセドースビーズをインキュベーションする前に、緩衝C(50 mMトリスpH 7.3、300 mM NaCl、1%トリトンX-100、5mM DTT、1mM EDTA、1mM PMSF、および1/100プロテアーゼ阻害剤カクテル)で3回希釈した複合体を希釈する。
- アミロースアガロースビーズ(500μLパック)をPMSFと抗プロテアーゼカクテルを加えずにバッファーCで2回洗浄して調製します。希釈溶出にビーズを加え、4°Cで一晩インキュベートします。
- 遠心分離機 2,500 x gで 3 分間、流れを維持します。タンパク質結合ビーズを5 mLのバッファーC(5~6倍)で洗浄します。
- アミロスアガロースビーズの精製されたHIS-BAP1/MBP-DEUBAD複合体をバッファーD(50 mM HEPES pH 8.0、50 mM NaCl、10%グリセロール、1mM DTT)に保ち、-80°Cに保管してください。 ビーズ画分の20 μL(50%ビーズ溶液)を取り、SDS-PAGEおよびクーマッシーブルー分析用に2x Laemmliサンプルバッファーの20 μLを追加します。
3. HEK293T細胞からの核生成
- 完全なダルベッコ修飾イーグル培地(DMEM)における培養HEK293T細胞は、5%の新生児子牛血清(NBS)、2mM L-グルタミン、および1%ペニシリン/ストレプトマイシンを補充した。
- プレートは12 x 106 HEK293T細胞を15cm培養皿当たり20mLの完全培養物で15cm培養皿の1日前(10皿使用)した。トランスフェクションの前に、細胞培地を12mLの無血清培地に変更し、1mg/mL36で63 μlのポリエチレンニミン(PEI)を用いて21μgのpCDNA-Flag-H2Aで細胞をトランスフェクトする。12時間後に完了する媒体に変更します。
- トランスフェクション後3日間、15mLの氷冷PBS(2回)で細胞を洗浄し、セルスクレーパーを使用して3mLの氷冷PBSで収穫します。4 °Cで8分間2,100 x gの遠心分離機。PBSを廃棄し、-80°Cで細胞ペレットを凍結またはリシス工程に進みます。
- 約10体のバッファーE(50mMトリス-HCl pH 7.3、420mM NaCl、1%NP-40、1mM MgCl 2、1mM PMSF、1/100プロテアーゼ阻害剤カクテル、および20mMMのN-メチルマライミド(NEM)およびインクリプトを添加する。N-メチルマライミド(NEM)は、ヌクレオソームと共に精製するDUBを阻害するために重要です。
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3,000 x gで5分間遠心分離した後、上清を廃棄し、クロマチンペレットを10巻のバッファーE.ミックスで5分間3,000 x gで再懸濁する。
- バッファEを使用して洗浄ステップをもう一度繰り返し、バッファーF「MNaseバッファ」(20 mM Tris-HCl pH 7.5、100 mM KCl、2 mM MgCl 2、1 mM CaCl 2、0.3Mスクロース、0.1%NP-40、1mM PMSF、および1/100プロケーターカクテル)。
注意:ペレットは、洗い流しや遠心分離の間に浮きます。
- バッファEを使用して洗浄ステップをもう一度繰り返し、バッファーF「MNaseバッファ」(20 mM Tris-HCl pH 7.5、100 mM KCl、2 mM MgCl 2、1 mM CaCl 2、0.3Mスクロース、0.1%NP-40、1mM PMSF、および1/100プロケーターカクテル)。
- 5 mLバッファーFでクロマチンを再ステーペンし、ペレットをマイクロコッカルヌクレアーゼ(MNase)で処理します(室温で10分間3U/mL)。
注:反応は、ダンスホモジナイザーを用いて混合することによって助けることができる。 -
インキュベーション後、ヌクレオソームDNA断片の分析のために混合物の40 μLアリコートを服用する。このアリコートをフェノール/クロロホルムの40 μLと6x DNA読み込みバッファーの20 μLと混合し、渦、18,000 x gで2分間スピンし、2%のアガロースゲルにDNAをロードします。
- DNAが主に単核球に対応する147 bp断片である場合は、最終濃度で5mM EDTAを加えて反応を停止する。
- 4°Cで20分間21,000 x gの遠心分離に続き、4°Cで一晩反フラグ樹脂で可溶性クロマチン画分をインキュベートします。ビーズを6xバッファーG(50 mMトリス-HCl、pH 7.3、5 mM EDTA、150 mM NaCl、1%NP-40、1mM PMSF、1 mM DTT、1/100プロテアーゼ阻害剤カクテル)で洗浄します。
- 5 mLバッファー Gを使用してビーズを空のクロマトグラフィーカラムに転送します。フラグ溶出ペプチドの200 μg/mLでビーズ結合ヌクレオソームを溶出します。200 μg/mL フラグ溶出ペプチド(材料の表を参照)と 1/5 (vol:vol) 1 M トリス、pH 8.0 を含むバッファー Gで構成される溶出バッファーを使用します。260 μL フラグ溶出バッファー(各溶出2h)で核素ソーム3倍を溶出します。
- フェノールクロロホルム抽出のためのアリコートを取り、2%アガロースゲルにDNAをロードすることにより、3つの溶出液をテストします。各溶出率の10 μLを取り、SDS-PAGEおよびCoomassieブルー分析のためのLaemmliサンプルバッファ2xの10 μLを加え、ユビキチン化されたH2Aのウェスタンブロット検出のために各溶出をロードします。溶出物を-80°Cで保存します。一般に、ヒト細胞からの精製は細菌に比べてタンパク質の量が少なく、濃度は0.1~0.5 μg/μLです。
4. BMI1/RING1B E3ユビキチン・リガセ・コンプレックスを用いてヌクレオソームユビキチン化アッセイ
- 10K細孔0.5mL遠心フィルターを通して核原子を遠心分離し、溶出バッファーから反応バッファーH(25 mMトリス、pH 7.5;10mM MgCl 2、および5mM ATPATP)に基板を変更します。あるいは、市販のヌクレオソームをアッセイに用いることができる。
注:基質懸濁液を反応バッファーに変更することで、再現性を確保し、フラグ溶出混合物中に存在する化合物による潜在的なE3リゲス阻害を防止します。 - ヌクレオソームの1 μgを40μLのバッファーHの総体積でインキュベートする。Ub活性化酵素(UBE1)(250 ng)、Ub(50 ng/μL)およびE2 Ub結合酵素(672 ng)、およびBMI1/RING1B E3ユビキチンリゲス複合体の1 μgを添加する。時折揺れで37°Cで3時間の反応をインキュベートします。
注:省略、E1、E2、E3、ATP、ユビキチンを含むいくつかのコントロールを並行して行うことができます。これにより、ユビキテーション反応に対する特異性が保証される。 - 2x Laemmliサンプルバッファーの40 μLを追加して反応を停止し、標準的な手順に従って、SDS-PAGEおよびウェスタンブロッティングによるヒストンH2A K119ユビキチン化を分析する。抗H2Aまたは抗H2A K119ub抗体を使用してください(材料の表を参照)。
5. BAP1/DEUBADを用いてインビトロヌクレオソームH2A DUBアッセイ
- インビトロデュビキチン化アッセイには精製ヌクレオソームを使用します。40 μLバッファー I (50 mM トリス-HCl、pH 7.3、1 mM MgCl 2、50 mMNaCl、および 1 mM DTT) で 100~500 ng のヌクレオソームを再中断します。BAP1細菌精製His-BAP1およびMBP-DEUBADの1 μgを追加します。時折揺さぶりを加えて37°Cで3時間の除ビスキチン化反応を行う。
- 2x Laemmliバッファーの40 μLを加えてインビトロ反応を停止し、免疫ブロッティングで分析します。
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Representative Results
GST-BMI1およびRING1Bタンパク質は細菌でよく産生され、可溶性画分で容易に抽出することができる。図1Aは、GST-BMI1-RING1B複合体の典型的な精製のためのクマシーブルー染色を示す。GST-BMI1およびRING1Bバンドは、それぞれ予想分子量、~45 kDaおよび~13 kDaで移動します。特にE3リゲス複合体は、細菌タンパク質汚染物質および/または分解産物の非常に低いレベルで非常に均質です。また、精製複合体の調存測定は最適であり、モル比1:1と同様に、GST-RING1Bタンパク質のバンド強度はBMI1の2~3倍強くなると予想される。同様に、His-BAP1/MBP-DEUBAD複合体の精製は、それぞれ約90kDaおよび〜55 kDaのバンドを用いた比較的均質な調製物をもたらした(図1B)。BAP1およびDEUBADのタンデム親和性精製は、ニッケルアガロースおよびアミロース・アガロースを通じて、それぞれ精製複合体からの自由なBAP1の除去と適切な石化および除去を保証する。一方、精製されたヌクレオソーム画分は、本質的に、高度に濃縮された単核球画率の存在を示す147bpバンドによって構成される(図1C)。これらの精製されたヌクレオソームのクマシーブルー染色は、4つのヒストンサブユニットの典型的なバンドパターンを、修称量で示す(図1D)。市販の組換え単核レオソームは、SDS-PAGEおよびアガロースゲルにそれぞれ移行した場合にも同様のタンパク質およびDNAパターンを示す。なお、H2AおよびFlag-H2Aの単一ビキチン化形態は、HEK293T精製ヌクレオソーム上で容易に区別することができる。我々は、E1/E2/ユビキチン/ATPと一緒に組換えヌクレオソームを使用し、BMI1-RING1B複合体を用いたヒストンH2Aのユビキチン化は、タンパク質のユビキチン化形態の時間依存的な増加を示し、非修飾形態のレベルはそれに続く減少。実質的にすべてのH2Aタンパク質がH2A K119ub(図1E)に形質転換されるので、ユビキチン化反応は合計である。一方、デビキチン化アッセイは天然ヌクレオソーム上で行った。BAP1/DEUBADを使用したこれらのヌクレオソームのインキュベーションに続いて、H2A K119ubシグナルの時間依存性低下を観察した(図1F)。なお、抗H2A K119ubで観察されたユビキチン化H2Aの2つのバンドは、トランスフェクトされたFlag-H2Aおよび内因性H2Aの移行にそれぞれ~30 kDaおよび〜25 kDaバンドに対応する。
図1:精製、ユビキチン化、およびデュビキチン化。(A) GST-RING1B-BMI1タンパク質の精製と、クーマッシーブルー染色を用いた分析GST-RING1B-BMI1は細菌で製造され、GSTアフィニティビーズを用いて精製した。精製純度とタンパク質の大きさを確認するために、溶出剤を15%SDS-PAGEゲルに装填し、クーマッシーブルーで染色しました。タンパク質量を決定するために異なる量のBSAが使用されます。染色されたゲルをスキャンし、図を生成した。(B) MBP-DEUBAD/His-BAP1複合体の精製MBP-DEUBADおよびHIS-BAP1は細菌で別々に製造された。ライシス後、MBP-DEUBADおよびHIS-BAP1を混合し、ニッケルとマルトースビーズを用いて精製した。精製された複合体を8%SDS-PAGEゲルにロードし、クーマッシーブルーで染色した。(C) MNase処理後の単核球の精製PCDNA.3 Flag-H2Aを発現するHEK293Tからクロマチンを抽出し、MNaseで処理し、単核レオソームを生成および精製した。単核球の生成を確認するために、クロマチンの一部をUV光下でフェノールクロロホルム抽出および検出のために採取した。2%のアガロースゲルにロードすると、単核球を示す典型的な147塩基対DNA断片が明らかになります。(D)精製単核球をクーマッシーブルー染色に用いた。(E) ヌクレオソームのインビトロユビキチン化。組換えヌクレオソームを37°Cで37°Cでインキュベートし、細菌精製E3ユビキチンライゲダイマー、GST-RING1B/BMI1およびE1/E2/ATP/ユビキチンを指定した時間に用いた。H2Aモノビキチン化(H2A K119ub)をウェスタンブロッティングにより分析した。(F)BAP1/DEUBADデュビキチナーゼ複合体を用いてH2A K119ubのデュビキチン化アッセイ。インビトロデュビキチン化アッセイは、His-BAP1/MBP-DEUBADおよび哺乳動物精製ヌクレオソームを精製した細菌を用いて行った。起訴された時間に対して反応が行われ、西部ブロッティングによって分析された。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2: プロトコルの制御と概要。(A)精製哺乳動物BAP1またはその触媒死変異体(C91S)ならびに細菌精製組換えBAP1は、ヌクレオソーム上のH2Aデュビキチン化に用いた。バッファー単独または模擬精製から得られた溶出液でインキュベートされたヌクレオソームもコントロールとして含まれていた。(B) BAP1は、RNF168 E3 ligaセーゼによってユビキチン化が媒介されるH2A K13/K15をデュービキチン化しない。HEK293T細胞を、K13/K15残基のユビキタス化を確保するため、RnF168と共にH2A K13R/K15RまたはH2A K118R/K119Rと共生した。精製されたヌクレオソームは、BAP1複合体によるデュビキチン化に用いられた。反応を異なる時点で停止し、免疫ブロッティングを行った。(C) 哺乳動物細胞由来のBAP1と複合体における非ユビキチン化および単ユビキチン化DEUBADの精製。精製された複合体は、ヌクレオソームH2A K119ub上のデュビキチン化アッセイに用いられた。示された時間ポイントに対して反応を行い、ウェスタンブロッティングにより分析した。(D) BAP1デュビキチンテート H2A K119ub を生体内で使用する。HEK293T細胞を、BAP1およびASXL2コンストラクトと共にH2AまたはH2A変異体(H2A K118R、K119R、K118R/K119RまたはK13R/K15R)と共にトランスフェクトした。トランスフェクション後2日目に、示された抗体を用いて免疫ブロッティング用の細胞を採取した。(E) 実験ワークフローの概略表現。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
目的のタンパク質に対して、インビトロユビキチン化およびデュビキチン化アッセイを確立することにはいくつかの利点があります。これらのアッセイは、(i)最適な条件を確立し、これらの反応に対する最小限の要件を定義し、(ii)酵素運動および生化学的定数を決定し、(iii)これらの反応に影響を与える可能性のある補因子または阻害剤の役割を定義する、(iv)相互作用インタフェースを同定し、(v)人工的または疾患関連変異の影響をテストし、(vi)高スループットの化学スクリーニングアッセイを開発するためにさらに使用できるアッセイ条件を確立する。ここでは、これらのアッセイを例示し、BMI1/RING1B媒介型H2Aユビキチン化およびBAP1/ASXL媒介H2Aデュビキチン化をヌクレオソーム基板上で行う方法を説明する。
ヒストンH2Aのユビキチン化は、BMI1-RING1B複合体を用いてH2Aのほぼ完全なユビキチン化が観察されることができるように、最小限の成分を用いてインビトロで要約することができる。なお、この反応は組換えヌクレオソームに対して行われる。これらは、哺乳動物細胞で起こる翻訳後修飾後の他のヒストンから自由であるという利点を持っています。それにもかかわらず、ユビキチン化反応はまた、天然核ソーム上で効率的に行うことができる。ユビキチン化反応が弱い場合、酵素対基化の比率を高め、最適なユビキチンライゲーションを観察することができる。なお、デュビキチン化反応または相互作用アッセイが基板ユビキチン化後に行われる場合、ビーズ結合基板上で直接ユビキチン化を行うことができる。ユビキチン化基板はプルダウンにより回収することができ、ユビキチン化反応の成分を含む上清は廃棄することができる。しかし、酵素特性を確立する場合には、酵素をエラトし、サイズ排除クロマトグラフィーによって評価される成分の概略化が必要である。
デュビキチン化反応は、ユビキチン化反応よりも少ない成分を必要とする。しかしながら、DEUBAD単独の精製は、一般にタンパク質沈殿につながる。重要なのは、DEUBADがBAP1で精製されると、その溶解度が大幅に増加する。なお、基板及び酵素複合体の様々な量を有するデュビキチン化アッセイを行うことをお勧めします。デュビキチン化反応は、クロマチンの過剰な量によって阻害され、おそらくヌクレオソームに関連する阻害剤の濃度の増加によって説明することができる。我々はまた、自由なBAP1の過剰でデュビキチン化を観察した。したがって、BAP1単独でヌクレオソームをインキュベートするなど、いくつかの制御を含める必要があります(図2A)。また、一部のDUBはクロマチンと共に精製する可能性があり、クロマチンをNEMで処理しても、触媒システインを減少させるDTTを添加した後、DUBが部分的に再活性化される可能性があることに注意することも重要です。また、メタロプロテイナゼ酵素DUBも存在する可能性があり、これらの酵素はNEMに対して無感覚であり、したがって阻害されない。したがって、酵素およびDUB触媒死変異体を添加することなく、ヌクレオソームのみで構成される追加の制御を含める必要があります(図2A)。注目すべきは、H2A K119ubに対するBAP1 DUB活性の特異性が十分に文書化されており、アッセイ条件で検証された。H2A K118/K119RまたはH2A K13/K15Rのいずれかを発現するHEK293T細胞ヌクレオソームから精製した。RNF168の発現はK13/K15上の重要なユビキテーションにつながる。BAP1 DUB活性は、H2A K119ub(図2B)に対応するH2A K13/K15Rを含むヌクレオソームでのみ観察される。もう一つの考慮事項は、酵素活性に重要な翻訳後修飾が細菌タンパク質に存在しない可能性が高いということです。従って哺乳動物細胞から精製された成分を用いてインビトロ反応を行うことも35と考えることができる。例えば、より高い真核生物で観察されるプロセスであるDEUBADの単一ビキチン化は、BAP135(図2C)のデュビキチナーゼ活性を大きく促進する。従って、哺乳動物細胞からの成分の精製も考えられる。インビトロ反応に加えて、トランスフェクション後の細胞でBAP1 DUB活性を直接監視することが可能です。例えば、H2A構築を用いたHEK293T細胞のトランスフェクションは、細胞内に豊富であるため、H2A K119ubの明確なシグナルを与えることができる。これらの条件では、ユビキチン化のほとんどはK118/K119残基で起こり、これらの部位のアルギニンへの変異はH2Aユビキチン化の完全な不在につながる(図2D)。H2Aと共発現するBAP1とASXL2は、細胞内のBAP1 DUB活性を結論付けることを可能にする。ただし、過剰発現が誤った結果につながる可能性があるため、いくつかの点を考慮する必要があります。したがって、これらの実験は最適化され、適切に制御される必要があります。
要約すると、図2Eで要約されたプロトコルは、単純であり、専門的なインフラストラクチャや実験的なセットアップを必要とせず、複数の修正された核ソームの相当量を生成するためにスケールアップすることができます。酵素アッセイ、質量分析、タンパク質相互作用アッセイを含む下流への応用。
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Disclosures
著者は、競合する金銭的利益を宣言しません。
Acknowledgments
私たちは、技術支援のためにダイアナ・アジャウドに感謝します。この研究は、カナダ自然科学工学研究評議会(2015-2020)、ゲノムケベック(2016-2019)、ゲノムカナダ(2016-2019)からE.B.A.E.B.A.への助成金によって支援されました。L.M.とN.S.K.はFRQ-Sから博士号を取得しています。H.Bは、高等教育省とチュニジアの科学研究とコール財団から博士号を取得しました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amylose agarose beads | New England Biolabs | #E8021 | |
| Amicon Ultra 0.5 mL centrifugal filters 10K | Sigma-Aldrich | #UFC501096 | |
| Anti-H2AK119ub (H2Aub) | Cell Signaling Technology | #8240 | |
| Anti-Flag-agarose beads | Sigma-Aldrich | #A4596 | |
| Anti-protease cocktail | Sigma-Aldrich | #P8340 | |
| BL21 (DE3) CodonPlus-RIL bacteria | Agilent technologies | #230240 | |
| DMEM | Wisent | #319-005-CL | |
| Empty chromatography column | Biorad | #731-1550 | |
| Flag peptide | Sigma-Aldrich | #F3290 | |
| GSH-agarose beads | Sigma-Aldrich | #G4510 | |
| HEK293T | ATCC | #CRL-3216 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | #I5513 | |
| Micrococcal nuclease (MNase) | Sigma-Aldrich | #N3755 | |
| Ni-NTA agarose beads | ThermoFisher Scientific | #88221 | |
| N-methylmaleimide (NEM) | Bioshop | #ETM222 | |
| Pore syringe filter 0.45 μm | Sarstedt | #83.1826 | |
| Polyethylenimine (PEI) | Polysciences Inc | #23966-1 | |
| pGEX6p2rbs-GST-RING1B(1-159)-Bmi1(1-109) | Addgene | #63139 | |
| Ub Activating Enzyme (UBE1) | Boston Biochem | #E-305 | |
| UBCH5C (UBE2D3) | Boston Biochem | #E2-627 |
References
- Ye, Y., Rape, M. Building ubiquitin chains: E2 enzymes at work. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 755-764 (2009).
- Komander, D., Clague, M. J., Urbe, S. Breaking the chains: structure and function of the deubiquitinases. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 550-563 (2009).
- Ciechanover, A.
- Nakayama, K. I., Nakayama, K. Ubiquitin ligases: cell-cycle control and cancer. Nature Reviews Cancer. 6, 369-381 (2006).
- Senft, D., Qi, J., Ronai, Z. A. Ubiquitin ligases in oncogenic transformation and cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 18, 69-88 (2018).
- Zheng, N., Shabek, N. Ubiquitin Ligases: Structure, Function, and Regulation. Annual Review of Biochemistry. 86, 129-157 (2017).
- Iwai, K., Fujita, H., Sasaki, Y. Linear ubiquitin chains. NF-kappaB signalling, cell death and beyond. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15, 503-508 (2014).
- Kulathu, Y., Komander, D. Atypical ubiquitylation - the unexplored world of polyubiquitin beyond Lys48 and Lys63 linkages. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13, 508-523 (2012).
- Yau, R., Rape, M.
- Mevissen, T. E. T., Komander, D. Mechanisms of Deubiquitinase Specificity and Regulation. Annual Review of Biochemistry. 86, 159-192 (2017).
- Bedford, L., Lowe, J., Dick, L. R., Mayer, R. J., Brownell, J. E. Ubiquitin-like protein conjugation and the ubiquitin-proteasome system as drug targets. Nature Reviews Drug Discovery. 10, 29-46 (2011).
- Minton, K. Inflammasomes: Ubiquitin lines up for inflammasome activity. Nature Reviews Immunology. 14, 580-581 (2014).
- Popovic, D., Vucic, D., Dikic, I. Ubiquitination in disease pathogenesis and treatment. Nature Medicine. 20, 1242-1253 (2014).
- Upadhyay, A., Amanullah, A., Chhangani, D., Mishra, R., Mishra, A. Selective multifaceted E3 ubiquitin ligases barricade extreme defense: Potential therapeutic targets for neurodegeneration and ageing. Ageing Research Reviews. 24, 138-159 (2015).
- Hammond-Martel, I., Yu, H., Affar el, B.
- Schwertman, P., Bekker-Jensen, S., Mailand, N. Regulation of DNA double-strand break repair by ubiquitin and ubiquitin-like modifiers. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17, 379-394 (2016).
- Uckelmann, M., Sixma, T. K. Histone ubiquitination in the DNA damage response. DNA Repair. 56, 92-101 (2017).
- Robzyk, K., Recht, J., Osley, M. A. Rad6-dependent ubiquitination of histone H2B in yeast. Science. 287, 501-504 (2000).
- Hwang, W. W., et al. A conserved RING finger protein required for histone H2B monoubiquitination and cell size control. Molecular Cell. 11, 261-266 (2003).
- Kim, J., Hake, S. B., Roeder, R. G. The human homolog of yeast BRE1 functions as a transcriptional coactivator through direct activator interactions. Molecular Cell. 20, 759-770 (2005).
- Wood, A., et al. an E3 ubiquitin ligase required for recruitment and substrate selection of Rad6 at a promoter. Molecular Cell. 11, 267-274 (2003).
- Wang, H., et al. Role of histone H2A ubiquitination in Polycomb silencing. Nature. 431, 873-878 (2004).
- Buchwald, G., et al. Structure and E3-ligase activity of the Ring-Ring complex of polycomb proteins Bmi1 and Ring1B. The EMBO Journal. 25, 2465-2474 (2006).
- Scheuermann, J. C., et al. Histone H2A deubiquitinase activity of the Polycomb repressive complex PR-DUB. Nature. 465, 243-247 (2010).
- Jensen, D. E., et al. BAP1: a novel ubiquitin hydrolase which binds to the BRCA1 RING finger and enhances BRCA1-mediated cell growth suppression. Oncogene. 16, 1097-1112 (1998).
- Harbour, J. W., et al. Frequent mutation of BAP1 in metastasizing uveal melanomas. Science. 330, 1410-1413 (2010).
- Abdel-Rahman, M. H., et al. GermLine BAP1 mutation predisposes to uveal melanoma, lung adenocarcinoma, meningioma, and other cancers. Journal of Medical Genetics. , (2011).
- Bott, M., et al. The nuclear deubiquitinase BAP1 is commonly inactivated by somatic mutations and 3p21.1 losses in malignant pleural mesothelioma. Nature Genetics. 43, 668-672 (2011).
- Goldstein, A. M. GermLine BAP1 mutations and tumor susceptibility. Nature Genetics. 43, 925-926 (2011).
- Testa, J. R., et al. GermLine BAP1 mutations predispose to malignant mesothelioma. Nature Genetics. 43, 1022-1025 (2011).
- Wiesner, T., et al. GermLine mutations in BAP1 predispose to melanocytic tumors. Nature Genetics. 43, 1018-1021 (2011).
- Dey, A., et al. Loss of the tumor suppressor BAP1 causes myeloid transformation. Science. 337, 1541-1546 (2012).
- Pena-Llopis, S., et al. BAP1 loss defines a new class of renal cell carcinoma. Nature Genetics. 44, 751-759 (2012).
- Bononi, A., et al. BAP1 regulates IP3R3-mediated Ca2+ flux to mitochondria suppressing cell transformation. Nature. 546, 549-553 (2017).
- Daou, S., et al. Monoubiquitination of ASXLs controls the deubiquitinase activity of the tumor suppressor BAP1. Nature Communications. 9, 4385 (2018).
- Daou, S., et al. The BAP1/ASXL2 Histone H2A Deubiquitinase Complex Regulates Cell Proliferation and Is Disrupted in Cancer. The Journal of Biological Chemistry. 290, 28643-28663 (2015).
- Mashtalir, N., et al. Autodeubiquitination protects the tumor suppressor BAP1 from cytoplasmic sequestration mediated by the atypical ubiquitin ligase UBE2O. Molecular Cell. 54, 392-406 (2014).
- Yu, H., et al. The ubiquitin carboxyl hydrolase BAP1 forms a ternary complex with YY1 and HCF-1 and is a critical regulator of gene expression. Molecular and Cellular Biology. 30, 5071-5085 (2010).
- Yu, H., et al. Tumor suppressor and deubiquitinase BAP1 promotes DNA double-strand break repair. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 285-290 (2014).
- Dai, F., et al. BAP1 inhibits the ER stress gene regulatory network and modulates metabolic stress response. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, 3192-3197 (2017).
- Zhang, Y., et al. BAP1 links metabolic regulation of ferroptosis to tumour suppression. Nature Cell Biology. 20, 1181-1192 (2018).
- Kolluri, K. K., et al. Loss of functional BAP1 augments sensitivity to TRAIL in cancer cells. eLife. 7, (2018).
- Machida, Y. J., Machida, Y., Vashisht, A. A., Wohlschlegel, J. A., Dutta, A. The deubiquitinating enzyme BAP1 regulates cell growth via interaction with HCF-1. The Journal of Biological Chemistry. , (2009).
- Sahtoe, D. D., van Dijk, W. J., Ekkebus, R., Ovaa, H., Sixma, T. K. BAP1/ASXL1 recruitment and activation for H2A deubiquitination. Nature Communications. 7, 10292 (2016).
