Summary
La profilazione proteomica delle proteine tirosine-nitrirate è stata una tecnica impegnativa a causa della bassa abbondanza della modifica 3-nitrotyrosine. Qui descriviamo un nuovo approccio per l'arricchimento e la profilazione dei nitropeptidi usando Angiotensin II come modello. Questo metodo può essere esteso per altri sistemi in vitro o in vivo.
Abstract
La nizione proteica è una delle più importanti modifiche post-traduzionali (PTM) sui residui di tirosina e può essere indotta da azioni chimiche di specie reattive dell'ossigeno (ROS) e specie reattive di azoto (RNS) nelle cellule eucariotiche. L'identificazione precisa dei siti di nitrazione sulle proteine è fondamentale per comprendere i processi fisiologici e patologici correlati alla nitrazione delle proteine, come infiammazione, invecchiamento e cancro. Poiché le proteine netorate sono di scarsa abbondanza nelle cellule anche in condizioni indotte, non sono stati sviluppati metodi universali ed efficienti per la profilazione e l'identificazione di siti di nitrazione proteica. Qui descriviamo un protocollo per l'arricchimento dei nitropeptidi utilizzando una reazione di riduzione chimica e l'etichettatura della biotina, seguita da spettrometria di massa ad alta risoluzione. Nel nostro metodo, i derivati nitropeptici possono essere identificati con alta precisione. Il nostro metodo presenta due vantaggi rispetto ai metodi precedentemente riportati. In primo luogo, l'etichettatura dimetila viene utilizzata per bloccare l'ammina primaria sui nitropeptidi, che può essere utilizzata per generare risultati quantitativi. In secondo luogo, per l'arricchimento viene utilizzato un'obbligazione disulfida contenente reagente NHS-biotina, che può essere ulteriormente ridotta e alchilata per migliorare il segnale di rilevamento su uno spettrometro di massa. Questo protocollo è stato applicato con successo al modello peptide Angiotensin II nel documento attuale.
Introduction
Nileggia dei residui di tirosina nelle proteine per formare 3-nitrotyrosine regola molti processi biologici. A causa delle diverse proprietà chimiche tra tirosina e 3-nitrotyrosine, una proteina nitrata può aver perturbato l'attività di segnalazione1,2. Pertanto, è importante sviluppare metodi in grado di arricchire e identificare i siti di nitrazione sulle proteine in modo efficiente. Poiché 3-nitrotyrosine è una modifica a bassa abbondanza sulle proteine rispetto ad altre forme di PTM, come la fosforolalazione e l'acetilazione, è difficile identificare siti di nitrazione endogeni direttamente da linee cellulari o campioni di tessuto. Tuttavia, è stata sviluppata la metodologia dell'utilizzo della spettrometria di massa (MS) per caratterizzare il modello di frammentazione del nitrotpeptide (ad esempio, ,han & Desiderio3), che getta le basi per nuovi metodi di nitroproteomica.
Attualmente, un passo di arricchimento seguito da MS è la strategia più potente per la profilazione nitropeptide4,5. I metodi di arricchimento possono essere classificati in due classi. Una classe si basa su anticorpi in grado di riconoscere 3-nitrotyrosine in modo specifico, mentre l'altra classe si basa sulla derivazione chimica che riduce un gruppo nitro a un gruppo di ammine4,5. Per il metodo basato sugli anticorpi, la colonna di affinità nitrotyrosine viene utilizzata per l'arricchimento, da cui il materiale eluito viene ulteriormente risolto e analizzato dall'alta risoluzione MS6,7. Per il metodo basato sulla derivazione chimica, i gruppi di ammine al n-terminus del peptide o della lisina devono essere bloccati nel primo passaggio da acetilazione, tag isobarici per quantitazione relativa e assoluta (iTRAQ), o tag di massa tandem (TMT) reagenti. Successivamente, viene utilizzato un riduttore per ridurre la nitrotilsina all'aminotirosofina seguita dalla modifica del gruppo di ammine appena formato, che include la legatura di biotina, la conversione di peptide sulfittra o altri tipi di sistemi di etichettatura8,9, 10,11. La maggior parte dei protocolli stabiliti finora si basano su proteine in vitro sovranitate, invece di proteine endogenamente nitonate.
Nel presente studio, una procedura modificata della derivazione chimica della nitrotyrosine è sviluppata per l'arricchimento e l'identificazione del nitropeptide, che mostra una maggiore sensibilità durante il rilevamento della SM ed è adatto allo scopo di quantificazione. Il nostro recente studio sull'utilizzo di questo metodo nei sistemi biologici ha identificato che la nizione della crosina di tirosina (LCK) specifica del linfocito (LCK) al Tyr394 da RNS prodotta da cellule soppressori derivate da mieloidi (MDSC) svolge un ruolo importante immunosoppressione del microambiente tumorale12. Pertanto, il nostro metodo di identificazione nitropeptide può essere applicato anche a campioni biologici complessi. Qui, descriviamo il nostro protocollo utilizzando il modello peptide Angiotensin II, di cui il modello di frammentazione è noto e ampiamente utilizzato negli studi nitroproteomici8,9,10,11, come esempio.
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Protocol
1. Nirazione di Angiotensina II
- Per generare un peptide nito, diluire 10 - L di AngiotensinI (DRVYIHPF) soluzione madre (2 mM in acqua) in 390 soluzione PBS l (10 mM NaH2PO4, 150 mM NaCl, pH 7,4) alla concentrazione finale di 50 M.
- Aggiungere 10 l di peroxynitrite (200 mM in 4,7% NaOH) alla soluzione Angiotensin II per rendere la concentrazione finale di perossintetazione 5 mM.
NOTA: La peroxynitrite è instabile e facile da risolvere quando è in forma acida, quindi la soluzione madre di peroxynitrite viene mantenuta in soluzione di base e conservata in -80 gradi centigradi. - Regolare il valore di pH della soluzione a 7-8 da 1 M HCl. Per avviare la reazione di nitrazione, scuotere il tubo a 400 rpm per 5 min.
- Utilizzare una colonna SPE in fase inversa disponibile in commercio (vedere Tabella dei materiali) per il dissalamento.
- Preparare 2 soluzioni per il dealare, il 5% di metanolo in acqua per il lavaggio e l'80% di metanolo in acqua per l'elusione.
- Aggiungere 500 l di metanolo, seguito da 500 l' di acqua per pre-condizionare la colonna, mettere 1 pipettor mL con la punta sulla parte superiore della colonna, premere il pipettor per accelerare il flusso.
- Caricare 410 l del campione nel passaggio 1.3 sulla colonna, eliminare il flusso attraverso.
- Dopo il lavaggio con 500 luna del 5% di metanolo, utilizzare 300 luna di 80% di metanolo per eluire il nitropeptide, che viene poi completamente essiccato da velocità-vac nell'impostazione di default a temperatura ambiente.
NOTA: Il dealanding è molto importante per le reazioni, poiché il solvente lasciato nel passaggio precedente può avere un effetto negativo sui passi successivi.
2. Alchilazione delle ammine primarie per etichettatura dimetila
- Ricostituire la soluzione in polvere di nitro-angiotensini II in una soluzione di bicarbonato di trietilenio (TEAB) in polvere.
NOTA: il valore di pH della soluzione deve essere compreso tra 7 e 9 e assicurarsi che non venga aggiunta alcuna ammina primaria nella soluzione. - Aggiungere alla soluzione 4 -L del 4% di formaldeide, mescolare brevemente.
AVVISO: i vapori di formaldeide sono tossici; eseguire gli esperimenti in una cappa di fumi. - Aggiungere alla soluzione 4 ,ll di 0,6 M NaBH3CN, scuotere il tubo a 400 giri/m per 1 h a temperatura ambiente.
- Spegnire la reazione di etichettatura aggiungendo 16 -L di 1% soluzione di ammoniaca, incubare a temperatura ambiente per 5 min.
- Aggiungere 8 OL di acido formico per acidificare la soluzione ed eseguire il dissalamento utilizzando la colonna SPE in fase inversa, come descritto al punto 1.4.
3. Riduzione della nitrotyrosina alla aminotirosina
- Ricostituire il dimetilo etichettato nitro-Angiotensin II in 500 -L di PBS (10 mM NaH2PO4, 150 mM NaCl, pH 7.4).
- Aggiungere alla soluzione 10 -L L di 1 M di dithionate e incubare a temperatura ambiente per 1 ora. Dopo la reazione di riduzione, il colore giallo della soluzione diventa chiaro.
NOTA: Pesare 174,1 mg di dithionate e scioglierlo in acqua per rendere il volume finale è 1 mL. Questa soluzione può essere conservata a -20 gradi centigradi non più di una settimana. - Utilizzare la colonna SPE in fase inversa per il dealanding come descritto nel passaggio 1.4.
4. Biotinylazione, arricchimento e rilevamento
- Ricostituire l'ammiteniglia dimetila imbalsamata II in 500 -L di PBS (10 mM NaH2PO4, 150 mM NaCl, pH 7.4).
- Aggiungere alla soluzione 5 - LL di 40 nM NHS-S-S-biotin, disciolto nel DMSO, alla soluzione, dopo 2 h di incubazione a temperatura ambiente, utilizzare 1 L del 5% di idrossilamina per placare la reazione.
- Nel frattempo, equilibrate streptavidin agarose beleaggiungendo aggiungendo 500 lll di PBS (10 mM NaH2PO4, 150 mM NaCl, pH 7.4), centrifugando a 580 x g per 5 min a temperatura ambiente e scartando il supernatante. Eseguire l'equilibrato 3 volte.
- Aggiungere 100 streptavidin agarose al sistema di reazione, incubare 1 h su uno shaker rotativo a temperatura ambiente. Lavare 4 volte con PBS (10 mM NaH2PO4, 150 mM NaCl, pH 7.4). Per ogni passo di lavaggio, aggiungere 500 lofdi di PBS alle perline, mescolare bene, quindi centrifugare a 580 x g per 5 min a temperatura ambiente e scartare il supernatante.
- Utilizzare 400 luna di 10 mM dithiothreitol (DTT) per incubare con perline di agarose a 50 s per 45 min, girare verso il basso a 580 x g per 5 min a temperatura ambiente e le perline, aggiungere 20 scartate di 0,5 M idoacetamide (IAM) al supernatante per 20 min.
NOTA: DTT viene utilizzato per rompere il legame disulfide tra il legame tra biotina e peptide, quest'ultimo viene rilasciato da perline e ulteriormente alchilato da IAM. - Utilizzare la colonna SPE in fase inversa per il dissalamento mostrato nel passaggio 1.4.
- Dopo aver risolto i peptidi secchi in un'ondata di acido formica dello 0,1% dello 0,1% (FA), sottoporre il prodotto di ciascuna sezione alla cromatografia liquida con analisi di spettrometria di massa tandem (LC-MS/MS).
- Separare i peptidi Ang II modificati con un'eluizione di gradiente di 60 min (0-8 min, 2% B; 8-10 min, 5% B; 10-35 min, 18% B; 35-50 min, 28% B; 50-52 min, 80% B; 52-58 min, 80% B; 58-59 min, 2% B; 59-60 min, 2% B) ad una velocità di flusso 0,300 è direttamente interfacciato con lo spettrometro di massa ad alta risoluzione.
NOTA: La colonna analitica è in 75 ID, 150 mm di lunghezza, imballata con resina C-18. La fase mobile A consisteva dello 0,1% dell'acido formica e la fase mobile B era costituita da acetonitrile 100% e 0,1% di acido formica. - Azionare lo spettrometro di massa in modalità di acquisizione dipendente dai dati, impostare un singolo spettro di massa full-scan (300-1800 m/z, 60 000 risoluzione) seguito da 20 scansioni MS/MS dipendenti dai dati al 28% di energia di collisione normalizzata.
- Aprire i dati degli spettri di massa e identificare i picchi del prodotto in ogni fase per confermare che la reazione chimica è stata eseguita con successo.
- Separare i peptidi Ang II modificati con un'eluizione di gradiente di 60 min (0-8 min, 2% B; 8-10 min, 5% B; 10-35 min, 18% B; 35-50 min, 28% B; 50-52 min, 80% B; 52-58 min, 80% B; 58-59 min, 2% B; 59-60 min, 2% B) ad una velocità di flusso 0,300 è direttamente interfacciato con lo spettrometro di massa ad alta risoluzione.
5. Quantificazione del nitropeptide
- Preparare 3 serie di soluzioni nitro-Angiotensin II dal passaggio 1.4, ciascuna delle quali contiene 2 concentrazioni di nitro-angiotensina II: impostare #1, 20 nmol nel tubo A e 20 nmol nel tubo B, ognuna in soluzione TEAB da 100 gradi; Impostare #2, 10 nmol nel tubo C e 20 nmol nel tubo D, ciascuno in 100 soluzione TEAB; Impostare #3, 40 nmol nel tubo E e 10 nmol nel tubo F, ciascuno in una soluzione TEAB da 100.
Nota: Le due concentrazioni di nitro-angiotensina II in ogni set sono utilizzate per l'etichettatura dimetila, per reagire rispettivamente con formaldeide (luce) e formaldeide-D2 (pesante). - Per ogni set, aggiungere 4 - L del 4% formaldeide e formaldeide-D2 al campione da etichettare rispettivamente come leggero e pesante. Seguire i passaggi da 2.3 a 2.5 per completare l'etichettatura dimetil.
- Mescolare i campioni etichettati leggeri e pesanti.
- Seguire i passaggi da 3.1 a 4.6 per la riduzione, la biotinylazione, l'arricchimento e il rilevamento.
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Representative Results
Il diagramma di flusso per la profilazione nitropeptide in questo manoscritto è illustrato nella Figura 1. Le figure 2, 3, 4 e 5 mostrano gli spettri di massa di Angiotensin II, nitro-Angiotensin II, rispettivamente di dimetilo con etichetta nitro-angiotensin II e amino angiotensin II con l'etichetta digiosina dimetila II. Il peso molecolare del composto può essere riflesso dai valori m/z del picco mono-isotopico in ogni figura, indicando che la modifica chimica su Angiotensina II è stata raggiunta con successo per ogni fase. La figura 6 mostra il prodotto finale nel passaggio 4.7 rilevato e caratterizzato da LC-MS/MS. La figura 7 mostra i risultati quantitativi del nitropeptide dall'etichettatura dimetila. Le quantità relative di luce e pesante sono state determinate dal confronto dell'intensità del picco mono-isotopico in ogni gruppo, che ci permette di quantificare i nitropeptidi arricchiti provenienti da gruppi diversi.
Figura 1 . Flusso di lavoro del metodo di derivazione chimica per l'arricchimento e la rilevazione di nitro- AngiotensinI. In primo luogo, L'angiotensina II è nitrata da perosinistite, dopo la dealanding, l'etichettatura dimetilica viene utilizzata per bloccare l'ammina primaria sul peptide. Quindi il ditionato di sodio viene utilizzato per ridurre la nitrotilo alla aminoosmimina, che viene ulteriormente reagita con NHS-S-S-biotina. Dopo arricchito da perline di streptavidin, il peptide viene tagliato da DTT seguito da alchilazione e rilevato da LC-MS/MS. Questa cifra è stata modificata a partire da12, Figura 2. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 . Lo spettro di massa di Angiotensina II. Questa cifra ha mostrato che il picco mono-isotopo a m/z 523.78 corrispondeva al peptide caricato in tuple (su) e al modello di frammentazione MS/MS di Angiotensin II (in basso). Questa cifra è stata modificata da12, Figura S2. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 . Lo spettro di massa di nitro-angiotensina II. Questa cifra ha mostrato che il picco mono-isotopo a m/z 546.28 corrispondeva al peptide caricato duple (su) e al modello di frammentazione MS/MS di nitro-Angiotensin II (in basso). Questa cifra è stata modificata da12, Figura S2. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 . Lo spettro di massa del dimetile etichettato nitro-angiotensinI. Questa cifra ha mostrato che il picco mono-isotopo a m/z 560.29 corrispondeva al peptide caricato in tuple (up) e al modello di frammentazione MS/MS del dimetilio etichettato nitro-Angiotensin II (in basso). Questa cifra è stata modificata da12, Figura S2. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5 . Lo spettro di massa di dimetilo etichettato amino angiotensinI. Questa cifra ha mostrato che il picco mono-isotopo a m/z 545.31 corrispondeva al peptide caricato in tuple (up) e al modello di frammentazione MS/MS dell'amminoantensina dimetila etichettato II (in basso). Questa cifra è stata modificata da12, Figura S2. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6 . Lo spettro di massa del prodotto finale. Questa cifra ha mostrato che il picco mono-isotopico a m/z 617.82 corrispondeva al peptide caricato duple (su) e al modello di frammentazione MS/MS del prodotto finale (medio) e allo spettro dello zoom da 400 a 1000 m/z hanno mostrato un modello di frammentazione più dettagliato (in basso) . Questa cifra è stata modificata da12, Figura S2. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7 . Gli spettri di massa dei risultati di quantificazione dei nitropeptidi mediante etichettatura dimetila. I rapporti da luce a pesanti sono rispettivamente 1:1 (in alto), 1:2 (al centro) e 4:1 (in basso). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il protocollo qui descrive l'arricchimento e la profilazione del nitropeptide. Utilizzando Angiotensin II come peptide modello, abbiamo illustrato la procedura illustrata nella Figura 1. Dopo aver ottenuto il nitro-angiotensina II, l'ammina primaria sul peptide dovrebbe essere bloccata per evitare l'ulteriore coniugazione dell'ammina, che è uno dei passi più critici all'interno del protocollo. Nell'attuale protocollo, l'etichettatura dimetila viene utilizzata per bloccare le aree primarie per due motivi: in primo luogo, consente l'acquisizione di risultati quantitativi; in secondo luogo, il costo per questa reazione è inferiore alla reazione basata su NHS e l'efficienza di blocco è alta13. Per la quantificazione, i rapporti tra luce misurata e pesanti sono molto vicini ai rapporti attesi (Figura 7), gli errori vengono calcolati inferiori al 10%.
Un'altra fase critica del protocollo è la riduzione della 3-nitrotyrosine sul peptide con etichettato dimetile alla aminotirosina dal dithionato di sodio, che reagisce rapidamente ed efficacemente. Il gruppo di ammine appena generato è ulteriormente etichettato con 4-5 pieghe in eccesso di NHS-S-S-biotin. Meno o più NHS-S-S-biotin porterebbero rispettivamente a una reazione di etichettatura incompleta o ad un arricchimento incompleto. DTT può rompere completamente il legame disulfide e rilasciare il peptide arricchito da perline di streptavidina, che sono alchilate da IAM e analizzate da LC-MS/MS.
Questo protocollo è adatto per identificare e quantificare i nitropeptidi sia nel sistema biochimico che nei materiali biologici come le cellule o i tessuti. Poiché l'arricchimento della biotina e l'alchilazione IAM possono migliorare significativamente la sensibilità, i nitropeptidi poco abbondanti diventano rilevabili dalla SM. Ad esempio, abbiamo usato questo protocollo per profilare nitropeptidi endogeni di cellule T infiltranti isolate dalla prostata murina e dai modelli di carcinoma polmonare12. Abbiamo identificato il nitro-Tyr294 della proteina LCK ed eseguito studi funzionali per dimostrare che questa modifica può svolgere un ruolo fondamentale nel processo di immunosoppressione da parte di MDSCs12.
L'applicazione della nostra tecnica è limitata da due fattori: in primo luogo, la bassa abbondanza di nitropeptidi nelle cellule e nei tessuti impone che pochi nitropeptidi possano essere identificati; in secondo luogo, la bassa sensibilità intrinseca al rilevamento della SM rispetto alle metodologie altamente sensibili come la genomica a cella singola e il sequenziamento trascrittomico. Immettiamo che l'applicazione di questo protocollo ad altre condizioni patologiche aiuterà a definire più PTMs di nitrola delle proteine con funzioni precedentemente non riconosciute nella progressione della malattia.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dalla American Cancer Society Institutional Research Grant IRG-14-195-01 (M. Sharon Stack è Principal Investigator; X.L. è un investigatore subrecipient). Questa pubblicazione è stata resa possibile con il supporto parziale di Grant Numbers KL2 TR002530 e UL1 TR002529 (A. Shekhar, PI) del National Institutes of Health, National Center for Advancing Translational Sciences, Clinical and Translational Sciences Award. X. L. ha ricevuto il CTSI KL2 Young Investigator Award. S. F. è sostenuto dalle sovvenzioni per il cancro di base della Walther Cancer Foundation. X. W. è supportato dal National Natural Science Foundation of China General Program (Grant N. 817773047).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acclaim pepmap 100 C18 column | Thermo-Fisher | 164534 | |
| 1 M TEAB solution | Sigma-Aldrich | T7408 | |
| 50% hydroxylamine | Thermo-Fisher | 90115 | |
| Acetonitrile | Thermo-Fisher | A955 | MS Grade |
| dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43819 | |
| formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | Molecular Biology Grade |
| formaldehyde-D2 | Toronto Research Chemicals | F691353 | |
| formic acid | Sigma-Aldrich | 695076 | ACS reagent |
| Fusion Lumos mass spectrometer | Thermo | ||
| isoacetamide | Sigma-Aldrich | I1149 | |
| Methanol | Thermo-Fisher | A456 | MS Grade |
| NHS-S-S-bition | Thermo-Fisher | 21441 | |
| Oasis HLB column (10 mg) | Waters | 186000383 | |
| peroxynitrite | Merck-Millipore | 516620 | |
| sodium cyanoborohydrite | Sigma-Aldrich | 42077 | PhamaGrade |
| sodium dithionate | Sigma-Aldrich | 157953 | Technical Grade |
| Streptavidin Sepharose | GE Healcare | GE17-5113-01 | |
| Ultimate 3000 nanoLC | Thermo |
References
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