Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Nükliosomal Histones in vitro Ubiquitination ve Deubiquitination bulguları

Published: July 25, 2019 doi: 10.3791/59385
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1, 1, 1,2, 1,2
1Maisonneuve-Rosemont Hospital Research Center and Department of Medicine, University of Montréal, 2Lunenfeld-Tanenbaum Research Institute, Sinai Health System
* These authors contributed equally

Summary

Ubiquitination hücresel süreçlerde önemli roller oynar ve sıkıca deubiquitination tarafından koordine edilen bir post-translational modifikasyon olduğunu. Her iki reaksiyon kusurları insan patolojileri altında yatan. Biz arıtılmış bileşenleri kullanarak in vitro mayası ve deubiquitination reaksiyonu yürütmek için protokoller sunuyoruz.

Abstract

Ubiquitination çeşitli sinyalizasyon yolları önemli roller oynar ve özellikle kromatin fonksiyon ve DNA ilişkili süreçlerin koordinasyonunda yer alan bir post-translational modifikasyonudur. Bu modifikasyon E1 Ubiquitin-aktive, E2 Ubiquitin-konjugating ve E3 Ubiquitin-ligaz dahil olmak üzere çeşitli enzimlerin sıralı bir eylem içerir ve deubiquitinases (DUBs) tarafından tersine çevrilir. Ubiquitination proteinlerin bozulması veya enzimatik aktivite, protein-protein etkileşimi ve hücre altı lokalizasyonu modülasyonu dahil protein işlevinin değiştirilmesi indükler. Protein mayası veya deubiquitination gösteren kritik bir adım, arıtılmış bileşenlerle in vitro reaksiyonlar gerçekleştirmek için. Etkili mayası ve deubiquitination reaksiyonlar büyük ölçüde kullanılan farklı bileşenler tarafından etkilenebilir, enzim Co-faktörleri, tampon koşulları, ve substrat doğası.  Burada, biz mayası ve deubiquitination reaksiyonlar yürütmek için adım adım protokoller sağlar. Biz fare polycomb baskıcı kompleksi 1 (PRC1), BMI1 ve RING1B, lizin 119 üzerinde histon H2A monoubiquitinates bir E3 Ubiquitin ligaz en az bileşenleri kullanarak bu reaksiyonlar göstermektedir. Nükliosomal H2A deubiquitination, insan deubiquitinase BAP1 ve DEUBiquitinase adaptörü (DEUBAD) tarafından oluşturulan minimal Polycomb baskıcı Deubiquitinase (PR-DUB) kompleksi kullanılarak gerçekleştirilir, onun co-Factor ASXL2 alan. Bu ubiquitination/deubiquitination kuralları bakteriler-arıtılmış proteinler veya memeliler hücrelerinden arındırılmış yerli nükreosomlar ile yeniden rekombinant nüklisomes bağlamında yapılabilir. Bu reaksiyonlar üzerinde önemli bir etkiye sahip olabilecek inceliklerini vurgulıyoruz ve bu protokollerin genel prensiplerinin diğer E3 Ubiquitin ligazları ve deubiquitinases 'e hızlı bir şekilde uyarlanabilir olduğunu öneriyoruz.

Introduction

Ubiquitination en çok kayıtlı post-translational değişikliklerden biridir ve Maya, bitkiler ve omurgalı gibi organizmaların geniş bir yelpazede için önemlidir. Ubiquitination Ubiquitin kovalent eki oluşur, bir son derece koruma 76 amino asit polipeptide, proteinleri hedef ve üç sıralı adımda 3 enzim içeren oluşur, yani, E1-aktive, E2-konjugating ve E3 ligaz1, 2,3. Bu post-translational modifikasyon biyolojik süreçlerin geniş bir spektrumunda merkezi roller oynar. Gerçekten de, reaksiyon özgüllüğü sağlayan E3 Ligas, enzimlerin büyük bir süper ailesi oluşturur ve Ubiquitin sisteminin en bol enzimleri vardır4,5,6. Protein mayası aşağı akım etkileri modifikasyon doğası bağlıdır: monoubiquitination, Multi-monoubiquitination, ve doğrusal veya dallanmış polyubiquitination. Monoubiquitination nadiren proteasomal bozulması ile ilişkilidir, ancak bunun yerine bu değişiklik çeşitli sinyalizasyon olaylarını aracılık yer almaktadır. Polyubiquitination, N-terminali veya Ubiquitin molekülü içinde lizin kalıntıları içerir ve polyubiquitinated protein kaderi hangi kalıntı Ubiquitin zincir uzatma dahil bağlıdır. Uzun süre, Ubiquitin lizin 48 tarafından aracılı polyubiquitination proteasomal bozulması indükler bilinmektedir. Aksine, Ubiquitin lizin 63 ile polyubiquitination genellikle protein aktivasyonu ile ilişkilidir7,8,9. Diğer önemli post-translational değişikliklere benzer şekilde, mayası geri dönüşümlü ve proteinlerden Ubiquitin kaldırılması, hücresel süreçlerin önemli regülatörleri olarak ortaya çıkan deubiquitinases (Dubs) olarak adlandırılan spesifik proteinler tarafından sağlanır 2 , 10. önemlisi, birçok Dubs son derece uzmanlaşmıştır ve düzenleyen, deubiquitination yoluyla, belirli substratlar, mayası ve deubiquitination arasında ince bir denge protein fonksiyonu için kritik olduğunu gösteren. E3s ve Dubs, proteasom bozulma makine ve aksesuar faktörleri ile birlikte, birçok hücre büyümesi ve proliferasyon ile ilişkili olan büyük sinyal yolları düzenleyen Ubiquitin proteozom sistemi (UPS, > 1200 genler ile) formu, hücre kaderi belirlenmesi, farklılaşma, hücre göçü ve hücre ölümü. Önemlisi, mayası içeren çeşitli sinyalizasyon Cascades deregülasyon tümörijenezde ve Nörodejenerasyon hastalıkları teşvik5,11,12,13, 14oldu.

Ubiquitination kromatin biyoloji ve DNA bağımlı süreçlerde yaygın roller oynar15,16,17. Örneğin, lizin 119 (bundan sonra H2A K119ub) histon H2A monoubiquitination transkripsiyon baskı ve DNA onarım dahil kritik bir post-translasyonel modifikasyonudur18,19,20, 21,22. H2A K119ub, epigenetik bilgilerinin bakımını önemli bir rol oynayan ve Drosophila 'dan insana son derece muhafaza edilen Polycomb baskıcı kompleksi 1 (PRC1) tarafından katalizlenir. Canonical PRC1 özellikle RING1B ve BMI1, yukarıda belirtilen mayası olay22,23sorumlu çekirdek E3 Ubiquitin ligaz kompleksi tarafından oluşturulur. Drosophila, H2A monoubiquitination (H2A K119ub mammalians KARŞıLıK gelen H2A K118UB) Dub Calypso tarafından tersine, hangi ek seks tarak ile etkileşim (ASX) polycomb-BASKıCı Dub (PR-Dub) kompleksi oluşturan24. Calypso, BAP1, memeli ortoloğundan bir tümör bastırıcı silinmiş veya çeşitli insan malignite içinde inaktive olduğunu25,26,27,28, 29 , 30 ' dan fazla , 31 , 32 , 33. BAP1, endoplazmik retikulum33,34,35,36, çekirdek ve kalsiyum sinyalizasyon-aracılı apoptoz DNA bağımlı süreçleri düzenler 37 , 38 , 39 , 40 , 41 , 42. BAP1, özellikle ASXL1, ASXL2 ve ASXL3 (asxls), asx38,43üç ortolog transkripsiyon regülatörleri içeren Multi-subunit protein kompleksler birleştirir. Asxls deubiquitinase adaptörü (Deubad) etki alanı, ayrıca asxm etki alanı, BAP1 Dub aktivite35,36,44uyarmak için kullanın. Bu nedenle, asxls kromatin ve daha geniş tümör bastırıcı fonksiyonu BAP1 Dub aktivite koordine önemli roller oynar.

Çeşitli yöntemler, her yerde ve deubiquitination süreçleri incelemek için mevcut. Özellikle, bakterilerden arındırılmış proteinlerin kullanıldığı biyokimyasal maddeler, belirli substratlar ile doğrudan Ubiquitin veya çıkarılması ile ilgili olarak çok güçlü kalır. Bu deneyler, minimal kompleksleri ihtiyacını belirleme, reaksiyonlar kinetiği belirleme, yapı/fonksiyon ilişkilerini tanımlama ve patolojik etkisinin anlaşılması gibi bir dizi parametreyi araştırmak için yapılabilir. gen mutasyonları. Burada, saflaştırılmış bileşenlerle kromatin substratlar üzerinde her yerde ve deubiquitination reaksiyonları yapmak için protokoller sağlıyoruz. Bir model sistemi olarak, In vitro mayası ve nükliosomal H2A protein deubiquitination sunulmaktadır. RING1B/BMI1 ve BAP1/Deubad minimal kompleksleri içinde toplanan bakteriler-saflaştırılmış proteinler sırasıyla nükmonozomal H2A mayası veya deubiquitination için kullanılır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. GST-RING1B (1-159)-BMI1 (1-109) E3 Ubiquitin ligaz kompleksi GSH-agarose yakınlık arıtma

  1. PGEX6p2rbs-GST-RING1B (1-159 AA)-BMI1 (1-109aa) bakteri ifadesi oluşturmak BL21 (DE3) bakterileri (bkz. malzeme tablosu)23dönüştürmek için kullanın. Bu yapı, pgex-6p-2 omurgasında GST etiketiyle BMI1 etki alanı 1-109 için erimiş RING1B etki alanı 1-159 murine ifadesi sağlar.
  2. 100 μg/ml ampisilin ve 50 μg/ml chloramphenicol varlığı içinde 20 ml lb suyu Orta içinde GST-RING1B (1-159 AA)-BMI1 (1-109 AA) ifade eden RIS-bakterilerin Birmanya tarafından bir gecede marş kültürü gerçekleştirin. 37 °C ' de bir gecede sallayarak kulyur. Ertesi gün, 1 L Flask için Starter kültürü ekleyin 500 mL taze LB suyu Orta (1/26 seyreltme) ile ampisilin ve, 2 ila 4 h için 37 °C ' de Shaker kültür inküye.
  3. Kuluçka süresi boyunca, bir Spektrofotometre ile 600 Nm 'de OD ölçmek. Ne zaman bakteri kültürü ulaşır 0,6 od birimleri 600 Nm, bir 1 ml Kısım 1, 5 ml tüp olarak non-indüklenmiş örnek. Protein ifadesini teşvik etmek için 1 L kültürüne 400 μM Isopropresl β-D-1-thiogalactopyranoside (ıPTG) ekleyin. Bakterileri 25 °C ' de 6 saat için geceleyin.
    1. 30 s için 14.000 x g at 1 ml plakaya Santrifüjü, supernatant atın, nemmli numune tampon 200 μL içinde Pelet pelletini, ve SDS-sayfa ve Coomassie mavi analiz protein indüksiyon için tutun.
  4. İndüklenen bakteri kültürünü Flask 'dan temiz bir santrifüjleme şişesine aktarın ve 3.500 x g 'de 4 °c ' de 15 dakika aşağı döndürün. Süpernatant atın ve 40 ml soğuk PBS ile Pelet pelletini ve 4 °c ' de 15 dakika için 3.500 x g aşağı spin.
  5. Süpernatant atın ve-80 °c ' de Pelet dondurmak veya bir sonraki adıma geçin. Proteinler beklenen moleküler ağırlıkta indüklenmiş ise, bir sonraki adıma geçin.
  6. Buz-soğuk lizis Tampon A (50 mm Tris-HCl pH 7,5, 25 ml bakteri Pelet resuspend, 100 mm NaCl, 1 mm EDTA, 1% NP40 mm pmsf, 0,5 mm DTT, ve 1/100 anti-proteaz kokteyl içeren AEBSF, Aprotinin, Bestatin, E-64, Leupeptin, ve pepstatin A). Tüm bakteri Pelet resuspended emin olun. PMSF ve anti-proteaz kokteyli, sadece bakteri lizisi sırasında lizis tampona taze olarak eklenmelidir.
    Dikkat: Numuneyi her zaman buzda tutun.
    Not: 100 μg/mL 'de lysozyme bakteriler liziz geliştirmek için eklenebilir.
  7. 15 dakika boyunca buzda lysate bakterileri kuluçk. bir prob sonicator kullanın ve 30 s (4 – 5x) için 70% çıkış amplitüd de sonikat ve sonra 4 °C ' de 20 dakika için 21.000 x g Santrifüjü.
    Dikkat: Sonication sırasında, her zaman buz üzerinde örnekleri tutun.
  8. Santrifüjleme sırasında, 15 mL 'Lik bir tüpte 500 μL paketlenmiş GSH-agarose boncuk (% 50 Bulamaç) alın ve PMSF ve anti-proteazlar olmadan 10 mL Tampon a ekleyin. Mix kısaca ve 4 °C ' de 3 dakika 2.500 g spin, bu yıkama adımını iki kez daha tekrarlayın ve buz üzerinde boncuk tutmak.
  9. Bakteriyel lysate santrifüjleme sonrasında, süpernatant toplamak ve bir 50 ml konik tüp içine aktarmak. Toplam lysate olarak 100 μL bir kısım alın ve sds-page ve Coomassie mavi analizi için 100 μL 2x laemmli örnek tampon ekleyin.
  10. 0,45 μm gözenek şırınga filtresi ile lysate filtre ve GSH boncuklar ile karıştırın. 5 h için sallayarak 4 °c ' de inkük. 3 dakika 2.500 x g boncuklar aşağı spin, kaldırmak ve akış yoluyla süpernatant kaydedin. Proteinler-GSH bağlı boncuk 6 kez (5 mL her) Tampon A içeren anti-proteaz kokteyl ve PMSF ile yıkayın.
  11. Son yıkama sonra, boş bir kromatografi sütun içine tampon 10 ml ile birlikte boncuklar aktarmak, 1,5 ml arabellek A içeren 25 mm glutatyon eklemek ve 1,5 ml mikrotüpler içine yerçekimi ile elüsyon toplamak. Elüsyon prosedürünü 4 kez tekrarlayın.
    Not: Glutatyon stok solüsyonu 50 mM Tris-HCl, pH 7,5 200 mM konsantrasyonda hazırlanır
  12. 4 elutions her biri 10 μL bir kısım alın ve 10 μL 2x laemmli örnek tampon ekleyin. Bu numuneler, arıtılmış proteinlerin varlığını ve saflığını belirlemek için SDS-PAGE ve Coomassie mavi analizinde kullanılacaktır.
    Not: Son elüsyonu takiben, geri dönüşümü ve gelecekteki kullanım için 4 °C ' de tampona boncuk tutun.
  13. Daha fazla analiz için makul miktarlarda arıtılmış proteinleri gösteren elleşmiş fraksiyonları seçin. Hazırlık küçük plakaya olun. Arıtılmış proteinleri-80 °C ' de saklayın. Genellikle, protein konsantrasyonu 0,5 μg ila 2 μg ila μL arasında değişir ve numuneler bu durumda depolanabilir.
  14. Isteğe bağlı: 10K Santrifüjlü filtre ünitesi kullanılarak numune veya değişim tamponunu konsantre etme

2. BAP1/DEUBAD (ASXL2) Deubiquitinase kompleksi arıtma

  1. Kullanım pET30a +-onun-BAP138 ve PDEST-MBP-Deubad (ASXL2)35 bakteriyel Ifade oluşturur bl21 (de3) RIS bakteri üretimi IÇIN RIS-BAP1 ve MBP-Deubad sırasıyla.
  2. Onun-BAP1 ve MBP-Deubad (ASXL2), 50 μg/ml kloramfenikol içeren ampisilin orta lb suyu ile 20 ml 'de bakteri ifade ederek iki ayrı gecede marş kültürlerini gerçekleştirin ve her bir plazmid için ilgili antibiyotik, 100 μg/ ml kanamisin veya 100 μg/ml ampisilin sırasıyla. 37 °C ' de Shaker üzerine yerleştirin.
  3. 1.3 – 1.6 arasındaki adımları gerçekleştirin.
  4. 25 mL buz-soğuk lizis tampon B (50 mM Tris pH 7,3, 500 mM NaCl, 3 mM β-Mercaptoetanol, 0,2% Triton X-100, 1 mM PMSF ve 1/100 anti-proteaz kokteyl) içinde bakteri Pelet resuspend. MBP-Deubad endoglikozidazları ile onun-BAP1 eşit hacimleri karıştırın ve 15 dakika boyunca buzda inküye ve sonra protokol 1 ' de belirtildiği gibi lysate santrifüjle (adım 9).
    1. Santrifüjleme sırasında 500 μL paketlenmiş ni-NTA agaroz boncukları (% 50 Bulamaç) PMSF ve anti-proteaz kokteyl olmadan B tampon ile üç kez yıkayarak hazırlayın.
  5. Bakteriyel lysate santrifüjleme sonrasında, süpernatant toplamak ve bir 50 ml konik tüp içine aktarmak. Toplam lysate olarak 100 μL bir kısım alın ve sds-page ve Coomassie mavi analiz için 2x laemmli örnek tampon 100 μL ekleyin.
  6. 0,45 μm gözenek şırınga filtresi ile lysate filtre ve ni-NTA boncuklar ile karıştırın. 5 h için sallayarak 4 °c ' de inkük. 3 dakika 2.500 x g boncuklar aşağı spin, kaldırmak ve akış yoluyla süpernatant kaydedin.
    1. 20 mM 1, 3-Diaza-2, 4-cyclopentadiene (Imidazol) içeren Tampon B ile 6 kez (5 ml) boncuk yıkayın.
      Not: pH 7,3 de 2 M imidazol bir stok çözüm olun.
  7. Son yıkamadan sonra, boncukları 10 mL tampon ile boş bir kromatografi sütununa aktarın, 200 mM ımidazol içeren 1 mL Tampon B ekleyin ve 10 ΜL dtt (500 mm) ve 2 ΜL edta (500 mm) Içeren 1,5 ml mikrotüplere yerçekimi ile elüsyonu toplayın , pH: 8). elüsyon prosedürünü 4 kez tekrarlayın. SDS-PAGE ve Coomassie mavi analizi için 10 μL her bir elüsyon fraksiyonu alın ve 10 μL 2x Laemmli örnek tampon ekleyin. İstenen el kesirleri havuzla.
    Not: Boncukları geri dönüşüm ve gelecekteki kullanım için 4 °C ' de tampon olarak saklayın.
  8. Amiloz agaroz boncuklar ile kuluçtan önce C tampon (50 mm Tris pH 7,3, 300 mm NaCl, 1% Triton X-100, 5 mm DTT, 1 mm EDTA, 1 mm PMSF ve 1/100 proteaz inhibitörü kokteyli) ile 3 kez seyreltilmiş kompleks.
    1. PMSF ve anti-proteaz kokteyli eklemeden 2 kez Tampon C ile yıkayarak Amiloz agaroz boncukları (500 μL paketlenmiş) hazırlayın. Boncukları seyreltilmiş elüsyona ekleyin ve gece 4 °C ' de inküye yapın.
  9. 2.500 x g 'de 3 dakika santrifüjün ve akışına devam edin. Proteinleri-Bounds boncuk 5 mL Tampon C (5 – 6x) ile yıkayın.
  10. (50 mm HEPES pH 8,0, 50 mm NaCl,% 10 gliserol ve 1 mm DTT) Tampon D 'de Amiloz agaroz boncuklar üzerinde arıtılmış onun-BAP1/MBP-Deubad kompleksi tutun ve-80 °c saklayın. Boncuk fraksiyonunun 20 μL 'ini alın (% 50 boncuk çözeltisi) ve SDS-PAGE ve Coomassie mavi analizi için 20 μL 2x Laemmli örnek tampon ekleyin.

3. HEK293T hücrelerden Nükenosomların arıtılması

  1. Kültür HEK293T hücreleri tam Dulbecco modifiye kartal Orta (DMEM) ile tamamlayıcı 5% yenidoğan buzağı serum (NBS), 2 mM L-glutamin, ve 1% penisilin/streptomisin.
  2. Transfeksiyondan bir gün önce 15 cm kültür yemeği başına 20 mL 'Lik tam medyada 12 x 106 HEK293T hücre etrafında plaka (10 yemek kullanılmıştır). Transfeksiyondan önce, hücrenin orta-12 mL 'yi serum-serbest orta olarak değiştirin ve 1 mg/mL3663 μL polilenimine (PEI) kullanarak 21 μg pCDNA-Flag-H2A ile hücreleri transfekt. Tamamlamak için Değiştir orta 12 saat sonra.
  3. Üç gün sonrası transfeksiyon, hücreleri 15 mL buz soğuk PBS (iki kez) ile yıkayın ve bir hücre sıyırıcı kullanarak 3 mL buz-soğuk PBS içinde hasat edin. 2.100 x g 'de 4 °c ' de 8 dk Santrifüjü. PBS 'i atın ve lizis adımına geçin veya-80 °c ' de hücre peleti dondurabilirsiniz.
  4. Yaklaşık 10 hacim Tampon E (50 mm Tris-HCl pH 7,3, hücre Pelet resuspend, 420 mm NaCl, 1% NP-40, 1 mm MgCl2, 1 mm PMSF, 1/100 proteaz inhibitörü kokteyli ve 20 mm N-metilmaleimide (nem)) ve 20 dakika boyunca buzun üzerine inkulat N-metilmaleimid (NEM) nükle ile birlikte arındırılmış DUBs inhibe etmek için önemlidir.
  5. 5 dk için 3.000 x g santrifüjleme sonra, süpernatant atın ve tampon E. Mix 10 hacim içinde kromatin Pelet pelletini Inversion ve santrifüj tarafından 3.000 x g için 5 dk.
    1. Tampon F "mnase buffer" (20 mm Tris-HCl pH 7,5, 100 mm KCL, 2 mm MgCl2, 1 mm cacl2, 0,3 M SUCROSE, 0,1% NP-40, 1 mm PMSF ve 1/100 proteaz inhibitörü kullanarak tamponu yeniden kullanarak başka bir zaman kokteyl).
      DIKKAT: Pellet yıkanma ve santrifüjleme sırasında yüzen olacaktır.
  6. Kromatin 5 ml Tampon F 'de resuspend ve mikrococcal nükleaz (mnase) ile Pelet Treat (Oda sıcaklığında 10 dakika için 3 U/ml).
    Not: Reaksiyon bir Dons Homogenizer kullanarak karıştırılarak destekli olabilir.
  7. İnkübasyon işleminden sonra, nükkozomal DNA parçacıklarının analizi için 40 bir μL alketi alın. Bu kısım ile karıştırın 40 μL fenol/kloroform ve 20 μl 6x DNA yükleme tamponu, Vortex, spin 18.000 x g için 2 dakika, ve% 2 agaroz jel DNA yükleyin.
    1. DNA ağırlıklı olarak mononükleosomes 'e karşılık gelen bir 147 BP parçası olduğunda, son konsantrasyonda 5 mM EDTA ekleyerek reaksiyonu durdurun.
  8. 21.000 x g 'de 4 °c ' de 20 dakika santrifüjleme sonrasında, 4 °c ' de gece Anti-Flag reçinesi ile çözünür kromatin fraksiyonu inkübasyon yapın. 6 x Tampon G (50 mm Tris-HCL, pH 7,3, 5 mm edta, 150 mm NaCl, 1% NP-40, 1 mm PMSF, 1 mm dtt, 1/100 proteaz inhibitörleri kokteyli) ile boncukları yıkayın.
  9. 5 mL Tampon G ile boncukları boş bir kromatografi sütununa aktarın. 200 μg/mL bayrak elüsyon peptid ile boncuk-bağlı nükosomes elute. 200 μg/mL bayrak elüsyon peptitleri (bkz. malzeme tablosu) ve 1/5 (Vol: Vol) 1 M Tris, pH 8,0 Içeren Tampon G 'den oluşan bir elüsyon tamponu kullanın. 260 μL bayrağı elüsyon tampon (2 saat her elüsyon) ile nükselosomes 3x elute.
  10. Fenol-kloroform ekstraksiyon için bir kısım alarak 3 elutions test ve% 2 agaroz jel DNA yükleyin. Her bir elüsyon fraksiyonu için 10 μL alın ve SDS-PAGE ve Coomassie mavi analizi için 10 μL Laemmli örnek tampon 2x ekleyin Elüsyon-80 °c ' de saklayın. Genel olarak, insan hücrelerinden arıtma bakterilerden daha az miktarda protein verir, 0,1 ila 0,5 μg/μL arasında değişen konsantrasyonlarda.

4. BMI1/RING1B E3 Ubiquitin ligaz kompleksi kullanılarak nükliobazı Ubiquitination assay

  1. Nükstrenosomları 10K gözenek 0,5 mL Santrifüjlü filtreler aracılığıyla Santrifüj filtreleri ile reaksiyonu tampondan H (25 mm Tris, pH 7,5; 10 mm MgCl2ve 5 mm ATP) olarak değiştirin. Alternatif olarak, ticari olarak kullanılabilir nükosomes tahlil için kullanılabilir.
    Not: Substrat süspansiyon çözeltisini reaksiyon tamponunun değiştirilmesi, yeniden Üretilebilirlik sağlar ve Flag erüsyon karışımında bulunan bileşikler tarafından olası E3 ligaz inhibisyonu önler.
  2. 40 μL Tampon Htoplam hacminde 1 μg nüktrinosomların inküyü. UB aktive enzim (UBE1) (250 ng), UB (50 ng/μL) ve E2 UB-konjugating enzimleri (672 ng) ve 1 μg BMI1/RING1B E3 Ubiquitin ligaz kompleksini ekleyin. Zaman zaman sallama ile 37 °C ' de 3 h için reaksiyonu inküt.
    Not: Birden fazla kontrol, E1, E2, E3, ATP ve Ubiquitin dahil olmak üzere paralel olarak yapılabilir. Bu, en fazla reaksiyon için özgüllüğü sağlar.
  3. Standart prosedürlere göre 40 μL 2x laemmli numune tamponunu ekleyerek reaksiyonu durdurun ve sds-page ve Western blotting tarafından histon H2A K119 mayası analizini yapın. Anti-H2A veya anti-H2A K119ub antikorları kullanın (bkz. malzeme tablosu).

5. BAP1/DEUBAD kullanarak In vitro Nükmosomal H2A DUB assay

  1. In vitro deubiquitination assay için saflaştırılmış nüklizomleri kullanın. 40 μL Tampon I (50 mm Tris-HCL, pH 7,3, 1 mm MgCl2, 50 mm NACL ve 1 mm DTT) içinde nükstrozların 100 – 500 ng resuspend. 1 μg BAP1 bakteri-BAP1 ve MBP-DEUBAD ekleyin. 37 °C ' de zaman zaman sallayarak 3 h için deubiquitination reaksiyonu gerçekleştirin.
  2. 2x Laemmli tampon 40 μL ekleyerek ve İmmünoblotting ile analiz ederek in vitro reaksiyonu durdurun.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

GST-BMI1 ve RING1B proteinleri iyi bakterilerde üretilmektedir ve çözünür fraksiyonda kolayca ayıklanabilir. Şekil 1a GST-BMI1-RING1B kompleksi tipik bir arıtma Için bir Coomassie mavi boyama gösterir. GST-BMI1 ve RING1B bantları beklenen moleküler ağırlıkta, ~ 45 kDa ve ~ 13 kDa sırasıyla göç. Özellikle E3 ligaz kompleksi çok düşük düzeyde bakteri proteinlerinin kontaminantları ve/veya bozulma ürünleri ile son derece homojen. Dahası, arıtma kompleksinin stoichiometri en uygun olan, 1:1 bir molar oranı ile, GST-RING1B proteinin bant yoğunluğu BMI1 daha iki ila üç kat daha güçlü olması bekleniyor. Benzer şekilde, onun-BAP1/MBP-DEUBAD kompleksinin arıtılması da sırasıyla ~ 90 kDa ve ~ 55 kDa gruplarıyla nispeten yüksek homojen preparatlarla sonuçlandı (Şekil 1B). BAP1 ve DEUBAD 'ın tandem benzeşmesi, nikel-agarose ve Amiloz-agarose aracılığıyla sırasıyla sağlar ve yeterli stoichiometri ve serbest BAP1 arındırılmış komplekste kaldırılması. Öte yandan, arıtılmış nükleozomal fraksiyonu aslında yüksek zenginleştirilmiş mononükleozomal fraksiyonunun varlığını gösteren 147bp bant tarafından oluşur (Şekil 1C). Bu saflaştırılmış nükposomların Coomassie mavi boyama stoichiometrik miktarlarda dört histon alt birim tipik bir bant deseni gösterir (Şekil 1D). Ticari olarak kullanılabilen rekombinant mononükleosomes, sırasıyla sds-page ve agaroz jelleri üzerinde göç ettiğinde benzer protein ve DNA desenlerini de görüntüler. Not, H2A ve Flag-H2A monoubiquitinated formları kolayca HEK293T-saflaştırılmış nükmonosomes ayırt edilebilir. Biz E1/E2/Ubiquitin/ATP ile birlikte rekombinant nüklenosomları kullanılan ve BMI1-RING1B kompleksi ile histon H2A mayası proteinin uiquitinated formun zaman bağımlı bir artış gösterir, iken olmayan değiştirilmiş formun seviyeleri uyumlu olarak azaldı. Neredeyse tüm H2A proteinlerin H2A K119ub (Şekil 1E) dönüştürüldüğü için, en iyi şekilde dönüşüm reaksiyonu toplam. Öte yandan, deubiquitination tahlil yerli nüklisomes üzerinde yapılmıştır. Bu nüklenlerin BAP1/DEUBAD ile kuluçka işleminden sonra, H2A K119ub sinyalinin zamana bağlı olarak azaltılması (Şekil 1F) izlendi. Anti-H2A K119ub ile gözlenen H2A iki bandın, sırasıyla ~ 30 kDa ve ~ 25 kDa bandında göç eden Flag-H2A ve endojen H2A taşınırken karşılık geldiğini unutmayın.

Figure 1
Şekil 1: arıtma, ubiquitination ve deubiquitination. (A) GST-RING1B-BMI1 proteinleri ve analiz Coomassie mavi boyama kullanarak arıtma. GST-RING1B-BMI1, bakterilerde üretilmektedir ve GST benzeşimi boncukları kullanılarak arıtıldı. Arıtma saflık ve proteinleri boyutunu onaylamak için, elutions% 15 SDS-sayfa jel yüklendi ve Coomassie mavi ile lekelenmiş. Farklı miktarda BSA protein miktarını belirlemek için kullanılır. Lekeli jel şekil oluşturmak için tarandı. (B) MBP-DEUBAD/onun-BAP1 kompleksi arıtma. MBP-DEUBAD ve onun-BAP1 bakterilerde ayrı olarak üretilmektedir. Lizis sonra, MBP-DEUBAD ve onun-BAP1 karışık ve nikel ve maltoz boncuklar kullanılarak saflaştırılmış. Arıtılmış kompleks% 8 SDS-PAGE jel üzerine yüklendi ve Coomassie mavi ile lekelenmiş. (C) mnase tedavisinin ardından mononükleosome arıtma. Kromatin HEK293T gelen pcDNA. 3 bayrak-H2A çıkarılan ve mononükleosomes üretmek ve arındırmak için MNase ile tedavi edildi. Mononükleosome nesil onaylamak için, kromatin bir kısmı fenol kloroform ekstraksiyon ve UV ışığı altında algılama için alınmıştır. % 2 agaroz jeli üzerinde yükleme, mononükleosome 'in tipik 147 baz çifti DNA parçasını ortaya çıkarır. (D) Coomassie mavi boyama için saflaştırılmış mononucleosomes kullanılmıştır. (E) nüklizomların in vitro olarak yayılmasını önler. Rekombinant nüklozomlar, belirtilen zamanlar için 37 °C ' de bakteriyel arıtılmış E3 Ubiquitin ligaz Dimer, GST-RING1B/BMI1 ve E1/E2/ATP/Ubiquitin ile kulkarlanmış. H2A monoubiquitination (H2A K119ub) Batı şişme tarafından analiz edildi. (F) BAP1/DEUBAD deubiquitinase KOMPLEKSI kullanarak H2A K119ub deubiquitination assay. In vitro deubiquitination, bakteri kullanılarak yürütülmüştür onun-BAP1/MBP-DEUBAD ve memelilerin saflaştırılmış nüklizomları arıtılmış. Tepkiler suçlanan zamanlar için yapılmış ve Batı blotting tarafından analiz edildi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2: denetimlere ve protokole genel bakış. (A) NÜKLÜK BAP1 ya da katalitik ölü mutant (C91S) yanı sıra bakteri-saflaştırılmış rekombinant BAP1 IÇIN kullanılan H2A deubiquitination üzerinde çekirdekozomlar. Tek başına tampon ile veya sahte arıtma ile elde edilen elleri ile kümünosomes da kontrol olarak dahil edildi. (B) BAP1 RNF168 E3 ligaz tarafından ARACıLı H2A K13/K15 deubiquitinate değil. HEK293T hücreleri, H2A/K118R kalıntıları üzerinde mayası sağlamak için K119R ile birlikte H2A K13R/K15R veya RNF168 K13/K15 ile ortak transfikasyon yapıldı. BAP1 kompleksleri tarafından deubiquitination için saflaştırılmış nüklizomler kullanılmıştır. Reaksiyon farklı zaman noktalarında durdu ve İmmünoblotting maruz kaldı. (C) mammalin HÜCRELERINDEN BAP1 ile kompleks olmayan-ubiquitinated ve monoubiquitinated DEUBAD arıtma. Saflaştırılmış kompleks, nükposomal H2A K119ub üzerinde deubiquitination tahlil için kullanılmıştır. Tepkiler belirtilen zaman noktaları için yapılmış ve Batı blotting tarafından analiz edildi. (D) BAP1 deubiquitinates H2A K119ub in vivo. HEK293T hücreleri, K118R ve K119R yapıları ile birlikte H2A veya H2A mutantlar (H2A K118R, K119R, K13R/K15R veya BAP1/ASXL2) ile ortak transferat edilmiştir. İki gün sonrası transfeksiyon, hücreler belirtilen antikorları kullanarak İmmünoblotting için hasat edildi. (E) deneysel iş akışının şematik temsili. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

İlgi proteinleri için sağlam In vitro mayası ve deubiquitination asder kurulmasının çeşitli avantajları vardır. Bu göstericiler için kullanılabilir: (i) optimum koşullar kurmak ve bu reaksiyonlar için minimal gereksinimi tanımlamak, (ii) enzimatik kinetik ve biyokimyasal sabitler belirlemek, (iii) bu reaksiyonları etkileyebilir Kofaktörler veya inhibitörlerin rollerini tanımlamak, (iv) etkileşim arayüzlerini tanımlayın, (v) yapay veya hastalıkla ilişkili mutasyonların etkisini test edin ve (vi) yüksek verimlilik kimyasal tarama testleri geliştirmek için daha fazla kullanılabilecek tahlil koşulları oluşturun. Burada, biz BMI1/RING1B-aracılı H2A mayası ve BAP1/asxl-aracılı H2A deubiquitination nükliosomal substratlar üzerinde nasıl gerçekleştiriyoruz açıklayan bu kuralları örnek.

Histon H2A, en az bileşenleri kullanarak in vitro olarak reapitüle edilebilir, BMI1-RING1B kompleksi kullanılarak H2A 'nin neredeyse komple mayası izlenebilir. Not, bu reaksiyon rekombinant nükostozlar üzerinde gerçekleştirilir. Bunlar, memelinin hücrelerinde meydana gelen diğer Histonlar sonrası translasyonel değişikliklerden özgür olma avantajına sahiptir. Yine de, mayası reaksiyonu da etkili bir şekilde yerli nüklemosomes üzerinde yapılabilir. Eğer her yerde reaksiyonu zayıf ise, enzimlerin substratlar karşı oranı optimum Ubiquitin ligasyon gözlemlemek için artırılabilir. Not, Eğer deubiquitination reaksiyonlar veya etkileşim kuralları substrat mayası aşağıdaki yapılmalıdır, daha sonra mayası doğrudan boncuklar Bağlı substratlar üzerinde yapılabilir. En üst düzey substrat, Pull-Down ile kurtarılabilir ve mayası reaksiyonunun bileşenlerini içeren süpernatant atılabilir. Ancak, enzimatik özellikleri kurulacak olduğunda, enzimlerin ve boyutları dışlama kromatografi ile değerlendirilen bileşenlerin stoichiometri elüe gerekir.

Deubiquitination reaksiyonu, daha az bileşen gerektirir. Ancak, tek başına DEUBAD arıtma genellikle protein yağış yol açar. Önemlisi, DEUBAD BAP1 ile temizlediğinizde, bu büyük ölçüde onun çözünürlüğünü artırır. Not, biz substrat ve enzim kompleksi çeşitli miktarlarda deubiquitination araştırmayı yapmanızı öneririz. Deubiquitination reaksiyonu kromatin fazla miktarda inhibe edilebilir, hangi muhtemelen nüklizomlar ile ilişkili inhibitörler artan konsantrasyonları ile açıklanabilir. Ayrıca ücretsiz BAP1 aşan deubiquitination gözlenen. Bu nedenle, birden fazla kontrolün dahil edilmesi gerekir (Şekil 2a) BAP1 tek başına nükostozomlar gibi. Ayrıca bazı DUBs kromatin ile Co-arındırmak olabilir dikkat etmek önemlidir, ve biz NEM ile kromatin tedavi olsa bile, DUBs kısmen katalitik sistein azaltır DTT ek olarak yeniden aktif olabilir. Buna ek olarak, metalloproteinaz DUBs da mevcut olabilir, ve bu enzimler NEM duyarsız ve böylece engellenmiş değildir. Bu nedenle, ek kontroller enzimler ve DUB katalitik ölü mutant (Şekil 2a) eklemeden sadece nüklüsomes oluşan dahil edilmelidir. Not, H2A K119ub doğru BAP1 DUB aktivite özgüllüğü iyi belgelenmiş ve bizim tahlil koşullarında doğrulandı. H2A K118/K119R veya H2A K13/K15R ifade eden HEK293T hücre nüksosomlardan arındırdık. RNF168 ifade K13/K15 önemli bir mayası yol açar. BAP1 DUB aktivitesi sadece H2A K13/K15R H2A K119ub (Şekil 2B) içeren nüklenden görülür. Diğer bir göz, enzimatik aktivite için kritik olabilecek Post-translasyonel değişikliklerin bakteriyel proteinlerde mevcut olmaması muhtemeldir. Böylece In vitro reaksiyonlar mammalin hücrelerinden arındırılmış bileşenleri kullanarak da35olarak kabul edilebilir. Örneğin, DEUBAD monoubiquitination, yüksek Ökaryotlar gözlenen bir süreç, büyük ölçüde BAP135 deubiquitinase etkinliğini teşvik (Şekil 2C). Böylece, memeli hücrelerinden bileşenlerin arıtılması da düşünülebilir. İn vitro reaksiyonlarına ek olarak, BAP1 DUB etkinliğini doğrudan transfeksiyon sonrasında hücrelerde izlemek mümkündür. Örneğin, H2A yapısı ile HEK293T hücrelerinin transfeksiyon hücrelerde bolluk nedeniyle H2A K119ub net bir sinyal verebilirsiniz. Bu koşullarda, mayası çoğu K118/K119 kalıntıları üzerinde olur, bu sitelerin mutasyon için Arginin yol H2A mayası (Şekil 2D) tam yokluğunda. H2A ile birlikte BAP1 ve ASXL2 ortak ifade etmek, hücrelerdeki BAP1 DUB aktivitesinin sonuçlandırılması için izin verir. Ancak, birkaç nokta aşırı ifade hatalı sonuçlara yol açabilir olarak düşünülebilir gerekir. Böylece, bu deneyler optimize edilmiş ve iyi kontrol edilmesi gerekir.

Özetle, burada açıklanan protokoller, Şekil 2E'de yeniden özetlenen, basit, özel bir altyapı veya deneysel kurulum gerektirmez ve birden fazla değişiklik için önemli miktarlarda değiştirilmiş nükreozomlar üretmek için ölçeklendirilebilir enzimatik analizlerin, kütle spektrometresi ve protein-protein etkileşimi dahil olmak üzere aşağı yukarı uygulamalar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları beyan.

Acknowledgments

Teknik yardım için Diana Adjaoud 'a teşekkür ederiz. Bu çalışma Doğal Bilimler ve Kanada Mühendislik Araştırma Konseyi (2015-2020), Genome Quebec (2016-2019) ve Genome Kanada (2016-2019) E.B.A. E.B.A. için hibe tarafından destekleniyordu Fonds de la recherche du Québec-Santé (FRQ-S) üst düzey bir bilim adamı. L. M ve N.S.K., FRQ-S ' d e k i Doktora Bursu. H. B Yüksek Eğitim Bakanlığı ve Tunus bilimsel araştırmalar ve Cole Vakfı 'ndan Doktora Bursu aldı.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amylose agarose beads New England Biolabs #E8021
Amicon Ultra 0.5 mL centrifugal filters 10K Sigma-Aldrich #UFC501096
Anti-H2AK119ub (H2Aub) Cell Signaling Technology #8240
Anti-Flag-agarose beads Sigma-Aldrich #A4596
Anti-protease cocktail Sigma-Aldrich #P8340
BL21 (DE3) CodonPlus-RIL bacteria Agilent technologies #230240
DMEM Wisent #319-005-CL
Empty chromatography column Biorad #731-1550
Flag peptide Sigma-Aldrich #F3290
GSH-agarose beads Sigma-Aldrich #G4510
HEK293T ATCC #CRL-3216
Imidazole Sigma-Aldrich #I5513
Micrococcal nuclease (MNase) Sigma-Aldrich #N3755
Ni-NTA agarose beads ThermoFisher Scientific #88221
N-methylmaleimide (NEM) Bioshop #ETM222
Pore syringe filter 0.45 μm Sarstedt #83.1826
Polyethylenimine (PEI) Polysciences Inc #23966-1
pGEX6p2rbs-GST-RING1B(1-159)-Bmi1(1-109) Addgene #63139
Ub Activating Enzyme (UBE1) Boston Biochem #E-305
UBCH5C (UBE2D3) Boston Biochem #E2-627

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ye, Y., Rape, M. Building ubiquitin chains: E2 enzymes at work. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 755-764 (2009).
  2. Komander, D., Clague, M. J., Urbe, S. Breaking the chains: structure and function of the deubiquitinases. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 550-563 (2009).
  3. Ciechanover, A. The unravelling of the ubiquitin system. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16, 322-324 (2015).
  4. Nakayama, K. I., Nakayama, K. Ubiquitin ligases: cell-cycle control and cancer. Nature Reviews Cancer. 6, 369-381 (2006).
  5. Senft, D., Qi, J., Ronai, Z. A. Ubiquitin ligases in oncogenic transformation and cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 18, 69-88 (2018).
  6. Zheng, N., Shabek, N. Ubiquitin Ligases: Structure, Function, and Regulation. Annual Review of Biochemistry. 86, 129-157 (2017).
  7. Iwai, K., Fujita, H., Sasaki, Y. Linear ubiquitin chains. NF-kappaB signalling, cell death and beyond. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15, 503-508 (2014).
  8. Kulathu, Y., Komander, D. Atypical ubiquitylation - the unexplored world of polyubiquitin beyond Lys48 and Lys63 linkages. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13, 508-523 (2012).
  9. Yau, R., Rape, M. The increasing complexity of the ubiquitin code. Nature Cell Biology. 18, 579-586 (2016).
  10. Mevissen, T. E. T., Komander, D. Mechanisms of Deubiquitinase Specificity and Regulation. Annual Review of Biochemistry. 86, 159-192 (2017).
  11. Bedford, L., Lowe, J., Dick, L. R., Mayer, R. J., Brownell, J. E. Ubiquitin-like protein conjugation and the ubiquitin-proteasome system as drug targets. Nature Reviews Drug Discovery. 10, 29-46 (2011).
  12. Minton, K. Inflammasomes: Ubiquitin lines up for inflammasome activity. Nature Reviews Immunology. 14, 580-581 (2014).
  13. Popovic, D., Vucic, D., Dikic, I. Ubiquitination in disease pathogenesis and treatment. Nature Medicine. 20, 1242-1253 (2014).
  14. Upadhyay, A., Amanullah, A., Chhangani, D., Mishra, R., Mishra, A. Selective multifaceted E3 ubiquitin ligases barricade extreme defense: Potential therapeutic targets for neurodegeneration and ageing. Ageing Research Reviews. 24, 138-159 (2015).
  15. Hammond-Martel, I., Yu, H., Affar el, B. Roles of ubiquitin signaling in transcription regulation. Cellular Signalling. 24, 410-421 (2012).
  16. Schwertman, P., Bekker-Jensen, S., Mailand, N. Regulation of DNA double-strand break repair by ubiquitin and ubiquitin-like modifiers. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17, 379-394 (2016).
  17. Uckelmann, M., Sixma, T. K. Histone ubiquitination in the DNA damage response. DNA Repair. 56, 92-101 (2017).
  18. Robzyk, K., Recht, J., Osley, M. A. Rad6-dependent ubiquitination of histone H2B in yeast. Science. 287, 501-504 (2000).
  19. Hwang, W. W., et al. A conserved RING finger protein required for histone H2B monoubiquitination and cell size control. Molecular Cell. 11, 261-266 (2003).
  20. Kim, J., Hake, S. B., Roeder, R. G. The human homolog of yeast BRE1 functions as a transcriptional coactivator through direct activator interactions. Molecular Cell. 20, 759-770 (2005).
  21. Wood, A., et al. an E3 ubiquitin ligase required for recruitment and substrate selection of Rad6 at a promoter. Molecular Cell. 11, 267-274 (2003).
  22. Wang, H., et al. Role of histone H2A ubiquitination in Polycomb silencing. Nature. 431, 873-878 (2004).
  23. Buchwald, G., et al. Structure and E3-ligase activity of the Ring-Ring complex of polycomb proteins Bmi1 and Ring1B. The EMBO Journal. 25, 2465-2474 (2006).
  24. Scheuermann, J. C., et al. Histone H2A deubiquitinase activity of the Polycomb repressive complex PR-DUB. Nature. 465, 243-247 (2010).
  25. Jensen, D. E., et al. BAP1: a novel ubiquitin hydrolase which binds to the BRCA1 RING finger and enhances BRCA1-mediated cell growth suppression. Oncogene. 16, 1097-1112 (1998).
  26. Harbour, J. W., et al. Frequent mutation of BAP1 in metastasizing uveal melanomas. Science. 330, 1410-1413 (2010).
  27. Abdel-Rahman, M. H., et al. GermLine BAP1 mutation predisposes to uveal melanoma, lung adenocarcinoma, meningioma, and other cancers. Journal of Medical Genetics. , (2011).
  28. Bott, M., et al. The nuclear deubiquitinase BAP1 is commonly inactivated by somatic mutations and 3p21.1 losses in malignant pleural mesothelioma. Nature Genetics. 43, 668-672 (2011).
  29. Goldstein, A. M. GermLine BAP1 mutations and tumor susceptibility. Nature Genetics. 43, 925-926 (2011).
  30. Testa, J. R., et al. GermLine BAP1 mutations predispose to malignant mesothelioma. Nature Genetics. 43, 1022-1025 (2011).
  31. Wiesner, T., et al. GermLine mutations in BAP1 predispose to melanocytic tumors. Nature Genetics. 43, 1018-1021 (2011).
  32. Dey, A., et al. Loss of the tumor suppressor BAP1 causes myeloid transformation. Science. 337, 1541-1546 (2012).
  33. Pena-Llopis, S., et al. BAP1 loss defines a new class of renal cell carcinoma. Nature Genetics. 44, 751-759 (2012).
  34. Bononi, A., et al. BAP1 regulates IP3R3-mediated Ca2+ flux to mitochondria suppressing cell transformation. Nature. 546, 549-553 (2017).
  35. Daou, S., et al. Monoubiquitination of ASXLs controls the deubiquitinase activity of the tumor suppressor BAP1. Nature Communications. 9, 4385 (2018).
  36. Daou, S., et al. The BAP1/ASXL2 Histone H2A Deubiquitinase Complex Regulates Cell Proliferation and Is Disrupted in Cancer. The Journal of Biological Chemistry. 290, 28643-28663 (2015).
  37. Mashtalir, N., et al. Autodeubiquitination protects the tumor suppressor BAP1 from cytoplasmic sequestration mediated by the atypical ubiquitin ligase UBE2O. Molecular Cell. 54, 392-406 (2014).
  38. Yu, H., et al. The ubiquitin carboxyl hydrolase BAP1 forms a ternary complex with YY1 and HCF-1 and is a critical regulator of gene expression. Molecular and Cellular Biology. 30, 5071-5085 (2010).
  39. Yu, H., et al. Tumor suppressor and deubiquitinase BAP1 promotes DNA double-strand break repair. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 285-290 (2014).
  40. Dai, F., et al. BAP1 inhibits the ER stress gene regulatory network and modulates metabolic stress response. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, 3192-3197 (2017).
  41. Zhang, Y., et al. BAP1 links metabolic regulation of ferroptosis to tumour suppression. Nature Cell Biology. 20, 1181-1192 (2018).
  42. Kolluri, K. K., et al. Loss of functional BAP1 augments sensitivity to TRAIL in cancer cells. eLife. 7, (2018).
  43. Machida, Y. J., Machida, Y., Vashisht, A. A., Wohlschlegel, J. A., Dutta, A. The deubiquitinating enzyme BAP1 regulates cell growth via interaction with HCF-1. The Journal of Biological Chemistry. , (2009).
  44. Sahtoe, D. D., van Dijk, W. J., Ekkebus, R., Ovaa, H., Sixma, T. K. BAP1/ASXL1 recruitment and activation for H2A deubiquitination. Nature Communications. 7, 10292 (2016).

Tags

Biyokimya sayı 149 ubiquitination deubiquitination E3 Ubiquitin ligaz PRC1 deubiquitinase PR-DUB kromatin BAP1 ASXL BMI1 RING1B H2A
Nükliosomal Histones in vitro Ubiquitination ve Deubiquitination bulguları
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Masclef, L., Maxime, U., Ahmed, O.,… More

Masclef, L., Maxime, U., Ahmed, O., Sen Nkwe, N., Barbour, H., Iannantuono, N. V. G., Boubekeur, A., Daou, S., Affar, E. B. In Vitro Ubiquitination and Deubiquitination Assays of Nucleosomal Histones. J. Vis. Exp. (149), e59385, doi:10.3791/59385 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter