Summary
티로신 질산 단백질의 프로테오믹 프로파일링은 3-니트로티로신 변형의 낮은 풍부성으로 인해 도전적인 기술이었습니다. 여기에서 우리는 모델로 안지오텐신 II를 사용하여 니트로 펩티드 농축 및 프로파일링에 대한 새로운 접근 방식을 설명합니다. 이 방법은 다른 시험관 내 또는 생체 내 시스템에 대해 확장될 수 있다.
Abstract
단백질 질산은 티로신 잔기에서 가장 중요한 번역 후 수정 (PTM) 중 하나이며 진핵 세포에서 반응성 산소 종 (ROS) 및 반응성 질소 종 (RNS)의 화학적 행동에 의해 유도 될 수 있습니다. 단백질에 질산 부위의 정확한 식별은 염증, 노화 및 암과 같은 단백질 질산과 관련된 생리적 및 병리학적 과정을 이해하는 데 매우 중요합니다. 질화 된 단백질은 유도 된 조건하에서도 세포에서 풍부하지 않으므로 단백질 질산 부위의 프로파일링 및 식별을위한 보편적이고 효율적인 방법이 개발되지 않았습니다. 여기에서 우리는 화학 환원 반응 및 비오틴 라벨링을 사용하여 니트로펩티드 농축을 위한 프로토콜을 설명하고, 그 다음에 고분해능 질량 분광법을 기술합니다. 우리의 방법에서, 니트로 펩티드 유도체는 높은 정확도로 식별 될 수있다. 우리의 방법은 이전에 보고 된 방법에 비해 두 가지 장점을 나타낸다. 첫째, 디메틸 라벨링은 니트로펩타이드의 1차 아민을 차단하는 데 사용되며, 이는 정량적 결과를 생성하는 데 사용될 수 있다. 둘째, NHS-비오틴 시약을 함유하는 이황화 결합이 농축에 사용되며, 이는 질량 분석기상 검출 신호를 향상시키기 위해 더욱 감소되고 알킬화될 수 있다. 이 프로토콜은 현재 논문에서 펩티드 안지오텐신 II 모델에 성공적으로 적용되었다.
Introduction
단백질에 티로신 잔기의 질화 형성 3-니트로티로신 많은 생물학적 과정을 조절. 티로신과 3-니트로티로신 사이의 다른 화학적 특성으로 인해, 질산 단백질은 신호작용 활성 1,2를교란시킬 수 있다. 따라서 단백질에서 적화 부위를 효율적으로 풍부하게 하고 식별할 수 있는 방법을 개발하는 것이 중요합니다. 3-니트로티로신은 인산화 및 아세틸화와 같은 다른 형태의 PTM에 비해 단백질에 대한 풍부도가 낮기 때문에 세포주 또는 조직 샘플에서 직접 내인성 질산 부위를 식별하는 것은 어렵습니다. 그럼에도 불구하고, 니트로펩타이드의 단편화 패턴을 특성화하기 위해 질량 분석법(MS)을 사용하는 방법론(예: Zhan& Desiderio 3)이 개발되어 새로운 질소 변종 방법의 토대를 마련합니다.
현재, MS에 이어 농축 단계는 니트로 펩티드 프로파일링4,5에대한 가장 강력한 전략이다. 보강 방법은 두 클래스로 분류할 수 있습니다. 한 클래스는 3-니트로티로신을 구체적으로 인식할 수 있는 항체를 기반으로 하는 반면, 다른 클래스는 아민 군4,5로니트로기를 감소시키는 화학적 유도체에 기초한다. 항체 계법의 경우, 니트로티로신 친화열은 농축에 사용되며, 이로부터 용출된 물질이 고분해능 MS6,7에의해 더욱 해결되고 분석된다. 화학 적 유도 기반 방법의 경우, 펩티드 또는 리신의 N 말단에서 아민 그룹은 아세틸화, 상대 및 절대 정량에 대한 등화 태그 (iTRAQ) 또는 탠덤 질량 태그 (TMT) 시약에 의해 첫 번째 단계에서 차단되어야한다. 다음으로, 감속기는 바이오틴 결찰, 설피드릴 펩타이드 변환 또는 다른 유형의 태깅 시스템을 포함하는 새로 형성된 아민 그룹을 수정한 후 아미노티로신으로 니트로티로신을 감소시키기 위해 사용된다8,9, 10,11. 지금까지 확립된 대부분의 프로토콜은 내인성 질화 단백질 대신 체외 에서 과질화 된 단백질을 기반으로합니다.
본 연구에서, 니트로티로신의 화학적 유도의 변형된 절차는 니트로펩타이드 농축 및 식별을 위해 개발되었으며, 이는 MS 검출 동안 향상된 감도를 나타내고 정량화 목적으로 적합하다. 생물학적 시스템에서 이 방법을 채택한 당사의 최근 연구는 골수성 유래 억제세포(MDSCs)에서 생성된 RNS에 의한 Tyr394에서 림프구 특이적 단백질 티로신 키나아제(LCK)의 질질이 종양 미세환경의 면역억제(12). 따라서, 니트로펩티드 식별의 우리의 방법은 복잡한 생물학적 샘플에도 적용될 수 있습니다. 여기서, 우리는 단편화 패턴이 알려져 있고 니트로프로테오믹 연구에서 널리 사용되는 모델 펩티드 안지오텐신II를 사용하여 우리의 프로토콜을 설명한다 8,9,10,11,일례로.
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Protocol
1. 안지오텐신 II의 순화
- 질산 펩티드를 생성하기 위해, 390 μL PBS 용액(10 mM NaH2PO 4, 150 mM NaCl,pH 7.4)에서 안지오텐신 II(DRVYIHPF) 모액(물 속에서 2 mM)의 10 μL을 50 μM의 최종 농도에서 희석시켰다.
- 안지오텐신 II 용액에 10 μL의 페록시니트라이트(200 mM in 4.7% NaOH)를 첨가하여 5 mM의 최종 농도를 만듭니다.
참고 : 페록시니트라이트는 불안정하고 산성 형태일 때 쉽게 해결할 수 있으므로 퍼록시니트염의 모액은 기본 용액에 보관되어 -80 °C에 보관됩니다. - 용액의 pH 값을 7-8 로 1 M HCl로 조정합니다. 순화 반응을 시작하려면 튜브를 400 rpm에서 5 분 동안 흔들어줍니다.
- 탈염에 대해 시판되는 역상 SPE 열(재료 표참조)을 사용합니다.
- 탈염용 용액 2개, 세척을 위한 물에 5% 메탄올, 용출을 위한 물에 80% 메탄올을 준비합니다.
- 메탄올 500 μL을 추가한 다음 500 μL의 물을 추가하여 기둥을 사전 컨디셔닝하고, 기둥 상단에 팁이 있는 1mL 파이펫터를 넣고 파이프터를 눌러 흐름을 가속화합니다.
- 열에 1.3 단계에서 샘플의 410 μL을 로드하고, 흐름을 통해 폐기한다.
- 5% 메탄올 500 μL로 세척한 후, 80% 메탄올 300 μL을 사용하여 니트로펩타이드를 용출한 다음 실온에서 기본 설정에서 스피드 백신으로 완전히 건조합니다.
참고: 이전 단계에 남아 있는 용매는 다음 단계에 부정적인 영향을 미칠 수 있기 때문에 탈염은 반응에 매우 중요합니다.
2. 디메틸 라벨에 의한 1 차 아민의 알킬화
- 100 μL의 100 μL에서 분말 니트로-안지오텐신 II를 재구성하여 중탄산염(TEAB) 용액을.
참고: 용액의 pH 값은 7에서 9 사이여야 하며 용액에 1차 아민이 추가되지 않았는지 확인합니다. - 용액에 4 μL의 포름알데히드를 넣고 잠시 섞습니다.
주의: 포름알데히드 증기는 독성; 연기 후드에서 실험을 수행합니다. - 용액에 0.6 M NaBH3CN의 4 μL을 추가하고 실온에서 1 시간 동안 400 rpm에서 튜브를 흔들어줍니다.
- 1% 암모니아 용액의 16 μL을 추가하여 라벨링 반응을 담금질하고, 실온에서 5 분 동안 배양합니다.
- 8 μL의 포믹산을 첨가하여 용액을 산성화하고 1.4단계에서 설명한 바와 같이 역상 SPE 컬럼을 사용하여 탈염을 수행합니다.
3. 아미노티로신에 니트로티로신의 감소
- PBS의 500 μL에서 디메틸 표지 된 니트로-안지오텐신 II를 재구성한다(10 mM NaH2PO4,150 mM NaCl, pH 7.4).
- 용액에 10 μL의 1M 디티오네이트 나트륨을 넣고 실온에서 1 시간 동안 배양하십시오. 환원 반응 후 용액의 노란색이 분명해집니다.
참고 : 174.1 mg의 나트륨 디티오네이트의 무게를 측정하고 물에 용해하여 최종 부피가 1 mL입니다. 이 용액은 -20°C에서 1주일 이상 보관할 수 있다. - 1.4단계에서 설명한 바와 같이 탈염에 대해 역단계 SPE 컬럼을 사용한다.
4. 생물 항제, 농축 및 검출
- PBS의 500 μL에서 디메틸 표지된 아미노 안지오텐신 II를 재구성한다(10 mM NaH2PO4,150 mM NaCl, pH 7.4).
- DMSO에 용해된 40 nM NHS-S-S-비오틴 5 μL을 실온에서 2시간 배양한 후 5% 하이드록실라민 1 μL을 사용하여 반응을 담급금질합니다.
- 한편, PBS 500 μL(10 mM NaH2PO4,150 mM NaCl, pH 7.4)을 첨가하여, 실온에서 580 x g에서 원심분리를 580 x g으로 첨가하고 상층을 폐기함으로써 평형스트렙타비딘 아가로즈 비드를 평형화한다. 평형을 3회 수행합니다.
- 반응 시스템에 100 μL 스트렙타비딘 아가로즈 비드를 넣고 실온에서 회전 셰이커에 1h를 배양합니다. PBS (10 mM NaH2PO 4, 150 mM NaCl, pH 7.4)로 4 회 씻으하십시오. 각 세척 단계에 대해, 구슬에 PBS 500 μL을 넣고 잘 섞은 다음 실온에서 5 분 동안 580 x g에서 원심 분리기를 넣고 상한을 버립니다.
- 400 μL의 10 mM dithiothreitol (DTT)를 사용하여 50 °C에서 아가로즈 비드로 배양하고, 실온에서 5 분 동안 580 x g에서 스핀 다운하고 구슬을 버리고, 20 μL의 0.5 M idoacetamide (IAM)를 20 분 동안 초급제에 추가하십시오.
참고 : DTT는 비오틴과 펩티드의 링크 사이의 이황화 결합을 끊는 데 사용되며, 후자는 구슬로부터 방출되고 IAM에 의해 더 알킬화됩니다. - 1.4단계에 표시된 탈염에 대해 역위상 SPE 열을 사용합니다.
- 0.1% 포름산(FA)의 20 μL에서 건조 펩티드를 분해한 후, 탠덤 질량 분석법(LC-MS/MS) 분석을 통해 각 섹션의 생성물들을 액체 크로마토그래피에 적용하였다.
- 변형된 Ang II 펩타이드를 60분 그라데이션 용출(0-8분, 2% B; 8-10 분, 5% B; 10-35 분, 18% B; 35-50 분, 28% B; 50-52 분, 80% B; 52-58 분, 80% B; 58%B; 58-59 분, 2% B, 2% B) 유량 0.300 μplc/h. 고분해능 질량 분석기와 직접 인터페이스됩니다.
참고: 분석 컬럼은 75 μm ID, 길이 150mm, C-18 수지로 포장되어 있습니다. 이선A는 0.1% 포산으로 구성되었으며, 이발상 B는 100% 아세토니트릴과 0.1% 포르믹산으로 구성되었다. - 데이터 종속 수집 모드에서 질량 분석기 작동, 단일 전체 스캔 질량 스펙트럼(300-1800 m/z, 60 000 해상도)을 설정한 다음 28%의 정규화된 충돌 에너지에서 20개의 데이터 종속 MS/MS 스캔을 설정합니다.
- 질량 스펙트럼 데이터를 열고 각 단계에서 제품의 피크를 식별하여 화학 반응이 성공적으로 수행되었는지 확인합니다.
- 변형된 Ang II 펩타이드를 60분 그라데이션 용출(0-8분, 2% B; 8-10 분, 5% B; 10-35 분, 18% B; 35-50 분, 28% B; 50-52 분, 80% B; 52-58 분, 80% B; 58%B; 58-59 분, 2% B, 2% B) 유량 0.300 μplc/h. 고분해능 질량 분석기와 직접 인터페이스됩니다.
5. 니트로 펩티드의 정량화
- 단계 1.4에서 니트로-안지오텐신 II 용액의 3 세트를 준비, 각 세트는 니트로 -안지오텐신 II의 2 농도를 포함: 세트 #1, 튜브 A에 20 nmol 및 튜브 B에 20 nmol, 각각 100 μl TEAB 용액; #2, 튜브 C에 10 nmol, 튜브 D에 20 nmol을 설정하고, 각각 100 μl TEAB 용액에; #3, 튜브 E에 40 nmol, 튜브 F에 각각 100 μl TEAB 용액에 10 nmol을 설정합니다.
참고 : 각 세트에서 니트로 - 안지오 텐신 II의 두 농도는 각각 포름알데히드 (빛) 및 포름 알데히드 -D2 (무거운)와 반응, 디메틸 라벨링에 사용됩니다. - 각 세트에 대해 4% 포름알데히드와 포름알데히드-D2의 4 μL을 각각 가볍고 무거운 것으로 표시할 샘플에 추가합니다. 2.3 단계에서 2.5 단계 따라 디메틸 라벨링을 완료하십시오.
- 가볍고 무거운 라벨이 붙은 샘플을 섞습니다.
- 감소, 생물 항, 농축 및 검출을 위해 3.1에서 4.6까지의 단계를 따르십시오.
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Representative Results
이 원고의 니트로펩타이드 프로파일링에 대한 순서도는 그림1에 나와 있습니다. 도2, 도3, 4 및 5는 안지오텐신 II, 니트로-안지오텐신 II, 디메틸 표지된 니트로-안지오텐신 II 및 디메틸 표지된 아미노 안지오텐신 II의 질량 스펙트럼을 각각 보여준다. 화합물의 분자량은 각 도면에서 모노 동위원소 피크의 m/z 값에 의해 반사될 수 있으며, 이는 안지오텐신 II에 대한 화학적 변형이 각 단계에 대해 성공적으로 달성되었음을 나타낸다. 도 6은 LC-MS/MS를 검출하고 특징짓는 4.7단계에서 최종 생성물인 디메틸 라벨링에 의한 니트로펩티드의 정량적 결과를 나타낸다. 빛과 무거운의 상대적인 양은 우리가 다른 그룹에서 농축 된 니트로 펩티드를 정량화 할 수 있도록 각 그룹에서 모노 동위 원소 피크의 강도의 비교에 의해 결정되었다.
그림 1 . 니트로-안지오텐신 II를 농축 및 검출하기 위한 화학적 유도 방법의 워크플로우. 첫째, 안지오텐신 II는 페록시니트라이트에 의해 질화되고, 탈염 후, 디메틸 라벨링은 펩티드상에서 1차 아민을 차단하는데 사용된다. 그런 다음 나트륨 디티오네이트는 아미노티로신에 니트로티로신을 줄이기 위해 사용된다, 이는 더 NHS-S-S-비오틴과 반응. 스트렙타비딘 비드에 의해 농축 된 후, 펩티드는 DTT에 의해 절단된 후 알킬화에 의해 절단되고 LC-MS/MS에 의해 검출된다. 이 그림은12, 그림2에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 . 안지오텐신 II의 질량 스펙트럼. 이 수치는 m/z 523.78에서의 모노동위원소 피크가 안지오텐신 II(아래)의 이중 전하 펩티드(up) 및 MS/MS 단편화 패턴과 일치한다는 것을 보여주었다. 이 그림은12, 그림 S2에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 . 니트로 - 안지오 텐신 II의 질량 스펙트럼. 이 수치는 m/z 546.28에서의 모노동위원소 피크가 이중 전하 펩티드(up) 및 니트로-안지오텐신 II(아래)의 MS/MS 단편화 패턴과 일치한다는 것을 보여주었다. 이 그림은12, 그림 S2에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 . 디메틸의 질량 스펙트럼은 니트로-안지오텐신 II에 라벨을 붙였다. 이 수치는 m/z 560.29에서의 모노동위원소 피크가 이중 전하 펩티드(up) 및 디메틸 표지된 니트로-안지오텐신 II(아래)의 MS/MS 단편화 패턴과 일치한다는 것을 보여주었다. 이 그림은12, 그림 S2에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5 . 아미노 안지오텐신 II에 라벨이 부착된 디메틸의 질량 스펙트럼. 이 수치는 m/z 545.31에서의 모노동위원소 피크가 이중 전하 펩티드(up) 및 디메틸 표지된 아미노 안지오텐신 II(아래)의 MS/MS 단편화 패턴과 일치한다는 것을 보여주었다. 이 그림은12, 그림 S2에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6 . 최종 제품의 질량 스펙트럼입니다. 이 수치는 m/z 617.82의 모노 동위원소 피크가 최종 생성물(중간)의 이중 충전 펩타이드(up) 및 MS/MS 단편화 패턴과 400~1000m/z의 줌인 스펙트럼과 일치하여 보다 상세한 단편화 패턴(아래)을 나타냈다는 것을 보여주었습니다. . 이 그림은12, 그림 S2에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7 . 디메틸 라벨링에 의한 니트로펩티드의 정량화 결과의 질량 스펙트럼. 라이트 대 무거운 비율은 각각 1:1(위), 1:2(중간) 및 4:1(아래)입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
여기서 프로토콜은 니트로펩티드 농축 및 프로파일링을 설명합니다. 안지오텐신 II를 모델 펩타이드로 사용하여 그림 1에표시된 절차를 설명했습니다. 니트로-안지오텐신 II를 얻은 후, 펩티드의 1차 아민은 프로토콜 내에서 가장 중요한 단계 중 하나인 추가적인 아민 컨쥬게이션을 피하기 위해 차단되어야 한다. 현재 프로토콜에서, 디메틸 라벨링은 두 가지 이유로 1차 아민을 차단하는 데 사용된다: 첫째, 정량적 결과의 획득을 가능하게 한다; 둘째, 이러한 반응에 대한 비용은 NHS 기반 반응보다 낮고 차단 효율은13이높다. 정량화의 경우, 측정된 광대 무거운 비율은 예상 비율에매우 가깝고(도 7), 오차는 10% 미만으로 계산된다.
프로토콜의 또 다른 중요 한 단계는 디메틸 표지 된 펩 티 드에 3-니트로 티로신의 감소 나트륨 디티오나이에 의해, 빠르고 효율적으로 반응. 새로 생성된 아민 그룹은 NHS-S-S-비오틴을 초과하는 4-5배로 더 표지된다. NHS-S-S-비오틴은 각각 불완전한 라벨링 반응 또는 불완전한 농축으로 이어질 것입니다. DTT는 이황화물 결합을 완전히 분해하고 IAM에 의해 알킬화되고 LC-MS/MS에 의해 분석되는 스트렙타비딘 구슬에서 농축된 펩티드를 방출할 수 있습니다.
이 프로토콜은 생화학 적 시스템 및 세포 또는 조직과 같은 생물학적 물질 모두에서 니트로 펩티드를 식별하고 정량화하는 데 적합합니다. 비오틴 농축 및 IAM 알킬화는 감도를 크게 향상시킬 수 있기 때문에, 낮은 풍부한 니트로펩타이드는 MS에 의해 검출될 수 있게 된다. 예를 들어, 우리는 뮤린 전립선 및 폐 암종 모델(12)으로부터 분리된 침투 T 세포의 내인성니트로펩타이드를 프로파일하기 위해 이 프로토콜을 사용하였다. 우리는 단백질 LCK의 니트로-Tyr294를 확인하고 이러한 변형이 MDSCs12에의한 면역 억제 과정에서 중요한 역할을 할 수 있음을 보여주기 위해 기능적 연구를 수행했다.
우리의 기술의 응용프로그램은 두 가지 요인에 의해 제한됩니다 : 첫째, 세포와 조직에서 니트로 펩티드의 낮은 풍부는 몇 니트로 펩티드가 식별 될 수 있음을 지시; 둘째, 단일 세포 게놈 및 전사체 염기서열 분석과 같은 고과감도 방법론과 비교하여 MS의 내재된 낮은 검출 감도. 우리는 이 프로토콜을 다른 병리학 적 조건에 적용하면 질병 진행에서 이전에 인식되지 않은 기능을 가진 더 많은 단백질 질화 PTM을 정의하는 데 도움이 될 것이라고 생각합니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
이 작품은 미국 암 학회 기관 연구 보조금 IRG-14-195-01에 의해 지원되었다 (M. 샤론 스택은 주요 조사자입니다; X.L.은 하위 수급자입니다). 이 간행물은 그랜트 번호 KL2 TR002530 및 UL1 TR002529 (A. Shekhar, PI)의 국립 보건원, 국립 번역 과학 발전 센터, 임상 및 번역 과학 상에서 부분적인 지원으로 가능하게 되었습니다. X. L. 인디애나 CTSI KL2 젊은 구도자 상 수상자입니다. S. F.는 월터 암 재단이 기본 암 보조금을 진행하는 것을 지원하고 있습니다. X. W. 중국 일반 프로그램의 국립 자연 과학 재단에 의해 지원 됩니다 (그랜트 번호 817773047).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acclaim pepmap 100 C18 column | Thermo-Fisher | 164534 | |
| 1 M TEAB solution | Sigma-Aldrich | T7408 | |
| 50% hydroxylamine | Thermo-Fisher | 90115 | |
| Acetonitrile | Thermo-Fisher | A955 | MS Grade |
| dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43819 | |
| formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | Molecular Biology Grade |
| formaldehyde-D2 | Toronto Research Chemicals | F691353 | |
| formic acid | Sigma-Aldrich | 695076 | ACS reagent |
| Fusion Lumos mass spectrometer | Thermo | ||
| isoacetamide | Sigma-Aldrich | I1149 | |
| Methanol | Thermo-Fisher | A456 | MS Grade |
| NHS-S-S-bition | Thermo-Fisher | 21441 | |
| Oasis HLB column (10 mg) | Waters | 186000383 | |
| peroxynitrite | Merck-Millipore | 516620 | |
| sodium cyanoborohydrite | Sigma-Aldrich | 42077 | PhamaGrade |
| sodium dithionate | Sigma-Aldrich | 157953 | Technical Grade |
| Streptavidin Sepharose | GE Healcare | GE17-5113-01 | |
| Ultimate 3000 nanoLC | Thermo |
References
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