Summary
O perfilamento Proteomic de proteínas tyrosine-nitrated foi uma técnica desafiante devido à baixa abundância da modificação da 3-nitrotyrosine. Aqui nós descrevemos uma aproximação nova para o enriquecimento e o perfilamento do nitropeptide usando a angiotensina II como o modelo. Este método pode ser estendido para outros sistemas in vitro ou in vivo .
Abstract
A nitração proteica é uma das mais importantes modificações pós-translacionais (PTM) sobre os resíduos de tirosina e pode ser induzida por ações químicas de espécies reativas de oxigênio (ROS) e espécies reativas de nitrogênio (RNS) em células eucarióticas. A identificação precisa dos sítios de nitorização nas proteínas é crucial para a compreensão dos processos fisiológicos e patológicos relacionados à nitração proteica, como inflamação, envelhecimento e câncer. Desde que as proteínas sulfonados são da baixa abundância nas pilhas mesmo circunstâncias induzidas, nenhuns métodos universais e eficientes foram desenvolvidos para o perfilamento e a identificação de locais da nitração da proteína. Aqui nós descrevemos um protocolo para o enriquecimento do nitropeptide usando uma reação da redução química e a rotulagem da biotina, seguidas pela espectrometria maciça de alta resolução. Em nosso método, os derivados de nitropeptídeos podem ser identificados com alta precisão. Nosso método exibe duas vantagens em comparação com os métodos relatados anteriormente. Primeiro, a rotulagem de dimetil é usada para bloquear a amina primária em nitropeptídeos, que podem ser usados para gerar resultados quantitativos. Em segundo, uma ligação do dissulfeto que contem o reagente de NHS-biotina é usada para o enriquecimento, que pode mais ser reduzido e alquilados para realçar o sinal da deteção em um espectrómetro maciço. Este protocolo foi aplicado com sucesso ao peptide modelo angiotensina II no papel atual.
Introduction
A nitração de resíduos de tirosina em proteínas para formar 3-nitrotirosina regula muitos processos biológicos. Devido às diferentes propriedades químicas entre tirosina e 3-nitrotirosina, uma proteína nitrada pode ter perturbado a atividade de sinalização1,2. Conseqüentemente, é importante desenvolver os métodos que podem enriquecer e identificar locais da nitração em proteínas eficientemente. Como 3-nitrotirosina é uma modificação de baixa abundância em proteínas em comparação com outras formas de PTM, como fosforilação e acetilação, é desafiador para identificar locais de nitração endógena diretamente de linhas celulares ou amostras de tecido. No entanto, a metodologia de uso de espectrometria de massas (MS) para caracterizar o padrão de fragmentação do nitrotpeptídeo foi desenvolvida (por exemplo, Zhan & Desiderio3), que estabelece a base para novos métodos de nitroproteômica.
Atualmente, uma etapa de enriquecimento seguida por MS é a estratégia mais poderosa para o perfilamento de nitropeptídeos4,5. Os métodos de enriquecimento podem ser classificados em duas classes. Uma classe é baseada em anticorpos que podem reconhecer a 3-nitrotirosina especificamente, enquanto que a outra classe é baseada na derivação química que reduz um grupo nitro para um grupo de amina4,5. Para o método baseado em anticorpos, a coluna de afinidade com nitrotirosina é utilizada para o enriquecimento, a partir do qual o material eluído é ainda mais resolvido e analisado por MS6,7de alta resolução. Para o método baseado na derivação química, os grupos de amina no N-Terminus do peptídeo ou lisina devem ser bloqueados no primeiro passo, quer por acetilação, Tags isobáricas para a quantificação relativa e absoluta (iTRAQ), ou tag de massa em tandem (TMT) reagentes. Em seguida, um redutor é usado para reduzir a nitrotirosina à aminotirosina seguida modificando o grupo recentemente formado da amina, que inclui a ligadura da biotina, a conversão do peptide do sulfidrilo, ou outros tipos de sistemas de etiquetagem8,9, 10,11. A maioria dos protocolos estabelecidos até agora baseiam-se em proteínas em excesso nitradas in vitro , em vez de proteínas endogenamente nitradas.
No presente estudo, um procedimento modificado da derivação química da nitrotirosina é desenvolvido para o enriquecimento e identificação do nitropeptídeo, o que mostra maior sensibilidade durante a detecção de SM e é adequado para fins de quantificação. Nosso estudo recente que emprega este método nos sistemas biológicos identificou que o nitração da proteína tirosina-quinase lymphocyte-específica (lck) em Tyr394 por RNS produziu das pilhas Myeloid-derivadas do supressor (mdscs) joga um papel importante no imunossupressão do microambiente do tumor12. Conseqüentemente, nosso método da identificação do nitropeptide pode ser aplicado às amostras biológicas complexas também. Aqui, nós descrevemos nosso protocolo usando o peptide modelo angiotensina II, de que o teste padrão da fragmentação é sabido e amplamente utilizado em estudos nitroproteomic8,9,10,11, como um exemplo.
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Protocol
1. nitorização da angiotensina II
- Para gerar peptídeo nitrado, diluir 10 μL de solução-mãe de angiotensina II (DRVYIHPF) (2 mM em água) em 390 μL de solução de PBS (10 mM NaH2po4, 150 mm nacl, pH 7,4) na concentração final de 50 μm.
- Adicionar 10 μL de peroxinitrito (200 mM em 4,7% NaOH) à solução de angiotensina II para fazer a concentração final de peroxinitrito 5 mM.
Nota: o peroxinitrito é instável e fácil de resolver quando está na forma ácida, assim que a solução do pai do peroxinitrito é mantida na solução básica e armazenada em-80 ° c. - Ajuste o valor de pH da solução para 7-8 por 1 M HCl. Para iniciar a reação de nitração, agitar o tubo em 400 rpm por 5 min.
- Use uma coluna SPE de fase reversa disponível comercialmente (consulte a tabela de materiais) para a dessalinagem.
- Prepare 2 soluções para a dessalinagem, 5% metanol em água para a lavagem e 80% metanol em água para a eluição.
- Adicione 500 μL de metanol, seguido de 500 μL de água para pré-condicionar a coluna, coloque 1 pipetador ml com a ponta na parte superior da coluna, pressione o pipetador para acelerar o fluxo.
- Carregue 410 μL da amostra na etapa 1,3 na coluna, descarte o fluxo.
- Após a lavagem com 500 μL de metanol a 5%, use 300 μL de 80% de metanol para Eluir o nitropeptídeo, que é então totalmente seco por velocidade-VAC na configuração padrão à temperatura ambiente.
Nota: a Dessalinagem é muito importante para as reacções, uma vez que o solvente deixado na etapa anterior pode ter um efeito negativo nas próximas etapas.
2. alquilação de aminas primárias por dimetil rotulagem
- Reconstituir a Nitro-angiotensina II em pó em 100 μL de solução de bicarbonato de trietilamónio de 100 mM (TEAB).
Nota: o valor de pH da solução deve estar entre 7 e 9, e certifique-se de que nenhuma amina primária é adicionada na solução. - Adicione 4 μL de formaldeído a 4% à solução, misture brevemente.
PRECAUÇÃO: os vapores de formaldeído são tóxicos; realizar os experimentos em uma capa de fumaça. - Adicionar 4 μL de 0,6 M NaBH3CN à solução, agitar o tubo a 400 rpm durante 1 h à temperatura ambiente.
- Saciar a reacção de rotulagem adicionando 16 μL de solução de amônia a 1%, incubar à temperatura ambiente durante 5 min.
- Adicione 8 μL de ácido fórmico para acidificar a solução e realize a dessalinagem utilizando a coluna SPE de fase inversa, conforme descrito na etapa 1,4.
3. redução da nitrotirosina para aminotirosina
- Reconstituir o dimetil rotulado Nitro-angiotensina II em 500 μL de PBS (10 mM NaH2po4, 150 mm nacl, pH 7,4).
- Adicionar 10 μL de 1 M de dithionate de sódio à solução e incubar à temperatura ambiente durante 1 h. Após a reação de redução, a cor amarela da solução torna-se clara.
Nota: pesar 174,1 mg de dithionate de sódio e dissolvê-lo em água para fazer o volume final é de 1 mL. Esta solução pode ser armazenada a-20 ° c não mais do que uma semana. - Use a coluna SPE de fase inversa para a dessalinagem, conforme descrito na etapa 1,4.
4. biotinilação, enriquecimento, e detecção
- Reconstituir o dimetil rotulado amino angiotensina II em 500 μL de PBS (10 mM NaH2po4, 150 mm nacl, pH 7,4).
- Adicionar 5 μL de 40 nM NHS-S-S-biotina, dissolvidos em DMSO, à solução, após 2 h de incubação à temperatura ambiente, utilizar 1 μL de hidroxilamina a 5% para saciar a reacção.
- Entretanto, equilibram grânulos do Agarose do estreptavidina adicionando 500 μL de PBS (10 milímetros NaH2po4, 150 milímetro nacl, pH 7,4), centrifugando em 580 x g por 5 minutos na temperatura ambiente e descartando o sobrenadante. Realize a equilibração 3 vezes.
- Adicionar 100 μL de grânulos de agarose de estreptavidina ao sistema de reacção, incubar 1 h num agitador rotativo à temperatura ambiente. Lave 4 vezes com PBS (10 mM NaH2po4, 150 mm nacl, pH 7,4). Para cada etapa de lavagem, adicionar 500 μL de PBS para os grânulos, misture bem, em seguida, centrifugar a 580 x g por 5 min à temperatura ambiente e descartar o sobrenadante.
- Use 400 μL de ditiotreitol de 10 mm (DTT) para incubar com grânulos de agarose a 50 ° c por 45 min, gire para baixo em 580 x g por 5 min à temperatura ambiente e descarte os grânulos, acrescente 20 μL de 0,5 M de idoacetamida (iam) ao sobrenadante por 20 min na escuridão.
Nota: o DTT é usado para quebrar a ligação do dissulfeto entre o link da biotina e do peptide, o último é liberado dos grânulos e alquilados mais por iam. - Use a coluna SPE de fase inversa para a dessalinagem mostrada na etapa 1,4.
- Após a resolução dos peptídeos secos em 20 μL de 0,1% de ácido fórmico (FA), sujeitar o produto de cada seção à cromatografia líquida com análise de espectrometria de massas em tandem (LC-MS/MS).
- Separe os peptídeos modificados de Ang II por uma eluição de gradiente de 60 min (0-8 min, 2% B; 8-10 min, 5% B; 10-35 min, 18% B; 35-50 min, 28% B; 50-52 min, 80% B; 52-58 min, 80% B; 58-59 min, 2% B; 59-60 min, 2% B) a um caudal de 0,300 μl/min com sistema de nano-HPLC que é diretamente interface com o espectrómetro maciço de alta resolução.
Nota: a coluna analítica está em 75 μm de identificação, 150 mm de comprimento, embalado com resina C-18. A fase móvel A consistiu em 0,1% de ácido fórmico, e A fase móvel B consistiu em 100% de acetonitrila e 0,1% de ácido fórmico. - Opere o espectrómetro de massa no modo de aquisição dependente de dados, defina um único espectro de massa de varredura completa (300-1800 m/z, resolução de 60 000) seguido por 20 verificações MS/MS dependentes de dados a 28% de energia de colisão normalizada.
- Abra os dados de espectros de massa e identifique os picos do produto em cada etapa para confirmar que a reação química foi realizada com sucesso.
- Separe os peptídeos modificados de Ang II por uma eluição de gradiente de 60 min (0-8 min, 2% B; 8-10 min, 5% B; 10-35 min, 18% B; 35-50 min, 28% B; 50-52 min, 80% B; 52-58 min, 80% B; 58-59 min, 2% B; 59-60 min, 2% B) a um caudal de 0,300 μl/min com sistema de nano-HPLC que é diretamente interface com o espectrómetro maciço de alta resolução.
5. quantificação do nitropeptídeo
- Prepare 3 conjuntos de soluções Nitro-angiotensina II da etapa 1,4, cada conjunto contendo 2 concentrações de nitro-angiotensina II: conjunto #1, 20 nmol no tubo A e 20 nmol no tubo B, cada um em 100 μl de solução de TEAB; Definir #2, 10 nmol no tubo C e 20 nmol no tubo D, cada um em 100 μl de solução de TEAB; Definir #3, 40 nmol no tubo e e 10 nmol no tubo F, cada um em 100 μl de solução de TEAB.
Nota: as duas concentrações de nitro-angiotensina II em cada conjunto são usadas para a rotulagem de dimetil, para reagir com formaldeído (luz) e formaldeído-D2 (pesado), respectivamente. - Para cada conjunto, adicione 4 μL de formaldeído a 4% e formaldeído-D2 à amostra a ser rotulada como leve e pesada, respectivamente. Siga as etapas 2,3 a 2,5 para terminar a rotulagem do dimetil.
- Misture as amostras leves e pesadas rotuladas.
- Siga as etapas de 3,1 a 4,6 para a redução, a biotinilação, o enriquecimento, e a deteção.
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Representative Results
O fluxograma para o perfilamento de nitropeptídeos neste manuscrito é mostrado na Figura 1. A Figura 2, 3, 4 e 5 mostram os espectros de massa da angiotensina II, Nitro-angiotensina II, dimetil rotulado Nitro-angiotensina II e dimetil rotulado amino angiotensina II, respectivamente. O peso molecular do composto pode ser refletido pelos valores de m/z do pico do mono-isótopo em cada figura, indicando que a modificação química na angiotensina II foi conseguida com sucesso para cada etapa. A Figura 6 mostra o produto final na etapa 4,7 detectada e caracterizada por LC-MS/MS. a Figura 7 mostra os resultados quantitativos do nitropeptídeo pela rotulagem de dimetil. As quantidades relativas de luz e pesados foram determinadas pela comparação da intensidade do pico mono-isótopo em cada grupo, o que nos permite quantificar os nitropeptídeos enriquecidos de diferentes grupos.
Figura 1 . O fluxo de trabalho do método de derivação química para enriquecer e detectar Nitro-angiotensina II. Primeiro, a angiotensina II é nitrada por peroxinitrito, após a dessalinagem, a rotulagem de dimetil é usada para bloquear a amina primária no peptídeo. Então o dithionate do sódio é usado para reduzir o nitrotyrosine ao aminotyrosine, que é reagido mais com o NHS-S-S-biotina. Após enriquecido por grânulos de estreptavidina, o peptídeo é cortado por DTT seguido de alquilação e detectado por LC-MS/MS. Este valor foi modificado a partir de12, Figura 2. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 . O espectro maciço de angiotensina II. Este número mostrou que o pico do mono-isótopo em m/z 523,78 combinou o peptide carregado do duple (acima) e o teste padrão da fragmentação de MS/MS de angiotensina II (parte inferior). Este valor foi modificado de12, Figura S2. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 . O espectro maciço de nitro-angiotensina II. Esse valor mostrou que o pico de mono-isótopos em m/z 546,28 correspondeu ao peptídeo carregado de duple (up) e ao padrão de fragmentação MS/MS da nitro-angiotensina II (fundo). Este valor foi modificado de12, Figura S2. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 . O espectro de massa de dimetil rotulado Nitro-angiotensina II. Esta figura mostrou que o pico do mono-isótopo em m/z 560,29 combinou o duple carregou o peptide (acima) e o teste padrão da fragmentação de MS/MS de dimetil etiquetou Nitro-angiotensina II (parte inferior). Este valor foi modificado de12, Figura S2. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5 . O espectro de massa de dimetil rotulado amino angiotensina II. Esta figura mostrou que o pico do mono-isótopo em m/z 545,31 combinou o duple carregou o peptide (acima) e o teste padrão da fragmentação de MS/MS do amino da angiotensina II do dimetil etiquetado (parte inferior). Este valor foi modificado de12, Figura S2. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6 . O espectro de massa do produto final. Este valor mostrou que o pico de mono-isótopos em m/z 617,82 correspondeu ao peptídeo carregado de duple (para cima) e o padrão de fragmentação MS/MS do produto final (médio) e o espectro de zoom de 400 para 1000 m/z exibiu um padrão de fragmentação mais Detalhado (inferior) . Este valor foi modificado de12, Figura S2. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7 . Os espectros de massa dos resultados de quantificação dos nitropeptídeos por dimetil rotulagem. A luz às relações pesadas é 1:1 (acima), 1:2 (meio) e 4:1 (parte inferior), respectivamente. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O protocolo aqui descreve o enriquecimento e o perfilamento do nitropeptídeo. Utilizando-se a angiotensina II como peptídeo modelo, ilustramos o procedimento mostrado na Figura 1. Após a obtenção da nitro-angiotensina II, a amina primária no peptídeo deve ser bloqueada para evitar a conjugação de amina, que é uma das etapas mais críticas dentro do protocolo. No protocolo atual, a rotulagem de dimetil é usada para bloquear as aminas primárias por dois motivos: primeiro, possibilita a aquisição de resultados quantitativos; segundo, o custo para esta reação é menor do que a reação baseada em NHS e a eficiência de bloqueio é alta13. Para a quantificação, as razões de luz medida a pesadas estão muito próximas das proporções esperadas (Figura 7), os erros são calculados menos de 10%.
Outra etapa crítica do protocolo é a redução da 3-nitrotirosina no peptídeo dimetil rotulado para aminotirosina por ditionato de sódio, que reage de forma rápida e eficiente. O grupo de amina recém-gerada é mais rotulado com 4-5 dobras em excesso de NHS-S-S-biotina. Menos ou mais NHS-S-S-biotina levaria a reação de rotulagem incompleta ou enriquecimento incompleto, respectivamente. O DTT pode quebrar totalmente a ligação de dissulfeto e liberar o peptídeo enriquecido de grânulos de estreptavidina, que são alquilados pelo IAM e analisados por LC-MS/MS.
Este protocolo é adequado para identificar e quantificar nitropeptídeos em ambos os sistemas bioquímicos e materiais biológicos, como células ou tecidos. Como o enriquecimento de biotina e a alquilação do IAM podem aumentar significativamente a sensibilidade, os nitropeptídeos de baixa abundância tornam-se detectáveis pela SM. Por exemplo, utilizou-se este protocolo para o perfil de nitropeptídeos endógenos de células T infiltrantes isoladas dos modelos de carcinoma de próstata e pulmão murino12. Nós identificamos Nitro-Tyr294 da proteína LCK e executamos estudos funcionais para mostrar que esta modificação pode jogar um papel crítico no processo de imunossupressão por mdscs12.
A aplicação da nossa técnica é limitada por dois fatores: em primeiro lugar, a baixa abundância de nitropeptídeos em células e tecidos dita que poucos nitropeptídeos podem ser identificados; em segundo, a sensibilidade baixa inerente da deteção do MS comparou com as metodologias altamente sensíveis tais como o sequenciamento genomic e transcriptômica da única pilha. Nós imaginamos que a aplicação deste protocolo a outras circunstâncias patológicas ajudará a definir mais PTMs da nitretação da proteína com funções previamente não reconhecidas na progressão da doença.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pela American Cancer Society institucional Research Grant IRG-14-195-01 (M. Sharon Stack é investigador principal; X.L. é um investigador subdestinatário). Esta publicação foi possível com apoio parcial de Grant Numbers KL2 TR002530 e UL1 TR002529 (A. Shekhar, PI) dos institutos nacionais de saúde, centro nacional para o avanço das Ciências translacionais, prêmio de ciências clínicas e translacionais. X. L. é um receptor de Indiana CTSI KL2 Young Investigator Award. S. F. é apoiado pela Walther Cancer Foundation avançando subsídios de câncer básico. X. W. é apoiado pela Fundação Nacional de ciências naturais da China programa geral (Grant no. 817773047).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acclaim pepmap 100 C18 column | Thermo-Fisher | 164534 | |
| 1 M TEAB solution | Sigma-Aldrich | T7408 | |
| 50% hydroxylamine | Thermo-Fisher | 90115 | |
| Acetonitrile | Thermo-Fisher | A955 | MS Grade |
| dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43819 | |
| formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | Molecular Biology Grade |
| formaldehyde-D2 | Toronto Research Chemicals | F691353 | |
| formic acid | Sigma-Aldrich | 695076 | ACS reagent |
| Fusion Lumos mass spectrometer | Thermo | ||
| isoacetamide | Sigma-Aldrich | I1149 | |
| Methanol | Thermo-Fisher | A456 | MS Grade |
| NHS-S-S-bition | Thermo-Fisher | 21441 | |
| Oasis HLB column (10 mg) | Waters | 186000383 | |
| peroxynitrite | Merck-Millipore | 516620 | |
| sodium cyanoborohydrite | Sigma-Aldrich | 42077 | PhamaGrade |
| sodium dithionate | Sigma-Aldrich | 157953 | Technical Grade |
| Streptavidin Sepharose | GE Healcare | GE17-5113-01 | |
| Ultimate 3000 nanoLC | Thermo |
References
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