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Biochemistry

Ensayos in Vitro Ubiquitination y Deubiquitination de histonas nucleosomales

Published: July 25, 2019 doi: 10.3791/59385
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1, 1, 1,2, 1,2
1Maisonneuve-Rosemont Hospital Research Center and Department of Medicine, University of Montréal, 2Lunenfeld-Tanenbaum Research Institute, Sinai Health System
* These authors contributed equally

Summary

La ubiquitinación es una modificación post-traduccional que desempeña un papel importante en los procesos celulares y está estrechamente coordinada por la desubiquitinación. Los defectos en ambas reacciones subyacen a patologías humanas. Proporcionamos protocolos para la realización de la ubiquitinación y la reacción de desubiquitinación in vitro utilizando componentes purificados.

Abstract

La ubiquitinación es una modificación post-traduccional que desempeña un papel importante en varias vías de señalización y participa notablemente en la coordinación de la función de la cromatina y los procesos asociados al ADN. Esta modificación implica una acción secuencial de varias enzimas, incluyendo E1 ubiquitina activa, E2 ubiquitina-conjugating y E3 ubiquitina-ligasa y es revertida por deubiquitinasas (DUBs). La ubiquitinación induce la degradación de las proteínas o la alteración de la función proteica incluyendo la modulación de la actividad enzimática, la interacción proteína-proteína y la localización subcelular. Un paso crítico para demostrar la ubiquitinación o desubiquitinación de proteínas es realizar reacciones in vitro con componentes purificados. Las reacciones efectivas de ubiquitinación y desubiquitinación podrían verse muy afectadas por los diferentes componentes utilizados, los cofactores enzimáticos, las condiciones de amortiguación y la naturaleza del sustrato.  Aquí, proporcionamos protocolos paso a paso para llevar a cabo reacciones de ubiquitinación y desubiquitinación. Ilustramos estas reacciones utilizando componentes mínimos del ratón Polycomb Repressive Complex 1 (PRC1), BMI1 y RING1B, una ligasa de ubiquitina E3 que monoubiquitina histone H2A en lisina 119. La desubiquitinación de H2A nucleosomal se realiza utilizando un complejo mínimo de desubiquitinación represiva de policomb (PR-DUB) formado por la deubiquitinasa humana BAP1 y el dominio DEUBiquitinase ADaptor (DEUBAD) de su cofactor ASXL2. Estos ensayos de ubiquitinación/desubiquitinación se pueden llevar a cabo en el contexto de nucleosomas recombinantes reconstituidos con proteínas purificadas por bacterias o nucleosomas nativos purificados a partir de células de mamíferos. Destacamos las complejidades que pueden tener un impacto significativo en estas reacciones y proponemos que los principios generales de estos protocolos puedan adaptarse rápidamente a otras ligasas y deubiquitinasas de la ubiquitina E3.

Introduction

La ubiquitinación es una de las modificaciones post-traduccionales más conservadas y es crítica para una amplia variedad de organismos, incluyendo levaduras, plantas y vertebrados. La ubiquitinación consiste en la unión covalente de ubiquitina, un polipéptido de 76 aminoácidos altamente conservado, a proteínas diana y se produce en tres pasos secuenciales que implican tres enzimas, es decir, E1-activación, E2-conjugating y E3 ligeas1, 2,3. Esta modificación post-traduccional desempeña un papel central en un amplio espectro de procesos biológicos. De hecho, las ligasas E3, que proporcionan la especificidad de la reacción, constituyen una gran superfamilia de enzimas y son las enzimas más abundantes del sistema de ubiquitina4,5,6. Los efectos aguas abajo de la ubiquitinación de proteínas dependen de la naturaleza de la modificación: monoubiquitinación, multimonoterminización, y poliubiquitinación lineal o ramificada. La monoubiquitinación rara vez se asocia con la degradación proteasomal, pero en su lugar esta modificación está implicada en la mediación de varios eventos de señalización. La poliubiquitinación implica el N-terminal o los residuos de lisina en la propia molécula de ubiquitina, y el destino de una proteína poliubiquitinizada depende de qué residuo está involucrado en la extensión de la cadena de ubiquitina. Durante mucho tiempo se ha sabido que la poliubiquitinación mediada por la lisina 48 de ubiquitina induce degradación proteasomal. Por el contrario, poliubiquitinación a través de lisina 63 de ubiquitina se asocia a menudo con la activación de proteínas7,8,9. Al igual que otras modificaciones importantes post-traduccionales, la ubiquitinación es reversible y la eliminación de ubiquitina de proteínas está garantizada por proteasas específicas las que se denominan deubiquitinasas (DUB), que han surgido como reguladores importantes de los procesos celulares 2 , 10. Es importante destacar que muchos DUB son altamente especializados, y regulan, a través de la desubiquitinación, sustratos específicos, lo que indica que un equilibrio fino entre ubiquitinación y desubiquitinación es crítico para la función proteica. Los E3 y los DUB, junto con la maquinaria de degradación del proteosoma y los factores accesorios, forman el Sistema de Proteasoma de Ubiquitina (UPS, con >1200 genes) que regula las principales vías de señalización, varias de las cuales están asociadas con el crecimiento y la proliferación celular, determinación del destino celular, diferenciación, migración celular y muerte celular. Es importante destacar que la desregulación de varias cascadas de señalización que implican ubiquitinación promueve enfermedades de tumorigénesis y neurodegeneración5,11,12,13, 14.

La ubiquitinación desempeña un papel generalizado en la biología de la cromatina y en los procesos dependientes del ADN15,16,17. Por ejemplo, la monoubiquitinación de histona H2A en lisina 119 (en adelante H2A K119ub) es una modificación crítica post-traduccional implicada en la represión transcripcional y la reparación del ADN18,19,20, 21,22. H2A K119ub es catalizado por el Polycomb Repressive Complex 1 (PRC1), que desempeña un papel clave en el mantenimiento de la información epigenética y está altamente conservado de Drosophila a humano. La PRC1 canónica está constituida en particular por el RING1B y el BMI1, que son el complejo de ligasa de ubiquitina E3 responsable del evento de ubiquitinación22,23. En Drosophila, la monoubiquitinación H2A (H2A K118ub que corresponde a H2A K119ub en mamíferos) es revertida por el DUB Calypso, que interactúa con el Peine Sexual Adicional (ASX) formando el complejo DE Podo-REpressivo DUB (PR-DUB)24. El ortología de mamíferos de calipso, BAP1,es un supresor tumoral suprimido o inactivado en diversas neoplasias malignas humanas25,26,27,28, 29 , 30 , 31 , 32 , 33. BAP1 regula los procesos dependientes del ADN en el núcleo y la apoptosis mediada por la señalización de calcio en el retículo endoplasmático33,34,35,36, 37 , 38 , 39 , 40 , 41 , 42. BAP1 ensambla complejos proteicos multisubunidadques reguladores de transcripción, en particular ASXL1, ASXL2 y ASXL3 (ASXL), tres ortologos de ASX38,43. Los ASXL utilizan el dominio DEUBiquitinase ADaptor (DEUBAD), también llamado dominio ASXM, para estimular la actividad BAP1 DUB35,36,44. Por lo tanto, los ASXL desempeñan un papel importante en la coordinación de la actividad DE BAP1 DUB en la cromatina y, más ampliamente, en su función supresora de tumores.

Existen varios métodos para estudiar los procesos de ubiquitinación y desubiquitinación. En particular, los ensayos bioquímicos que utilizan proteínas purificadas a partir de bacterias siguen siendo muy potentes para demostrar la ubiquitinación directa de sustratos específicos o la eliminación de ubiquitina de ellos. Estos experimentos se pueden llevar a cabo para investigar una serie de parámetros tales como determinar el requisito de complejos mínimos, determinar la cinética de reacciones, definir relaciones estructura/función y comprender el impacto de la patológica mutaciones genéticas. Aquí, proporcionamos protocolos para llevar a cabo reacciones de ubiquitinación y desubiquitinación en sustratos de cromatina con componentes purificados. Como sistema modelo, se presenta la ubiquitinación in vitro y la desubiquitinación de la proteína nucleosomal H2A. Las proteínas purificadas por bacterias ensambladas en complejos mínimos de RING1B/BMI1 y BAP1/DEUBAD se utilizan para la ubiquitinación o desubiquitinación de H2A nucleosomal, respectivamente.

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Protocol

1. GSH-agarose Purificación de afinidad del complejo GST-RING1B(1-159)-BMI1(1-109) E3 Ubiquitin Ligase

  1. Utilice la construcción de expresión de bacterias pGEX6p2rbs-GST-RING1B (1-159 aa) - BMI1 (1 -109aa) para transformar la bacteria BL21 (DE3) (ver Tabla de Materiales)23. Esta construcción permite la expresión del dominio RING1B murino 1-159 fusionado al dominio 1-109 BMI1 con la etiqueta GST en la estructura básica pGEX-6P-2.
  2. Realizar un cultivo de arranque durante la noche mediante la inoculación de ril-bacterias que expresan GST-RING1B (1-159 aa) - BMI1(1 -109 aa) en 20 mL de medio de caldo LB en presencia de 100 g/ml de ampicilina y 50 g/ml de cloranfenicol. Incubar agitando a 37oC durante la noche. Al día siguiente, añadir el cultivo inicial a un matraz de 1 L que contenga 500 ml de medio de caldo LB fresco (1/26 de dilución) con ampicilina e incubar el cultivo en la coctelera a 37 oC durante 2 a 4 h.
  3. Durante el tiempo de incubación, mida la DO a 600 nm con un espectrofotómetro. Cuando el cultivo de bacterias alcance 0,6 unidades de DoC a 600 nm, tome una alícuota de 1 ml en un tubo de 1,5 ml como muestra no inducida. Añadir 400 m de Isopropyl -D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) al cultivo de 1 L para inducir la expresión de proteínas. Incubar bacterias a 25oC durante 6 h hasta la noche.
    1. Centrifugar las alícuotas de 1 ml a 14.000 x g durante 30 s, desechar el sobrenadante, resuspender el pellet en 200 ml de tampón de muestra de Laemmli, y mantener para el análisis SDS-PAGE y Coomassie azul de inducción de proteínas.
  4. Transfiera el cultivo de bacterias inducido del matraz a una botella de centrifugación limpia y gire hacia abajo a 3.500 x g durante 15 min a 4 oC. Deseche el sobrenadante y resuspenda el pellet con 40 ml de PBS frío y gire hacia abajo a 3.500 x g durante 15 min a 4 oC.
  5. Deseche el sobrenadante y congele el pellet a -80 oC o proceda al siguiente paso. Si las proteínas son inducidas en el peso molecular esperado, proceda al siguiente paso.
  6. Resuspender el pellet de bacterias en 25 ml de tampón de lisis helada A (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM NaCl, EDTA de 1 mM, 1% NP40, 1 mM PMSF, TDT de 0,5 mM y cóctel antiproteasa 1/100 que contiene AEBSF, Aprotinin, Bestatin, E-64, Leupeptina y Pepstatina A). Asegúrese de que todas las bacterias pellet se resuspenden. El pMSF y el cóctel antiproteasa deben añadirse recién al tampón de lisis, solo en el momento de la lisis bacteriana.
    PRECAUCION: Mantenga siempre la muestra en hielo.
    NOTA: Se puede añadir lisozyme a 100 g/ml para mejorar la lisis bacteriana.
  7. Incubar las bacterias lisiar sobre hielo durante 15 min. Utilice un sonicador de sonda y sonicar a una amplitud de salida del 70% durante 30 s (4-5x), y luego centrifugar a 21.000 x g durante 20 min a 4 oC.
    PRECAUCION: Durante la sonicación, mantenga siempre las muestras en hielo.
  8. Durante el tiempo de centrifugación, tomar perlas GSH-agarose embaladas de 500 l (50% lodos) en un tubo de 15 ml y añadir 10 ml de tampón A sin PMSF y antiproteasas. Mezcle brevemente y gire a 2.500 g durante 3 minutos a 4 oC, repita este paso de lavado dos veces más y mantenga las cuentas sobre hielo.
  9. Después de la centrifugación de lisado bacteriano, recoger el sobrenadante y transferirlo a un tubo cónico de 50 ml. Tome una alícuota de 100 l como un lisato total y agregue 100 l de 2 tampón de muestra de Laemmli para el análisis sDS-PAGE y azul de Coomassie.
  10. Filtrar el lisado a través de un filtro de jeringa de poro de 0,45 m y mezclarlo con las perlas GSH. Incubar a 4oC con agitación durante 5 h. Gire las perlas a 2.500 x g durante 3 min, retire y guarde el sobrenadante a medida que fluye. Lavar las perlas unidas a proteínas-GSH 6 veces (5 ml cada una) con tampón A que contiene cóctel antiproteasa y PMSF.
  11. Después del último lavado, transfiera las perlas junto con 10 ml de tampón a una columna de cromatografía vacía, agregue 1,5 ml de tampón A que contenga 25 mM de glutatión y recoja la elución por gravedad en microtubos de 1,5 ml. Repita el procedimiento de elución 4 veces.
    NOTA: La solución de glutatión se prepara a una concentración de 200 mM en 50 mM Tris-HCl, pH 7,5
  12. Tome una alícuota de 10 ml de cada una de las 4 eluciones y agregue 10 l de 2 x tampón de muestra de Laemmli. Estas muestras se utilizarán para el análisis sDS-PAGE y azul de coomassie para determinar la presencia y la pureza de las proteínas purificadas.
    NOTA: Después de la última elución, mantenga las perlas en tampón a 4 oC para su reciclaje y uso futuro.
  13. Elija las fracciones elutadas que muestran cantidades razonables de proteínas purificadas para su posterior análisis. Hacer pequeñas alícuotas de la preparación. Almacene las proteínas purificadas en -80oC. Por lo general, la concentración de proteínas oscilará entre 0,5 g y 2 g por l y las muestras se pueden almacenar en este estado.
  14. OPCIONAL: Concentre la muestra o cambie el búfer con una unidad de filtro centrífugo de 10K

2. Purificación del complejo BAP1/DEUBAD (ASXL2) Deubiquitinase

  1. Utilice pET30a+-His-BAP138 y pDEST-MBP-DEUBAD (ASXL2)35 construcciones de expresión bacteriana para transformar las bacterias BL21 (DE3) RIL para la producción de His-BAP1 y MBP-DEUBAD respectivamente.
  2. Realizar dos cultivos de arranque nocturno separados mediante la incubación de His-BAP1 y MBP-DEUBAD (ASXL2) expresando bacterias en 20 ml de caldo LB de medio de ampicilina que contiene 50 g/ml de clorfenicol y el antibiótico correspondiente para cada plásmido, 100 g/ ml de kanamicina o 100 g/ml de ampicilina respectivamente. Colocar en la coctelera a 37oC.
  3. Realice los pasos 1.3–1.6.
  4. Resuspender los pellets de bacterias en 25 ml de tampón de lisis helada B (50 mM Tris pH 7.3, 500 mM NaCl, 3 mM-Mercaptoetanol, 0.2% Triton X-100, 1 mM PMSF y 1/100 cóctel antiproteasa). Mezclar volúmenes iguales del His-BAP1 con los lysates MBP-DEUBAD e incubar en hielo durante 15 minutos.
    1. Durante la centrifugación, preparar cuentas de agarosa Ni-NTA empaquetadas de 500 l (50% de purines) lavándolas tres veces con tampón B sin PMSF y cóctel antiproteasa.
  5. Después de la centrifugación de lisado bacteriano, recoger el sobrenadante y transferirlo a un tubo cónico de 50 ml. Tome una alícuota de 100 l como un lisato total y agregue 100 l de 2 tampón de muestra de Laemmli para el análisis sDS-PAGE y azul de Coomassie.
  6. Filtrar el lisado a través de un filtro de jeringa de poro de 0,45 m y mezclarlo con las perlas Ni-NTA. Incubar a 4oC con agitación durante 5 h. Gire las perlas a 2.500 x g durante 3 min, retire y guarde el sobrenadante a medida que el flujo a través.
    1. Lavar las perlas 6 veces (5 ml cada una) con tampón B que contiene 20 mM 1,3-Diaza-2,4-cicloopentano (Imidazol).
      NOTA: Haga una solución en stock de 2 M imidazol a pH 7.3.
  7. Después del último lavado, transfiera las perlas con 10 ml de tampón a una columna de cromatografía vacía, agregue 1 mL de tampón B que contenga 200 mM de Imidazol y recoja la elución por gravedad en microtubos de 1,5 ml que contengan 10 Ml de TDT (500 ml) y 2 EDTA (500 mM) , pH: 8). Repita el procedimiento de elución 4 veces. Tomar 10 l de cada fracción de elución y añadir 10 l de 2 búfer de muestra de Laemmli para el análisis SDS-PAGE y Coomassie blue. Agrupa las fracciones eluted deseadas.
    NOTA: Mantenga las perlas en el búfer a 4 oC para su reciclaje y uso futuro.
  8. Diluir el complejo eludado 3 veces con tampón C (50 mM Tris pH 7.3, 300 mM NaCl, 1% Triton X-100, 5 mM DTT, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, y 1/100 cóctel inhibidor de proteasa) antes de la incubación con las perlas de amilosa de agarosa.
    1. Preparar cuentas de agarosa de amilosa (500 l embaladas) lavándolas 2 veces con el tampón C sin añadir PMSF y cóctel antiproteasa. Añadir las perlas a la elución diluida e incubar durante la noche a 4oC.
  9. Centrifugar a 2.500 x g durante 3 min y mantener el flujo a través. Lavar las perlas de proteínas con 5 ml de tampón C (5-6x).
  10. Mantenga el complejo purificado His-BAP1/MBP-DEUBAD en las perlas de agarosa de amilosa en tampón D (50 mM HEPES pH 8.0, 50 mM NaCl, 10% glicerol y 1 mM de TDT) y guárdelo a -80 oC. Tomar 20 l de la fracción de perlas (solución de perlas del 50%) y añadir 20 l de búfer de muestra de 2x Laemmli para el análisis SDS-PAGE y Coomassie blue.

3. Purificación de los nucleosomas de las células HEK293T

  1. Células HEK293T de cultivo en el medio de águila modificado de Dulbecco (DMEM) complementado con 5% de suero de ternero recién nacido (NBS), 2 mM de L-glutamina, y 1% penicilina/estreptomicina.
  2. Placa alrededor de 12 x 106 hek293T células en 20 mL de medios completos por plato de cultivo de 15 cm un día antes de la transfección (se utilizaron 10 platos). Antes de la fecundación, cambie el medio de la célula a 12 ml de medio libre de suero y transfecte las células con 21 g de pCDNA-Flag-H2A utilizando 63 l de polietilenimina (PEI) a 1 mg/ml36. Cambie a medio completo 12 h más tarde.
  3. Tres días después de la transfección, lavar las células con PBS helado de 15 ml (dos veces) y cosecharlas en 3 ml de PBS frío con hielo usando un rascador de células. Centrífuga a 2.100 x g durante 8 min a 4oC. Deseche el PBS y proceda a la etapa de lisis o congele el pellet celular a -80 oC.
  4. Resuspenda el pellet celular en aproximadamente 10 volúmenes de tampón E (50 mM Tris-HCl pH 7.3, 420 mM NaCl, 1% NP-40, 1 mM MgCl2, 1 mM PMSF, cóctel inhibidor de proteasa 1/100, y 20 mM de N-metilmaleimida (NEM)) e incubar en hielo durante 20 min. La N-metilmaleimida (NEM) es fundamental para inhibir los DDU que co-purifican con nucleosomas.
  5. Después de la centrifugación a 3.000 x g durante 5 min, deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet de cromatina en 10 volúmenes de tampón E. Mezclar por inversión y centrífuga a 3.000 x g durante 5 min.
    1. Repita el paso de lavado en otro momento utilizando el buffer E y dos veces utilizando el buffer F "MNase Buffer" (20 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM KCl, 2 mM MgCl2, 1 mM CaCl2, 0.3 M sacarosa, 0.1% NP-40, 1 mM PMSF, y 1/100 proteasa inhibitor inhibitor cóctel).
      ADVERTENCIA: El pellet flotará durante los lavados y la centrifugación.
  6. Resuspenda la cromatina en un tampón F de 5 ml y trate el pellet con nucleasa microcócica (MNase) (3 U/ml durante 10 min a temperatura ambiente).
    NOTA: La reacción se puede ayudar mezclando usando un Homogeneizador Dounce.
  7. Después de la incubación, tomar una alícuota de 40 l de la mezcla para el análisis de fragmentos de ADN nucleosomal. Mezcle esta alícuota con 40 l de fenol/cloroformo y 20 l de tampón de carga de ADN 6x, vórtice, gire a 18.000 x g durante 2 min, y cargue el ADN en un gel de agarosa del 2%.
    1. Cuando el ADN es predominantemente un fragmento de 147 bp correspondiente a mononucleosos, detenga la reacción añadiendo 5 mM EDTA a la concentración final.
  8. Después de la centrifugación a 21.000 x g durante 20 min a 4oC, incubar la fracción de cromatina soluble con resina anti-bandera durante la noche a 4oC. Lavar las perlas con 6x Tampón G (50 mM Tris-HCl, pH 7.3, 5 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 1 mM PMSF, 1 mM DTT, 1/100 cóctel inhibidores de la proteasa).
  9. Transfiera las perlas con un búfer G de 5 ml en una columna de cromatografía vacía. Eluye los nucleosomas ligados a perlas con 200 g/ml de péptido de elución de bandera. Utilice un búfer de elución compuesto por tampón G que contenga 200 péptidos de elución de bandera de g/ml (ver Tabla de materiales)y 1/5 (vol:vol) 1 M Tris, pH 8.0. Elule los nucleosomas 3x con tampón de elución de bandera de 260 l (2 h cada elución).
  10. Pruebe las 3 eluciones tomando una alícuota para la extracción de fenol-cloroformo y cargue el ADN en un gel de agarosa del 2%. Tomar 10 l de cada fracción de elución y añadir 10 l de tampón de muestra de Laemmli 2x para el análisis SDS-PAGE y Coomassie azul y cargar cada elución para la detección de Western Blot de H2A ubiquitinado. Almacene la elución a -80 oC. En general, la purificación de las células humanas produce menos proteínas que la de las bacterias, con concentraciones que oscilan entre 0,1 y 0,5 g/L.

4. Ensayo de ubiquitinación de nucleoso utilizando el complejo de la ligasa de ubiquitina BMI1/RING1B E3

  1. Centrifugar los nucleosomas a través de filtros centrífugos de 0,5 ml de poro de 10K para cambiar el sustrato del tampón de elución al búfer de reacción H (25 mM Tris, pH 7,5; 10 mM MgCl2y 5 mM ATP). Alternativamente, los nucleosomas disponibles comercialmente se pueden utilizar para el ensayo.
    NOTA: El cambio de la solución de suspensión de sustrato al tampón de reacción garantiza la reproducibilidad y evita la posible inhibición de la ligasa E3 por compuestos presentes en la mezcla de elución flag.
  2. Incubar 1 g de los nucleosomas en un volumen total de tampón Hde 40 l. Añadir enzima activadora de ub (UBE1) (250 ng), enzimas ub (50 ng/L) y E2 de conjugación ubconjugada (672 ng), y 1 g de complejo de ligasa de ubiquitina BMI1/RING1B E3. Incubar la reacción durante 3 h a 37oC con agitación ocasional.
    NOTA: Se pueden realizar varios controles en paralelo, incluyendo la omisión, E1, E2, E3, ATP y ubiquitina. Esto garantiza la especificidad de la reacción de ubiquitinación.
  3. Detenga la reacción añadiendo 40 l de búfer de muestra de 2x Laemmli y analice la ubiquitinación histona H2A K119 por SDS-PAGE y la hincha occidental, de acuerdo con los procedimientos estándar. Utilizar anticuerpos anti-H2A o anti-H2A K119ub (ver Tabla de Materiales).

5. Ensayo In Vitro Nucleosomal H2A DUB usando BAP1/DEUBAD

  1. Utilice los nucleosomas purificados para el ensayo de desubiquitinación in vitro. Resuspenda 100–500 ng de nucleosomas en tampón I de 40 ml (50 mM Tris-HCl, pH 7,3, 1 mM MgCl2,50 mM de NaCl y 1 mM de TDT). Añadir 1 g de His-BAP1 y MBP-DEUBAD purificados por bacterias BAP1. Llevar a cabo la reacción de desubiquitinación durante 3 h a 37 oC con agitación ocasional.
  2. Detenga la reacción in vitro añadiendo 40 s de 2x tampón De Laemmli y analice mediante inmunoblotting.

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Representative Results

Las proteínas GST-BMI1 y RING1B están bien producidas en bacterias y se pueden extraer fácilmente en la fracción soluble. La Figura 1A muestra una tinción azul de Coomassie para una purificación típica del complejo GST-BMI1-RING1B. Las bandas GST-BMI1 y RING1B migran al peso molecular esperado, 45 kDa y 13 kDa respectivamente. En particular, el complejo de ligasa E3 es altamente homogéneo con niveles muy bajos de contaminantes de proteínas bacterianas y/o productos de degradación. Además, la estequiometría del complejo purificado es óptima, ya que con una relación molar de 1:1, se espera que la intensidad de la banda de la proteína GST-RING1B sea de dos a tres veces más fuerte que la de BMI1. Del mismo modo, la purificación del complejo His-BAP1/MBP-DEUBAD también dio lugar a preparaciones relativamente homogéneas con bandas de 90 kDa y 55 kDa, respectivamente (Figura1B). La purificación de afinidad en tándem de BAP1 y DEUBAD, a través de níquel-agarosa y amilosa-agarosa, respectivamente, garantiza y auna de estequiometría adecuada y la eliminación de BAP1 libre del complejo purificado. Por otro lado, la fracción nucleosómica purificada está compuesta esencialmente por una banda de 147bp que indica la presencia de una fracción mononucleosómica altamente enriquecida (Figura1C). La tinción azul coomassia de estos nucleosomas purificados muestra un patrón de banda típico de las cuatro subunidades de histona con cantidades estequiométricas (Figura1D). Los mononucleosos recombinantes disponibles comercialmente también muestran patrones de proteína y ADN similares cuando se migran en geles SDS-PAGE y agarosa, respectivamente. Cabe destacar que las formas monoubiquitinadas de H2A y Flag-H2A se pueden distinguir fácilmente en los nucleosomas purificados por HEK293T. Usamos nucleosomas recombinantes junto con E1/E2/Ubiquitin/ATP y observamos que la ubiquitinación de histona H2A con el complejo BMI1-RING1B muestra un aumento dependiente del tiempo de la forma ubiquitinada de la proteína, mientras que los niveles de la forma no modificada son concomitantemente disminuyó. La reacción de ubiquitinación es total, ya que prácticamente todas las proteínas H2A se transforman en H2A K119ub (Figura1E). Por otro lado, el ensayo de desubiquitinación se llevó a cabo en nucleosomas nativos. Tras la incubación de estos nucleosomas con BAP1/DEUBAD, observamos una reducción dependiente del tiempo de la señal H2A K119ub (Figura1F). Tenga en cuenta que dos bandas de H2A ubiquitinizada observadas con bandas anti-H2A K119ub corresponden a las bandas transinfectadas Flag-H2A y Endógena De2A migrando a bandas de 30 kDa y 25 kDa respectivamente.

Figure 1
Figura 1: Purificación, ubiquitinación y desubiquitinación. (A) Purificación de proteínas GST-RING1B-BMI1 y análisis utilizando la tinción azul de Coomassie. GST-RING1B-BMI1 se produjeron en bacterias y se purificaron utilizando perlas de afinidad GST. Para confirmar la pureza de purificación y el tamaño de las proteínas, las eluciones se cargaron en gel 15% SDS-PAGE y se teñiron con azul Coomassie. Se utiliza una cantidad diferente de BSA para determinar la cantidad de proteínas. El gel teñido fue escaneado para generar la figura. (B) Purificación del complejo MBP-DEUBAD/His-BAP1. MBP-DEUBAD y HIS-BAP1 se produjeron por separado en bacterias. Después de la lisis, MBP-DEUBAD y HIS-BAP1 se mezclaron y purificaron con cuentas de níquel y maltosa. El complejo purificado se cargó en un 8% de gel SDS-PAGE y se tiñó con azul Coomassie. (C) Purificación de mononucleósoma tras el tratamiento con MNase. La cromatina de HEK293T que expresa pcDNA.3 Flag-H2A fue extraída y tratada con MNase para generar y purificar mononucleosos. Para confirmar la generación de mononucleosoma, se tomó una fracción de cromatina para la extracción y detección de cloroformo de fenol bajo luz UV. La carga en gel de agarosa del 2% revela un fragmento típico de ADN de par base de 147 indicativo de mononucleosoma. (D) Se utilizaron mononucleósicos purificados para la tinción azul de Coomassie. (E) Ubiquitinación in vitro de nucleosomas. Los nucleosomas recombinantes se incubaron a 37 oC con el dimer de ligasa de ubiquitina E3 purificado bacteriano, GST-RING1B/BMI1 y E1/E2/ATP/Ubiquitin, para los tiempos indicados. La monoubiquitinación H2A (H2A K119ub) fue analizada por la hincha occidental. (F) Ensayo de desubiquitinación de H2A K119ub utilizando el complejo deubiquitinase BAP1/DEUBAD. Los ensayos de desubiquitinación in vitro se llevaron a cabo utilizando bacterias purificadas His-BAP1/MBP-DEUBAD y nucleosomas purificados por mamíferos. Las reacciones se hicieron durante los tiempos acusados y se analizaron por hincha occidental. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Controles y visión general del protocolo. (A) Se utilizaron para la desubiquitinización de H2A para la desubiquitinización de H2A en nucleosomas. Los nucleosomas incubados con tampón solos o con eluciones obtenidas de la purificación simulada también se incluyeron como controles. (B) BAP1 no desubiquitina H2A K13/K15 cuya ubiquitinación está mediada por la ligasa RNF168 E3. Las células HEK293T fueron co-infectadas con H2A K13R/K15R o H2A K118R/K119R junto con RNF168 para garantizar la ubiquitinación en residuos K13/K15. Los nucleosomas purificados fueron utilizados para la desubiquitinación por los complejos BAP1. La reacción se detuvo en diferentes momentos y se sometió a inmunoblotting. (C) Purificación de DEUBAD no ubiquitinizado y monoubiquitinizado en complejo con BAP1 a partir de células de mamíferos. El complejo purificado se utilizó para el ensayo de desubiquitinación en nucleosomal H2A K119ub. Las reacciones se realizaron para los puntos de tiempo indicados y se analizaron mediante la hincha occidental. (D) BAP1 desubiquitiniza H2A K119ub in vivo. Las células HEK293T fueron co-infectadas con mutantes H2A o H2A (H2A K118R, K119R, K118R/K119R o K13R/K15R) junto con construcciones BAP1 y ASXL2. Dos días después de la transfección, las células se cosecharon para inmunoblotting utilizando los anticuerpos indicados. (E) Representación esquemática del flujo de trabajo experimental. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Hay varias ventajas de establecer ensayos robustos de ubiquitinación in vitro y desubiquitinación para proteínas de interés. Estos ensayos se pueden utilizar para: (i) establecer condiciones óptimas y definir requisitos mínimos para estas reacciones, (ii) determinar constantes cinéticas y bioquímicas enzimáticas, (iii) definir las funciones de los cofactores o inhibidores que pueden afectar a estas reacciones, (iv) identificar interfaces de interacción, (v) probar el impacto de mutaciones artificiales o asociadas a la enfermedad y (vi) establecer condiciones de ensayo que se pueden utilizar más para desarrollar ensayos de cribado químico de alto rendimiento. Aquí, ejemplificamos estos ensayos describiendo cómo realizamos la ubiquitinación Mediada por H2A con BMI1/RING1B y la desubiquitinación H2A mediada por BAP1/ASXL en sustratos nucleosomales.

La ubiquitinación de histono H2A se puede recapitular in vitro utilizando componentes mínimos, ya que se puede observar una ubiquitinación casi completa de H2A utilizando el complejo BMI1-RING1B. Cabe destacar que esta reacción se lleva a cabo en nucleosomas recombinantes. Estos tienen la ventaja de estar libres de otras histonas modificaciones post-traduccionales que se producen en células de mamíferos. Sin embargo, la reacción de ubiquitinación también se puede llevar a cabo eficientemente en nucleosomas nativos. Si la reacción de ubiquitinación es débil, la relación entre las enzimas frente a los sustratos puede aumentarse para observar la ligadura óptima de ubiquitina. Cabe destacar que si se deben realizar reacciones de desubiquitinización o ensayos de interacción después de la ubiquitinación del sustrato, la ubiquitinación se puede llevar a cabo directamente en sustratos ligados a perlas. El sustrato ubiquitinizado se puede recuperar tirando hacia abajo y el sobrenadante que contiene los componentes de la reacción de ubiquitinación se puede desechar. Sin embargo, cuando se deben establecer características enzimáticas, es necesario eludar las enzimas y evaluar la estequiometría de los componentes mediante cromatografía de exclusión de tamaño.

La reacción de desubiquitinación requiere menos componentes que la reacción de ubiquitinación. Sin embargo, la purificación de la DEUBAD por sí sola generalmente conduce a la precipitación de proteínas. Es importante destacar que cuando el DEUBAD se purifica con BAP1, esto aumenta en gran medida su solubilidad. Cabe destacar que sugerimos realizar ensayos de desubiquitinización con varias cantidades del sustrato y el complejo enzimático. La reacción de desubiquitinación puede ser inhibida por cantidades excesivas de cromatina, que probablemente puede explicarse por el aumento de las concentraciones de inhibidores asociados con los nucleosomas. También observamos desubiquitinación con exceso de BAP1 libre. Por lo tanto, deben incluirse varios controles, como la incubación de nucleosomas con BAP1 solo (Figura2A). También es importante tener en cuenta que algunos DUB podrían co-purificar con cromatina, y aunque tratamos la cromatina con NEM, los DUB podrían reactivarse parcialmente tras la adición de TDT, lo que reduce la cisteína catalítica. Además, los DUB de metaloproteinasa también podrían estar presentes, y estas enzimas son insensibles a NEM y, por lo tanto, no se inhiben. Por lo tanto, se deben incluir controles adicionales que consistan únicamente en nucleosomas sin añadir enzimas y mutante muerto catalítico DUB (Figura2A). Cabe destacar que la especificidad de la actividad DE BAP1 DUB hacia H2A K119ub está bien documentada y fue validada en nuestras condiciones de ensayo. Hemos purificado de células HEK293T nucleosomas que expresan H2A K118/K119R o H2A K13/K15R. La expresión de RNF168 conduce a una importante ubiquitinación en K13/K15. La actividad DE BAP1 DUB sólo se observa en nucleosomas que contengan H2A K13/K15R correspondientes a H2A K119ub (Figura2B). Otra consideración es que las modificaciones post-traduccionales que pueden ser críticas para la actividad enzimática probablemente no estén presentes en las proteínas bacterianas. Por lo tanto, las reacciones in vitro utilizando componentes purificados a partir de células de mamíferos también podrían considerarse35. Por ejemplo, la monoubiquitinización de DEUBAD, un proceso observado en eucariotas superiores, promueve en gran medida la actividad delaubiquitinasa de BAP135 (Figura2C). Por lo tanto, también se podría considerar la purificación de componentes de células de mamíferos. Además de las reacciones in vitro, es posible controlar la actividad DE BAP1 DUB directamente en las células después de la transfección. Por ejemplo, la transfección de células HEK293T con construcción H2A puede dar una señal clara de H2A K119ub debido a su abundancia en las células. En estas condiciones, la mayor parte de la ubiquitinación ocurre en los residuos K118/K119, ya que la mutación de estos sitios a la arginina conduce a la ausencia completa de ubiquitinación H2A (Figura2D). La co-expresión de BAP1 y ASXL2 junto con H2A permite concluir sobre la actividad BAP1 DUB en las células. Sin embargo, varios puntos deben considerarse como sobreexpresión puede dar lugar a resultados erróneos. Por lo tanto, estos experimentos necesitan ser optimizados y bien controlados.

En resumen, los protocolos descritos aquí, recapitulados en la Figura 2E,son sencillos, no requieren una infraestructura especializada o una configuración experimental, y se pueden escalar para producir cantidades sustanciales de nucleosomas modificados para múltiples aplicaciones aguas abajo, incluyendo ensayos enzimáticos, espectrometría de masas y ensayos de interacción proteína-proteína.

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Disclosures

Los autores no declaran intereses financieros en competencia.

Acknowledgments

Agradecemos a Diana Adjaoud por la asistencia técnica. Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Consejo de Investigación en Ciencias Naturales e Ingeniería de Canadá (2015-2020), Genome Quebec (2016-2019) y Genome Canada (2016-2019) a E.B.A. E.B.A. es un estudiante senior de los Fonds de la Recherche du Québec-Santé (FRQ-S). L.M y N.S.K. tienen una beca de doctorado del FRQ-S. H.B tenía una beca de doctorado del Ministerio de Educación Superior y de Investigación Científica de Túnez y la Fundación Cole.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amylose agarose beads New England Biolabs #E8021
Amicon Ultra 0.5 mL centrifugal filters 10K Sigma-Aldrich #UFC501096
Anti-H2AK119ub (H2Aub) Cell Signaling Technology #8240
Anti-Flag-agarose beads Sigma-Aldrich #A4596
Anti-protease cocktail Sigma-Aldrich #P8340
BL21 (DE3) CodonPlus-RIL bacteria Agilent technologies #230240
DMEM Wisent #319-005-CL
Empty chromatography column Biorad #731-1550
Flag peptide Sigma-Aldrich #F3290
GSH-agarose beads Sigma-Aldrich #G4510
HEK293T ATCC #CRL-3216
Imidazole Sigma-Aldrich #I5513
Micrococcal nuclease (MNase) Sigma-Aldrich #N3755
Ni-NTA agarose beads ThermoFisher Scientific #88221
N-methylmaleimide (NEM) Bioshop #ETM222
Pore syringe filter 0.45 μm Sarstedt #83.1826
Polyethylenimine (PEI) Polysciences Inc #23966-1
pGEX6p2rbs-GST-RING1B(1-159)-Bmi1(1-109) Addgene #63139
Ub Activating Enzyme (UBE1) Boston Biochem #E-305
UBCH5C (UBE2D3) Boston Biochem #E2-627

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References

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Bioquímica Número 149 ubiquitinación desubiquitinación ligasa de ubiquitina E3 PRC1 deubiquitinasa PR-DUB cromatina BAP1 ASXL BMI1 RING1B H2A
Ensayos in Vitro Ubiquitination y Deubiquitination de histonas nucleosomales
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