Summary
Le profilage protéomique des protéines tyrosine-nitrated a été une technique provocante due à la basse abondance de la modification de 3-nitrotyrosine. Ici nous décrivons une approche nouvelle pour l'enrichissement et le profilage de nitropeptide en utilisant Angiotensin II comme modèle. Cette méthode peut être étendue à d'autres systèmes in vitro ou in vivo.
Abstract
La nitration protéique est l'une des modifications post-traductionnelles les plus importantes (PTM) sur les résidus de tyrosine et elle peut être induite par des actions chimiques d'espèces réactives d'oxygène (ROS) et d'espèces d'azote réactif (RNS) dans les cellules eucaryotes. L'identification précise des sites de nitration sur des protéines est cruciale pour comprendre les processus physiologiques et pathologiques liés à la nitration de protéine, tels que l'inflammation, le vieillissement, et le cancer. Étant donné que les protéines nitrates sont de faible abondance dans les cellules, même dans des conditions induites, aucune méthode universelle et efficace n'a été mise au point pour le profilage et l'identification des sites de nitration des protéines. Ici nous décrivons un protocole pour l'enrichissement de nitropeptide en utilisant une réaction chimique de réduction et l'étiquetage de biotine, suivi de la spectrométrie de masse de haute résolution. Dans notre méthode, les dérivés du nitropéeptide peuvent être identifiés avec une grande précision. Notre méthode présente deux avantages par rapport aux méthodes précédemment rapportées. Tout d'abord, l'étiquetage du diméthyle est utilisé pour bloquer l'amine primaire sur les nitropéeptides, qui peut être utilisé pour générer des résultats quantitatifs. Deuxièmement, une liaison de disulfure contenant nhs-biotine réactif est utilisé pour l'enrichissement, qui peut être encore réduit et alkylé pour améliorer le signal de détection sur un spectromètre de masse. Ce protocole a été appliqué avec succès au modèle peptide Angiotensin II dans le document actuel.
Introduction
La nitration des résidus de tyrosine dans les protéines pour former 3-nitrotyrosine régule de nombreux processus biologiques. En raison des différentes propriétés chimiques entre la tyrosine et la 3-nitrotyrosine, une protéine nitrated peut avoir perturbé l'activité de signalisation1,2. Par conséquent, il est important de développer des méthodes qui peuvent enrichir et identifier efficacement les sites de nitration sur les protéines. Comme la 3-nitrotyrosine est une modification de faible abondance sur les protéines par rapport à d'autres formes de PTM, comme la phosphorylation et l'acétylation, il est difficile d'identifier les sites de nitration endogènes directement à partir de lignées cellulaires ou d'échantillons de tissus. Néanmoins, la méthodologie d'utilisation de la spectrométrie de masse (MS) pour caractériser le modèle de fragmentation du nitrotpeptide a été développée (par exemple, Zhan et Desiderio3), qui jette les bases de nouvelles méthodes de nitroprotéomique.
Actuellement, une étape d'enrichissement suivie par la SP est la stratégie la plus puissante pour le profilage nitropeptide4,5. Les méthodes d'enrichissement peuvent être classées en deux classes. Une classe est basée sur des anticorps qui peuvent reconnaître 3-nitrotyrosine spécifiquement, tandis que l'autre classe est basée sur la dérivation chimique qui réduit un groupe nitro à un groupe d'amine4,5. Pour la méthode basée sur les anticorps, colonne d'affinité nitrotyrosine est utilisé pour l'enrichissement, à partir de laquelle le matériau éluesté est encore résolu et analysé par haute résolution MS6,7. Pour la méthode à base de dérivation chimique, les groupes d'amine au N-terminus du peptide ou de la lysine devraient être bloqués dans un premier temps soit par acétylation, balises isobares pour quantitation relative et absolue (iTRAQ), ou réagents de masse tandem (TMT). Ensuite, un réducteur est utilisé pour réduire la nitrotyrosine à l'aminotyrosine suivie par la modification du groupe amine nouvellement formé, qui comprend la ligature de la biotine, la conversion de peptide sulphydryl, ou d'autres types de systèmes de marquage8,9, 10,11. La plupart des protocoles établis jusqu'à présent sont basés sur des protéines in vitro sur-nitrated, au lieu de protéines endogènes nitrates.
Dans la présente étude, une procédure modifiée de la dérivation chimique de la nitrotyrosine est développée pour l'enrichissement et l'identification du nitropéptide, qui montre une sensibilité accrue pendant la détection de la SP et convient à la quantification. Notre étude récente utilisant cette méthode dans les systèmes biologiques a identifié que la nitration de la tyrosine kinase de protéine lymphocyte-spécifique (LCK) à Tyr394 par RNS produit à partir des cellules suppressrices myéloïdes dérivées (MDSCs) joue un rôle important dans le immunosuppression du microenvironnement de tumeur12. Par conséquent, notre méthode d'identification de nitropeptide peut être appliquée aux échantillons biologiques complexes aussi bien. Ici, nous décrivons notre protocole en utilisant le modèle peptide Angiotensin II, dont le modèle de fragmentation est connu et largement utilisé dans les études nitroprotéomiques8,9,10,11, à titre d'exemple.
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Protocol
1. Nitration de l'angiotensine II
- Pour générer un peptide nitrate, diluer 10 L de solution parente Angiotensin II (DRVYIHPF) (2 mM dans l'eau) dans une solution PBS de 390 L (10 mM NaH2PO4, 150 mM NaCl, pH 7,4) à la concentration finale de 50 M.
- Ajouter 10 L de peroxynitrite (200 mM en 4,7% NaOH) à la solution Angiotensin II pour rendre la concentration finale de peroxynitrite 5 mM.
REMARQUE: La peroxynitrite est instable et facile à résoudre lorsqu'elle est sous forme acide, de sorte que la solution parente de peroxynitrite est conservée dans la solution de base et stockée à -80 oC. - Ajuster la valeur de pH de la solution à 7-8 par 1 M HCl. Pour initier la réaction de nitration, secouez le tube à 400 tr/min pendant 5 min.
- Utilisez une colonne SPE de phase inversée disponible dans le commerce (voir Tableau des matériaux)pour le dessalement.
- Préparer 2 solutions pour le dessalement, 5% de méthanol dans l'eau pour le lavage et 80% de méthanol dans l'eau pour l'élution.
- Ajouter 500 L de méthanol, suivi de 500 L d'eau pour préconditionner la colonne, mettre 1 ml de pipettor avec la pointe sur le dessus de la colonne, appuyez sur le tuyauterie pour accélérer le flux.
- Chargez 410 L de l'échantillon à l'étape 1.3 sur la colonne, jetez le flux à travers.
- Après le lavage avec 500 l de méthanol de 5%, utilisez 300 l de méthanol de 80% pour échapper à l'nitropéptide, qui est ensuite entièrement séché par vitesse-vac dans le réglage par défaut à température ambiante.
REMARQUE : Le dessalement est très important pour les réactions, car le solvant laissé dans l'étape précédente peut avoir un effet négatif sur les prochaines étapes.
2. Alkylation des amines primaires par étiquetage du diméthyle
- Reconstituer la solution en poudre nitro-Angiotensin II en 100 L de 100 mM de bicarbonate de triéthylammonium (TEAB).
REMARQUE: La valeur de pH de la solution doit être comprise entre 7 et 9, et assurez-vous qu'aucune mine primaire n'est ajoutée dans la solution. - Ajouter 4 L de 4% de formaldéhyde à la solution, mélanger brièvement.
CAUTION : Les vapeurs de formaldéhyde sont toxiques; effectuer les expériences dans une hotte à fumée. - Ajouter 4 L de 0,6 M de NaBH3CN à la solution, secouer le tube à 400 tr/min pendant 1 h à température ambiante.
- Éteindre la réaction d'étiquetage en ajoutant 16 L de solution d'ammoniac de 1%, incuber à température ambiante pendant 5 min.
- Ajouter 8 L d'acide formique pour acidifier la solution et effectuer le dessalement à l'aide de la colonne SPE de phase inverse décrite à l'étape 1.4.
3. Réduction de la nitrotyrosine à l'aminotyrosine
- Reconstituer le diméthyle étiqueté nitro-Angiotensin II en 500 L de PBS (10 mM NaH2PO4, 150 mM NaCl, pH 7.4).
- Ajouter 10 L de 1 M de dithionate de sodium à la solution et incuber à température ambiante pendant 1 h. Après la réaction de réduction, la couleur jaune de la solution devient claire.
REMARQUE : Pesez 174,1 mg de dishionate de sodium et dissolvez-le dans l'eau pour que le volume final soit de 1 ml. Cette solution peut être stockée à -20 oC au plus d'une semaine. - Utilisez la colonne SPE de phase inverse pour le dessalement tel que décrit à l'étape 1.4.
4. Biotinylation, enrichissement et détection
- Reconstituer le diméthyle étiqueté amino Angiotensin II dans 500 L de PBS (10 mM NaH2PO4, 150 mM NaCl, pH 7.4).
- Ajouter 5 l de 40 nM NHS-S-Biotin, dissous dans DMSO, à la solution, après 2 h d'incubation à température ambiante, utiliser 1 L d'hydroxylamine de 5% pour étancher la réaction.
- Entre-temps, les perles d'agarose streptavidrate d'équilibre en ajoutant 500 l de PBS (10 mM NaH2PO4, 150 mMN, pH 7.4), centrifuging à 580 x g pendant 5 min à la température ambiante et jetant le supernatant. Effectuer l'équilibre 3 fois.
- Ajouter 100 perles d'agarose streptavidin ephleautine au système de réaction, incuber 1 h sur un shaker rotatif à température ambiante. Laver 4 fois avec PBS (10 mM NaH2PO4, 150 mM NaCl, pH 7.4). Pour chaque étape de lavage, ajouter 500 'L de PBS aux perles, bien mélanger, puis centrifugeuse à 580 x g pendant 5 min à température ambiante et jeter le supernatant.
- Utiliser 400 l de 10 mM de dithiothreitol (DTT) pour couver avec des perles d'agarose à 50 oC pendant 45 min, tourner à 580 x g pendant 5 min à température ambiante et jeter les perles, ajouter 20 l l d'idoacetamide de 0,5 M (IAM) au supernatant pour 20 min.
REMARQUE: La TNT est utilisée pour briser le lien de disulfure entre le lien de la biotine et du peptide, ce dernier est libéré des perles et encore alkylé par IAM. - Utilisez la colonne SPE de phase inverse pour le dessalement indiqué à l'étape 1.4.
- Après avoir résolu les peptides secs dans 20 L d'acide formique (FA), soumettre le produit de chaque section à la chromatographie liquide avec spectrométrie de masse en tandem (LC-MS/MS) analyse.
- Séparer les peptides modifiés d'Ang II par une élution de gradient de 60 min (0-8 min, 2% B; 8-10 min, 5% B; 10-35 min, 18% B; 35-50 min, 28% B; 50-52 min, 80% B; 52-58 min, 80% B; 58-59 min, 2% B; 59-60 min, 2% B) à un débit de 0,300 'l/min avec nano-HPLC) est directement interfère avec le spectromètre de masse haute résolution.
REMARQUE : La colonne analytique est en ID de 75 m, longueur de 150 mm, emballée avec de la résine C-18. La phase A mobile s'est composée de 0.1% d'acide formique, et la phase mobile B s'est composée de 100% d'acétonitrile et de 0.1% d'acide formique. - Exploiter le spectromètre de masse en mode d'acquisition dépendant des données, définir un spectre de masse à balayage complet (300-1800 m/z, 60 000 résolution) suivi de 20 balayages MS/MS dépendants des données à 28 % d'énergie de collision normalisée.
- Ouvrez les données des spectres de masse et identifiez les pics du produit à chaque étape pour confirmer que la réaction chimique a été effectuée avec succès.
- Séparer les peptides modifiés d'Ang II par une élution de gradient de 60 min (0-8 min, 2% B; 8-10 min, 5% B; 10-35 min, 18% B; 35-50 min, 28% B; 50-52 min, 80% B; 52-58 min, 80% B; 58-59 min, 2% B; 59-60 min, 2% B) à un débit de 0,300 'l/min avec nano-HPLC) est directement interfère avec le spectromètre de masse haute résolution.
5. Quantification du nitropéptide
- Préparer 3 ensembles de solutions nitro-Angiotensin II à partir de l'étape 1.4, chaque ensemble contenant 2 concentrations de nitro-Angiotensin II: Ensemble #1 , 20 nmol dans le tube A et 20 nmol dans le tube B, chacun dans 100 solution TEAB; Ensemble, #2 10 nmol dans le tube C et 20 nmol dans le tube D, chacun dans la solution TEAB de 100 l; #3 Ensemble, 40 nmol dans le tube E et 10 nmol dans le tube F, chacun dans la solution TEAB de 100 l.
Note: Les deux concentrations de nitro-Angiotensin ii dans chaque ensemble sont utilisées pour l'étiquetage du diméthyle, pour réagir avec le formaldéhyde (léger) et le formaldéhyde-D2 (lourd), respectivement. - Pour chaque ensemble, ajouter 4 L de 4 % de formaldéhyde et de formaldéhyde-D2 à l'échantillon pour être étiquetés comme légers et lourds, respectivement. Suivez les étapes 2.3 à 2.5 pour terminer l'étiquetage du diméthyle.
- Mélanger les échantillons étiquetés légers et lourds.
- Suivez les étapes de 3.1 à 4.6 pour la réduction, la biotinylation, l'enrichissement et la détection.
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Representative Results
Le diagramme de flux pour le profilage des nitropéptides dans ce manuscrit est montré dans la figure 1. Les chiffres 2, 3, 4 et 5 montrent les spectres de masse d'Angiotensin II, nitro-Angiotensin II, de diméthyle étiqueté nitro-Angiotensin II et de diméthyle étiqueté amino Angiotensin II, respectivement. Le poids moléculaire du composé peut être reflété par les valeurs m/z du pic mono-isotope dans chaque figure, indiquant que la modification chimique sur Angiotensin II a été réalisée avec succès pour chaque étape. La figure 6 montre le produit final à l'étape 4.7 détecté et caractérisé par LC-MS/MS. La figure 7 montre les résultats quantitatifs du nitropéeptide par étiquetage du diméthyle. Les quantités relatives de lumière et de poids ont été déterminées par la comparaison de l'intensité du pic mono-isotope dans chaque groupe, ce qui nous permet de quantifier les nitropéeptides enrichis de différents groupes.
Figure 1 . Le flux de travail de la méthode de dérivation chimique pour enrichir et détecter nitro- Angiotensin II. Tout d'abord, angiotensine II est nitratee par peroxynitrite, après le dessalement, l'étiquetage du diméthyle est utilisé pour bloquer l'amine primaire sur le peptide. Ensuite, le dithionate de sodium est utilisé pour réduire la nitrotyrosine à l'aminotyrosine, qui est également réagiavec NHS-S-S-biotine. Après enrichi par des perles de streptavidin, le peptide est coupé par TNT suivi de l'alkylation et détecté par LC-MS/MS. Ce chiffre a été modifié à partir de12, Figure 2. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 . Le spectre de masse de l'Angiotensine II. Ce chiffre a montré que le pic mono-isotope à m/z 523,78 correspondait au peptide chargé (en hausse) et au modèle de fragmentation ms/MS de l'Angiotensin II (en bas). Ce chiffre a été modifié à partir de12, Figure S2. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 . Le spectre de masse de nitro-Angiotensin II. Ce chiffre a montré que le pic mono-isotope à m/z 546.28 correspondait au peptide chargé de duple (vers le haut) et au modèle de fragmentation de MS/MS de nitro-Angiotensin II (en bas). Ce chiffre a été modifié à partir de12, Figure S2. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 . Le spectre de masse du diméthyle étiqueté nitro-Angiotensin II. Ce chiffre a montré que le pic mono-isotope à m/z 560.29 correspondait au peptide chargé de duple (vers le haut) et au modèle de fragmentation MS/MS du diméthyle étiqueté nitro-Angiotensin II (en bas). Ce chiffre a été modifié à partir de12, Figure S2. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5 . Le spectre de masse du diméthyle étiqueté amino Angiotensin II. Ce chiffre a montré que le pic mono-isotope à m/z 545.31 correspondait au peptide chargé de duple (vers le haut) et au modèle de fragmentation ms/MS du diméthyle étiqueté angiotensin II (en bas). Ce chiffre a été modifié à partir de12, Figure S2. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 6 . Le spectre de masse du produit final. Ce chiffre a montré que le pic mono-isotope à m/z 617,82 correspondait au peptide chargé (en hausse) et au modèle de fragmentation MS/MS du produit final (milieu) et au spectre de zoom de 400 à 1000 m/z présentait un modèle de fragmentation plus détaillé (en bas) . Ce chiffre a été modifié à partir de12, Figure S2. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 7 . Les spectres de masse des résultats de quantification des nitropéeptides par étiquetage de diméthyle. Les rapports légers/lourds sont respectivement de 1:1 (en hausse), 1:2 (milieu) et 4:1 (en bas). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Le protocole décrit ici l'enrichissement et le profilage des nitropéptides. En utilisant Angiotensin II comme peptide modèle, nous avons illustré la procédure montrée dans la figure 1. Après l'obtention de la nitro-Angiotensine II, l'amine primaire sur le peptide doit être bloquée pour éviter l'autre conjugaison de mine, qui est l'une des étapes les plus critiques dans le protocole. Dans le protocole actuel, l'étiquetage du diméthyle est utilisé pour bloquer les amines primaires pour deux raisons : premièrement, il permet l'acquisition de résultats quantitatifs; deuxièmement, le coût de cette réaction est inférieur à celui de la réaction basée sur le NHS et l'efficacité de blocage est élevée13. Pour la quantification, les ratios lumière/poids mesurés sonttrès proches des ratios attendus (figure 7), les erreurs sont calculées à moins de 10%.
Une autre étape critique du protocole est la réduction de la 3-nitrotyrosine sur le peptide étiqueté diméthyle à l'aminotyrosine par le dithionate de sodium, qui réagit rapidement et efficacement. Le groupe amine nouvellement généré est également étiqueté avec 4-5 plis d'excès de NHS-S-S-biotine. Moins ou plus NHS-S-S-biotine conduirait à la réaction incomplète d'étiquetage ou à l'enrichissement incomplet, respectivement. La TNT peut complètement briser le lien de disulfure et libérer le peptide enrichi des perles de streptavidin, qui sont alkylépares par IAM et analysées par LC-MS/MS.
Ce protocole est adapté pour identifier et quantifier les nitropéptides dans le système biochimique et les matériaux biologiques tels que les cellules ou les tissus. Puisque l'enrichissement en biotine et l'alkylation de l'IAM peuvent augmenter considérablement la sensibilité, les nitropéeptides peu abondants deviennent détectables par la SP. Par exemple, nous avons employé ce protocole pour profiler les nitropeptides endogènes des cellules T infiltrantes d'isolement des modèles de prostate murine et de carcinome de poumon12. Nous avons identifié nitro-Tyr294 de la protéine LCK et effectué des études fonctionnelles pour montrer que cette modification peut jouer un rôle critique dans le processus d'immunosuppression par les MDSC12.
L'application de notre technique est limitée par deux facteurs : premièrement, la faible abondance de nitropéeptides dans les cellules et les tissus dicte que peu de nitropéeptides peuvent être identifiés ; deuxièmement, la faible sensibilité inhérente à la détection de la SP par rapport aux méthodologies très sensibles telles que le séquençage génomique à cellule unique et le séquençage transcriptomique. Nous envisageons que l'application de ce protocole à d'autres conditions pathologiques aidera à définir plus de PTMs de nitration de protéine avec des fonctions précédemment non reconnues dans la progression de la maladie.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Ce travail a été appuyé par l'American Cancer Society Institutional Research Grant IRG-14-195-01 (M. Sharon Stack est chercheur principal; X.L. est un enquêteur sub-récipiendaire). Cette publication a été rendue possible grâce au soutien partiel de Grant Numbers KL2 TR002530 et UL1 TR002529 (A. Shekhar, PI) des National Institutes of Health, National Center for Advancing Translational Sciences, Clinical and Translational Sciences Award. X. L. est récipiendaire du prix Du jeune enquêteur CTSI de l'Indiana. S. F. est soutenu par les subventions de la Walther Cancer Foundation Advancing Basic Cancer. X. W. est soutenu par le National Natural Science Foundation of China General Program (Grant No. 817773047).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acclaim pepmap 100 C18 column | Thermo-Fisher | 164534 | |
| 1 M TEAB solution | Sigma-Aldrich | T7408 | |
| 50% hydroxylamine | Thermo-Fisher | 90115 | |
| Acetonitrile | Thermo-Fisher | A955 | MS Grade |
| dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43819 | |
| formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | Molecular Biology Grade |
| formaldehyde-D2 | Toronto Research Chemicals | F691353 | |
| formic acid | Sigma-Aldrich | 695076 | ACS reagent |
| Fusion Lumos mass spectrometer | Thermo | ||
| isoacetamide | Sigma-Aldrich | I1149 | |
| Methanol | Thermo-Fisher | A456 | MS Grade |
| NHS-S-S-bition | Thermo-Fisher | 21441 | |
| Oasis HLB column (10 mg) | Waters | 186000383 | |
| peroxynitrite | Merck-Millipore | 516620 | |
| sodium cyanoborohydrite | Sigma-Aldrich | 42077 | PhamaGrade |
| sodium dithionate | Sigma-Aldrich | 157953 | Technical Grade |
| Streptavidin Sepharose | GE Healcare | GE17-5113-01 | |
| Ultimate 3000 nanoLC | Thermo |
References
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