Summary
Нежная сенсорная погрузочная машина построена из человеческих щетк для волос, роботизированных рук и контроллера. Волосы щетки управляются роботизированные руки, установленные на машине и периодически двигаться применять сенсорную силу на растениях. Сила машинных прикосновений волос сравнима с мощи прикосновений, применяемых вручную.
Abstract
Растения реагируют как на внутриклеточные, так и на внеклеточные механические стимуляции (или сигналы силы) и развивают специальные морфологические изменения, называемые тигмоорфогенезом. В последние десятилетия было выявлено и зарегистрировано несколько сигнальных компонентов, причастных к механотрансдукции (например, ионные белки и кальцийи и ферменты биосинтеза жасмоновой кислоты). Тем не менее, относительно медленные темпы исследований в изучении силы сигнализации или thigmomorphogenesis в значительной степени связано с двумя причинами: требование к трудоемким человека ручной манипуляции сенсорный индукции thigmomorphogenesis и ошибка силы силы связанных с рукоприковки людей. Для повышения эффективности внешней нагрузки на растительный организм была построена автоматическая сенсорная погрузочная машина. Этот роботизированный рукопожатный щетки для волос обеспечивают трудосберегающее и легко повторяемое моделирование сенсорной силы, неограниченное количество раундов сенсорного повторения и регулируемую силу касания. Эта машина для погрузки прикосновения волос может быть использована как для крупномасштабного скрининга сенсорных сигнальных мутантов, так и для исследования феномики растительного тигмоорфогенеза. Кроме того, сенсорные материалы, такие как человеческие волосы, могут быть заменены другими натуральными материалами, такими как волосы животных, шелковые нити и хлопковые волокна. Автоматизированное движущееся оружие на машине может быть оснащено сопла миографами и воздуходувками, чтобы имитировать природные силы капель дождя и ветра, соответственно. Используя эту автоматическую машину погрузки с прикосновением волос в сочетании с ручным прикосновением ватного тампона, мы исследовали сенсорную реакцию двух силовых сигнальных мутантов, MAP KINASE KINASE 1 (MKK1) и MKK2 . Фаромы сенсорной силы загружены растениями дикого типа и двумя мутантами были оценены статистически. Они продемонстрировали значительные различия в сенсорной реакции.
Introduction
Завод thigmomorphogenesis это термин, который был придуман Jaffe, MJ в 1973году 1. Это тропизм растений, но отличается от известного фототропизма или гравитропизма, вызванного стимулами солнечного света или гравитации2,3. Он описывает фенотипические изменения, связанные с периодическими механическими стимуляциями, которыечасто наблюдались ботаниками в прежние времена 4,5. Капли дождя, ветер, растение, животное и человеческие прикосновения, даже укусы животных, все считаются различными типами механо-стимулов, которые вызывают силу сигнализации в растениях4,5. Характеристики растений thigmomorphogenesis включают задержку болтов, короткий стебель, меньше розетки / листьев размера в травянистых растений, и толще стебля в древесных растений6,7,8. Это в отличие от тигмонастики или тигмотропной реакции часто встречаются в Mimosa завода или других механо чувствительных виноградных лоз, где эти быстрые сенсорные реакции легче наблюдаться1,9,10. Thigmomorphogenesis, с другой стороны, относительно трудно наблюдаться из-за его медленной реакции роста. Thigmomorphogenesis обычно наблюдается после недели или даже лет непрерывной стимуляции силы загрузки. Эта уникальная природа реакции прикасание растений затрудняет выполнение переднего генетического экрана с помощью человеческой стимуляции прикосновения руки, чтобы изолировать сенсорную силу, сигнализирующую устойчивых мутантов в надежной манере.
Чтобы выяснить путь трансдукции сигнала силы и молекулярные механизмы,лежащие в основе тигмолорфогенеза 6,11, молекулярные и клеточные биологические эксперименты были выполнены в последние6, 12,13,14. Эти исследования показали, что рецепторы сигнала силы растения в основном состоят из механочувствительных ионных каналов (MSC) и привязываемых комплексов MSC, составленных многомерными комплексами мембранно-охватывающих белков11,14 , 15. Цитоплазмический Ca2 "переходный шип генерируется в течение нескольких секунд после первоначального прикосновения. Ветер-, дождь, или gravi-стимуляции может взаимодействовать с датчиками кальция вниз по течению, чтобы преобразовать сигналы силы к ядерным событиям14,16,17,18. В дополнение к молекулярным и клеточным исследованиям, передний генетический экран с ручным прикосновением пальца растений обнаружил, что фитогормоны и вторичные метаболиты участвуют в последующей сенсорной индуцируемой (TCH) экспрессии гена после сенсорная загрузка13,19. Для примера, aos и opr320 мутантов были определены до сих пор от генетических исследований. Однако основной проблемой, связанной с применением передовой генетики при изучении тигмолорфогенеза, по-прежнему является интенсивная труд, необходимая для количественной оценки уровня сенсорной реакции и прикосновения к большой популяции генетически мутировавших отдельных растений. Трудоемкая проблема также сохраняется в руке касаясь на основе мутанта экран14,20. Например, чтобы выполнить один раунд сенсорной стимуляции, человек должен коснуться 30-60 раз (одно касание в секунду) на отдельном заводе. Для того, чтобы иметь достаточное количество растений для статистического анализа фенотипа, 20-50 отдельных растений одного генотипа, как правило, необходимы для процесса загрузки сенсорной силы. Этот режим загрузки сенсорной силы означает, что человек должен повторно выполнять 600-3000 касаний по одному генотипу выбора. Этот тип прикосновения обычно необходимо повторять от 3 до 5 раундов в день, что составляет примерно 1800-15000 палец или ватный тампон касается в день на генотип растений. Хорошо обученный человек, как правило, требуется для поддержания силы и силы нескольких касаний в пределах желательного диапазона в течение многих раундов повторения в день, чтобы избежать больших изменений в силе и силе. Как хорошо известно, что тигмоорфогенез является сатурируемым и дозозависимым процессом6,21, сила касания / сила становится критически важным для успеха в запуске сенсорной реакции растения.
Для удаления зависящей от человека сенсорной нагрузки и поддержания механического применения в приемлемом диапазоне ошибок14,мы поэтому разработали автоматическую сенсорную загрузку для замены ручных касаний. Машина имеет 4 движущихся оружия построен, каждый из которых оснащен одной человеческой щеткой для волос. Эта версия называется Модель K1, чтобы указать его особенность человеческого волоса сенсорной нагрузки. Если 4 генотипа измеряются количественно для их тигмоорфогенеза или сенсорной реакции под одной машиной, 40-48 человек на генотип может быть измерено. Каждый раунд сенсорного повторения (менее 60 раз касания на каждое растение) длится менее 5 минут с помощью движущейся скорости регулируемой роботизированной руки. Таким образом, растения на сенсорной машине Model K1 могут быть механически стимулированы в течение нескольких раундов в день либо с постоянной загрузкой сенсорной силы, либо с различными уровнями прочности, как первоначально запрограммировано.
Arabidopsis thaliana, модель растительного организма, поэтому был выбран в качестве целевого вида растений для тестирования полностью автоматического применения машины погрузки волос сенсорной силы. Потому что Есть несколько крупных семенных банков для извлечения различных зародышевых мутантов и размер цветения, Arabidopsis хорошо подходит для пространства, доступного в рост полке установлен с моделью K1 сенсорный аппарат.
Автоматическая сенсорная машина Model K1 состоит из трех основных компонентов: (1) металлическая стойка H-формы, состоящая из двух линейных приводов, (2) роботизированные металлические руки, оснащенные щетками для волос, и (3) контроллер. Для настраиваемой модели K1 сенсорной машины, каждый модуль X / Y оси состоит из одного пояса управляемых направляющий-железнодорожный, два слайд-блоков (красный) и один 57 ступенчатый двигатель (предварительно установлены и демонтированы) (Рисунок 1A,B). Верхний горизонтальный привод позволяет роботизированной металлической руке двигаться влево и вправо горизонтально, нижний вертикальный пояс-управляемый линейный привод позволяет роботизированной металлической руке двигаться вверх и вниз вертикально (Рисунок 1B, Рисунок 2A ). Четыре разъемных роботизированных оружия были установлены на вертикальном приводе(рисунок 1C, рисунок 2B). Четыре человеческие щетки для волос были связаны с четырьмя роботизированными руками, соответственно(рисунок 1C, рисунок 2B). Все механические детали для построения модели K1 сенсорный аппарат в смелый шрифт ниже отмечены на рисунке 1C (также см. таблицу материалов).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка семян
ПРИМЕЧАНИЕ: Семена арабидопсис а дикий тип (Col-0), а также mkk1 и mkk2 потери функции мутантов, используемых были приобретены из Arabidopsis биологический ресурсный центр (ABRC, https://www.arabidopsis.org, Колумбус, Огайо).
- Рассчитайте, сколько растений каждого генотипа будет использовано для надежного статистического анализа. Подготовьте достаточное количество семян на основе скорости прорастания каждой линии, как правило, в 4-5 раз больше, чем необходимо для эксперимента. Убедитесь, что достаточное количество здоровых и равномерного размера растений могут быть использованы для сенсорного ответа ассее. Согласно этому протоколу, 300-500 семян на генотип обычно используются для производства 80-90 растений аналогичного размера.
- Погрузите семена в холодную воду и храните их в 4 градусах Цельсия (покрытые алюминиевой фольгой, чтобы держать в темноте) для впитывания семян. Посеять семена через 5-7 дней после впитывания.
2. Рост растений
- Выберите подходящую почву для роста растений (см. Таблицу материалов). Избегайте больших сгустков и смешивайте их однородно.
- Приготовьте 24 пластиковых стаканчика: емкость холдинга составляет 207 мл, а диаметр верхнего обода - 7,4 см. Пробурите три круглых отверстия на дне чашки для орошения.
- Заполните эти пластиковые стаканчики смешанной почвой. Пусть почва накапливается до 1-2 см выше, чем обод чашки и сгладить поверхность сложенной почвы мягко.
- Передача 24 чашки в пластиковый лоток (21 дюймов х 10,8 дюйма х 2,5 дюйма) и место лоток в постоянном состоянии света (см. ниже).
- Добавьте 2,5 л воды в каждый лоток за два часа до посева семян. Пусть почва поглощать воду из отверстий, расположенных на дне чашки и ждать поверхности почвы, чтобы упасть на уровень края чашки.
- Посеять 3-4 семян в одном месте, и 4 равномерно распределенных пятен в чашке.
- Поместите прозрачную пластиковую крышку над каждым подносом, и пусть семена прорастают в течение недели. Затем снимите крышку и дайте рассаду расти еще неделю.
- Удалить дополнительные растения путем истончения и держать 4 растений лиц аналогичного размера в каждой чашке 9-10 дней после посева семян.
- Орошать растения с 1,5 л воды через день после прорастения семян.
3. Состояние роста
- Установите температуру камеры роста на уровне 23,5 и 1,5 градуса по Цельсию, а влажность между 35 и 45%.
- Установите интенсивность света между 180 и 240 йЕзм-2-1 (измеряется IL 1700 научно-исследовательский радиометр, Международный свет)14. Фотосинтетическое активное излучение составляет от90 до 120 -0 -2 -1 .
- Установите состояние света, чтобы быть 24 ч постоянной.
4. Конструкция сенсорной погрузочной машины
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот роботизированный волос сенсорной загрузки машины (Модель K1) предназначен для служить целям как сенсорной силы сигнализации мутантов скрининга и завода thigmomorphogenesis поколения (Рисунок 1, Рисунок 2).
- Предустановки модулей (неизменяемые, Рисунок 1C)
- Установите два слайд-блока (I) и один 57-ступенчатый двигатель (II) на модуль направляющих-железнодорожных x/Y оси (III/V).
- Установите два слайд-блока (I) на вспомогательную балку X/Y (IV/VI).
- Установка других механических деталей(рисунок 1C)
- Исправьте модуль направляющего поговора X (III) и вспомогательную балку X,1, собрав две перекрестные пластины (VII) на каждом конце направляющей железной дороги.
- Зафиксите модуль y оси направляющий-железнодорожный модуль (V) на dorsal 2 блоков скольжения (X оси) в пересечении положения путем собирать 2 плиты соединения (VIII) между.
- Зафиксите вспомогательную балку Y оси (VI) на замке двух других блоков слайдов (X оси) в положении пересечения, собрав две пластины соединения (VIII) между ними.
- Соберите держатель оружия робота (IX) на передней части двух блоков слайда (Y оси) в положении пересечения с пропускной пластиной (рисунок2A).
- Соберите 4 щетки для волос (X) на руки робота (IX) с зажимами (рисунок2B).
5. Настройка погрузочной машины Touch-Force
ПРИМЕЧАНИЕ: Все параметры управления для установки модели K1 сенсорный аппарат в смелых шрифтнижениже ниже показаны в панели управления (Рисунок 2F).
- Установите сенсорные щетки для волос на роботизированные руки. Используйте 330 мм длиной стальной линейки в качестве держателя, чтобы исправить один слой человеческих волос (3600-4600 волос / щетки) равномерно. Длина волос 126 мм(рисунок 1С).
- Закрепите эти стальные линейки на роботизированные руки с двумя металлическими зажимами.
- Сначала установите высоту пулеметных рук вдоль вертикального измерения (оси Y). Нажмите Jog F, чтобы поднять и Jog R- снизить роботизированные руки и кисти. Пусть кончик щетки волос 0,5 см ниже, чем обод чашки. Нажмите на нулевой набор. Предварительно запустить машину 1-2 циклов, чтобы убедиться, что все люди завода в настоящее время коснулся. Отрегулируйте и откалибруйте щетки и кончики волос на один аж каждый день в течение всего трогательного периода.
- Используйте электронную шкалу для измерения силы касания (вертикальная загрузка) и поддержания уровня сенсорной силы на уровне 1-2 мН14.
- Установите исходное положение пулеметных рук вдоль горизонтального измерения (x ось) вручную. Разрешить щетки для волос, чтобы повесить на краю каждого лотка и убедитесь, что ни одно растение в настоящее время коснулся до трогательного эксперимента начинается. Нажмите Jog F /Jog R- для перемещения машины руку горизонтально мало-помалу, чтобы установить исходное положение.
- Установите расстояние путешествия щетки для волос в горизонтальном измерении (X ось) до 365 мм, нажав кнопку Путешествия. Пресс Инк F /Inc. R- для перемещения оружия машины, чтобы получить полное расстояние путешествия и обеспечить, чтобы все обработанные растения в настоящее время коснулся в течение всего трогательного эксперимента.
- Установите скорость движения вдоль оси X пулемета на 5000 мм/мин, нажав кнопку Автоматической скорости. Сохраняйте ту же скорость движения в течение всего эксперимента касания.
- Установите время касания в 20 пробах, нажав кнопку Малого цикла. Держите одинаковое количество касаний за раунд в течение всего эксперимента касания.
ПРИМЕЧАНИЕ: Один малый цикл равен двум расстояниям путешествия, что означает, что пулеметные руки будут перемещаться от исходного положения к конечному положению, а затем обратно в исходное положение. Один незначительный цикл генерирует два касания. Волосы щетки коснуться растений 40 раз в течение 20 испытаний (2 касания х 20 испытаний и 40 касаний). 40-касание определяется как один раунд сенсорной нагрузки силы. - Установите интервал повторения сенсорного раунда на 480 минут в день, нажав кнопку Основной период. Сохраняйте ту же частоту сенсорных раундов в течение всего эксперимента касания.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это позволяет щетки для волос прикасаться к растениям в течение 3 раундов в день, и интервал времени между каждым раундом составляет 480 мин (8 ч). Отображенный синий номер означает интервалвремени каждого раунда касания. Машина запустит новый раунд касания автоматически, когда обратный отсчет ниже (красное число) превратится в 0000. - Установите основной цикл на 12 испытаний, что означает, что машина будет касаться растений в течение 12 раундов в течение 4 дней автоматически. Эта настройка из 12 проб используется, чтобы избежать человеческой ошибки в пропуске дня прикосновения.
- Нажмите кнопку «Пуск», чтобы инициировать заранее установленную программу. Сенсорная машина Model K1 автоматически выполняет загрузку сенсорной силы в соответствии с настройками.
6. Сбор и анализ физиологических данных
-
Дни к Bolting: Запишите болтами день каждого завода индивидуально в пределах касатьясь эксперимента. Болтинг является символом того, что растение меняет свою стадию роста от вегетативной фазы к репродуктивной фазе. В Arabidopsis, болтами день определяется как количество дней, используемых растением, чтобы его первый соцветия стволовых достичь 1 см в длину.
ПРИМЕЧАНИЕ: Под состоянием роста описано выше, болтовые растения дикого типа обычно инициирует от 19 до 23 дней после посева семян и заканчивается в 28-32 дней. -
Радиус розетты: Измерьте расстояние от центра розетки до кончика самого длинного листа.
- Сфотографируйте весь лоток сверху. Сфотографируйте контрольную группу и группу сенсорной обработки по отдельности.
- Скачать соответствующее программное обеспечение. Например, используйте бесплатно загруженное программное обеспечение ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/download.html).
- Откройте файл фотографий, используйте функцию масштабирования, чтобы увеличить изображение фотографии до соответствующего размера.
- Выберите прямой инструмент, чтобы провести прямую линию между центром розетки и кончиком длинного листа для измерения радиуса розетки.
- Выберите одно растение и нажмите левую кнопку, чтобы нарисовать прямую линию от центра розетки до самого длинного кончика листа.
- Выберите функцию Анализ-Мера или нажмите Ctrl m для анализа расстояния линии.
- Выберите одну чашку и повторите предыдущие два шага, чтобы проанализировать диаметр каждого пластикового стаканчика в то же время. Используйте эти данные для выполнения расчета для устранения предубеждений, возникающих в результате фотосъемки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Уравнение:
Ra/Da r m/Dm
(Ra, фактический радиус Розетта растения; Da, фактический диаметр пластикового стаканчика; Rm, измеренный радиус Розетта того же завода, определяемый программным обеспечением; Dm, измеренный диаметр пластиковой чашки, которая используется для выращивания того же растения)
-
Розеттская область: Измерьте горизонтальную 2-мерную площадь поверхности листьев розетки.
- Удалите соцветия, не затрагивая остальные органы розетки.
- Сфотографируйте с верхней части каждого растения вместе с линейкой масштаба, расположенной неподалеку.
- Используйте один бесплатный плагин ImageJ, Розетт Tracker и следовать протоколу, опубликованному ранее22.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Автоматическая машина погрузки касания волос
Для наблюдения морфологических изменений на растениях, как воспроизводимые условия роста и методы лечения являются ключевыми для получения повторяемых результатов. Эта высокопроизводительная и автоматическая сенсорная сигнализация мутанта достигается за счет недавно построенной машины погрузки прикосновений для волос, Модели K1(рисунок 1, Рисунок 2). Эти щетки для волос могут коснуться максимум 4 лотки растений одновременно. Существовали 24 чашки помещены в лоток, и 12 чашек растений в группе, используемой в качестве контроля и обработанных растений(рисунок 2C,D). В каждой чашке, 4 завода были выращены и итого 48 или более индивидуалки завода были коснуты такой же щеткой волос, которая гарантирует достаточные заводы для более последующего статистического анализа. Максимум 4 генотипа растений могут быть сенсорным одновременно обработаны на одной модели K1 сенсорной машины. Одним из ключевых моментов является установка сенсорной машины руку / высота волос, потому что тигмоорфогенез зависит от дозы6,21. Различные положения волос по отношению к позиции листьев розетки растения генерировать различные силы прикосновения, которые могут генерировать совершенно разные результаты тигмоорфогенеза. В наших экспериментах, растение-контактный кончик волос окси должны быть размещены 0,5 см ниже, чем обод чашки(Рисунок 2E), который генерирует силы, которые похожи на ранее опубликованные сенсорные силы14. Программируемый контроллер, установленный в сенсорной панели, используется для управления всей погрузочной машиной сенсорной силы(рисунок 2F, см. Таблицаматериалов).
Сравнение двух различных методов касания
Для сравнения этого автоматического метода управления волосами с обычным методом прикосновения к ватному тампону вручную были проведены два независимых эксперимента на Col-0 (рисунок 3). В ватном тампоне сенсорная группа, прикосновение началось с 12-дневных растений. Каждый раунд имел 40 касаний (1 касание/с). В общей сложности, 3 раунда были выполнены каждый день(рисунок 3A). Он показал 1,7 дней задержки в болтах после непрерывного ватного тампона сенсорной обработки (22,1 и 0,2 дней против 23,8 и 0,2 дней). Аналогичным образом, для автоматического машинного касания волос, сенсорная загрузка, начатая с 14-дневных растений и 40 раз прикасаться (в течение 3 минут) были применены для раунда. В общей сложности, 3 раунда касаний были выполнены в день с ровно 8 часов интервала(рисунок 3B). Задержка болтов наблюдалась на заводах Col-0. Среднее время болтов составило 23,0 и 0,3 дня, в то время как время болтов модели K1 сенсорных обработанных заводов было 24,7 и 0,2 дня. Различия между контрольными и сенсорными растениями были проанализированы с помощью модели пропорциональных опасностей Кокса. Он предложил оценкам Риск Коэффициент (HR) 0,31 (хлопок мазок touch) и 0,52 (машина управляемых волос touch), соответственно(Рисунок 3C), что означает, что болтовые риск / вероятность растений в коснулся группы составляет 31% и 52% по сравнению с растений в контрольной группе, соответственно. Это указывает на то, что возможность болтового из коснулся дикого типа растений составляет около половины по сравнению с нетронутой растений управления независимо от того, является ли это ручное прикосновение с ватным тампоном или автоматизированного прикосновения волос.
Перспективные результаты по различным сенсорным мутантам
Последние предварительные данные свидетельствуют о том, что MKK1 и MKK2 может играть важную роль в сенсорной реакции Arabidopsis14. Мы выбрали этих двух мутантов и провели сенсорные эксперименты на этих настраиваемых сенсорных мутантов с помощью автоматической машины загрузки касания волос(Рисунок 4, Таблица 1). Дикие заводы по управлению типом показали 1,8 дней задержки болтов (24,1 - 0,3 дня против 25,9 - 0,2 дня, рисунок 4А) так же, как предыдущий отчет14, в то время как эта задержка болтами не наблюдалась на T-ДНК вставляющихмут мутантов, mkk1 (24,6 и 0,2 дни против 24,4 и 0,3 дня, Рисунок 4B и таблица 1) и mkk2 (23,9 и 0,1 дня против 24,2 и 0,2 дня, Рисунок 4C и таблица 1). Анализируя эти данные с univariate Кокс пропорциональных опасностей модели, только дикий тип Col-0 выставлены значительные различия между контролем и коснулся растений с оценками HR 0,41 (Рисунок 4D). Эти эксперименты по погрузке сенсорной силы, проведенные автоматической погрузочной машиной для касания волос, показали, что мутанты mkk1 и mkk2 являются мутантами сенсорной реакции.
Измерение других морфологических индексов
Морфологические изменения, связанные с тигмолорфогенезом, не ограничиваются задержкой болтов. Оба коротких стволовых и меньше размер листьев розетки такжекомпоненты тигморофорфогенеза 6,7,9,14. Таким образом, мы сообщили здесь два дополнительных типа измерений на морфологические индексы сенсорного ответа, радиус розетки / длина листьев и розетки (прогноз) области (Рисунок 5). Подобно ранее наблюдаемому изменению фенотипа, растение дикого типа Col-0 показало значительно меньший радиус розетки и более короткую длину листьев после 3 дней постоянного и повторяющихся автоматических машинно-управляемых прикосновений к волосам (1,77 и 0,05 см против 1,50 и 0,04 см, рисунок 5А). Прогнозируемая область розетки была изменена с 20,32 и 0,53 см2 до 16,19 и 0,48 см2 после 13 дней прикосновения (рисунок5B). Оба mkk1 и mkk2 имели подобный уменьшенный радиус розетки и область. В совокупности эти данные показали, что белки MKK1 и MKK2 важны для задержки арабидопсиса и не требуются при формировании размера розетки и области розетки.
Статистический анализ
Что касается коробок и усов участков, показанных на рисунке 2 и рисунке 3 и диаграммах столбцов, показанных на рисунке 5,статистическая значимость была проанализирована двуххвостым студенческим t-тестом, со значением, представленным на p. Злт; 0,001 и р.р.; 0,05, соответственно. Для kaplan-Meier участков, показанных на рисунке 2 и рисунке 3, univariate Кокс анализ опасности был использован для анализа влияния сенсорной обработки на болтами событие23,24. Коэффициент опасности (HR), 95% Интервал доверия (95% CI) и значение p предложены в таблицах ниже. Например, HR 0,5 означает, что в определенный день риск/вероятность попадания растений в поэту группу составляла 0,5 или 50% по сравнению с растениями в контрольной группе.
Рисунок 1 . Конструкция и параметры автоматической погрузочной машины для касания волос. (A) Схемы по умолчанию линейного актуатора. Верхняя левая панель — боковой вид, а нижняя левая — стрижка. Общая длина модуля X оси и y-оси составляет 843 мм и 1038 мм соответственно. Каждый модуль X/Y по умолчанию состоит из одного направляющего рельса, одного слайд-блока и одного 57 ступенчатого двигателя (предварительно установленного и съемного). Для настраиваемых сенсорных машин Модели K1 каждый модуль X/Y состоит из двух блоков слайдов (красный). Соединит плиту модуля X увеличена с 56 мм до 100 мм, чтобы обеспечить лучшее соединение и поддержку. Верхняя правая панель представляет собой поперечное сечение направляющей железной дороги, а нижняя правая панель - 57-ступенчатый двигатель. (B) Схемика построенной двойной оси X и двойной Y оси линейных приводов. Это основная часть сенсорной погрузочной машины. Нижняя левая панель представляет собой торцевый вид построенных линейных приводов. Верхняя левая панель представляет собой боковой вид модуля оси X (843 мм). Средняя панель представляет собой боковой вид модуля оси Y (1038 мм). Верхняя правая панель представляет собой торсальный вид 4 слайд-блоков на модуле Y и вспомогательной балке Y. Нижняя правая панель представляет собой торсальный вид пластины соединения на модуле X. (C) Flowchart сборки части машины. Различные части отмечены и названы на рисунке. Подробные процессы сборки были описаны в протоколе. Показано, что эта цифра мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 . Общий дизайн автоматической погрузочной машины для касания волос. (A) Готовая модель K1 сенсорная машина. Фотография была сделана с лицевой стороны. Верхний линейный актуатор управляет рукой робота, движущейся горизонтально, а нижний линейный актуатор управляет роботизированной рукой, движущейся вертикально. (B) Боковой вид, показывающий съемное роботизированное оружие. На роботизированные руки были зажаты щетки для волос. (C и D) Фотографии, показывающие, как человеческие волосы щетки касаются растений, которые были взяты с передней стороны и боковой стороны, соответственно. (E) боковой вид, показывающий, как установить высоту щетки для волос против края чашки. Видны как руки машины, так и щетки для волос. (F) Интерфейс работы сенсорной машины Модели K1. Программируемый контроллер (AFPX-C30T), связанный с сенсорной панелью (MT6070i), используется для управления всей машиной. Подробные настройки и операционные процедуры описаны в протоколе. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3 . Сравнение эффектов двух сенсорных методов на тигмолорфогенез. (A-B) Сравнение ручного ватного тампона touch (A) и человеческого прикосновения волос, управляемого автоматической сенсорной погрузочной машиной (B), соответственно. На левой панели показаны участки коробки и усы, которые показывают сравнение среднего дня болтового между контрольной группой и тронутой группой. Показаны средства и SE. Статистический анализ был выполнен спомощьне по Т-тесту студента. Значение на p lt; 0.001 показано как «» Участки Каплан-Мейер показаны в середине, которые представляют собой процент болтовых растений на время роста (дней после посева). Правая панель показывает представительных лиц нетронутого управления и коснулся растений, которые показывают разницу во времени болтами и высота соцветия ствола. (C) Обобщенная таблица: числовые числа в контроле и коснулся столбцов являются номером растений, используемым для статистического анализа. Коэффициент опасности (HR), 95% Доверительный интервал (95% CI) и значение p в разделе univariate Анализ опасности Кокса предлагаются. Риск болтами и вероятность растений в группе тронутых составили 31% и 52% по сравнению с нетронутой группой, соответственно. Анализ неиватриатной опасности Кокса был оценен SPSS. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4 . Thigmomorphogenesis mkk1 и mkk2 мутантов, а также дикий тип завода (Col-0) индуцированных автоматическим прикосновением волос. (A-C) Перспективный сенсорный ответ Col-0 (A), mkk1 (B), и mkk2 (C) порожденных путем повторения человеческих прикосновений волос, управляемых автоматической сенсорной силой погрузочной машины. На левой панели показаны участки коробки и усы, которые представляют собой сравнение среднего дня болтами между контрольной группой и тронутой группой. Показаны средства и SE. Статистический анализ был выполнен спомощьне по Т-тесту студента. В "И. и n.s." представляют p lt; 0,001 и р.г.; 0,05, соответственно. В середине показаны участки Каплан-Мейер, которые представляют собой процент болтовых растений в течение периода роста (дней после посева). Правая панель показывает представителей лиц нетронутого управления и коснулся растений, которые показывают болтами разница. Данные mkk1 (B)и mkk2 (C) были собраны из двух и трех биологических репликаций, соответственно. Подробные номера растений, используемые в каждой репликации, были показаны в таблице 1. (D) Обобщенная таблица: номера под управлением и сенсорными столбцов были номером завода, используемым/проанализированным в этих двух группах, соответственно. HR, 95% CI и p значение в разделе univariate Кокс анализа опасности были предложены. Риск болтов/вероятность растений дикого типа в прикасаевой группе составляет 41% по сравнению с контрольной группой. Анализ неиватриатной опасности Кокса был оценен SPSS. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5 . Радиус розетки и измерения площади для определения тигмолорфогенеза. (A-B) Радиус розетки и область розетки дикого типа были измерены в день 17 и 27 день после посева семян, соответственно. Бары, показанные в верхней левой панели, являются сравнениями радиуса розетки или розетки между контрольной группой и тронутой группой, соответственно. Показаны средства и SE. Статистический анализ был выполнен студенческая t-test; р Злт; 0,001. Фотографии, показанные в верхней правой панели являются репрезентативными отдельными растениями. В приведенных ниже таблицах показанномер растения, анализируемый в контрольной группе и в группе тронутых. Также показаны радиус розетки (см) в 17-й день и область розетки (см2)в 27-й день. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Таблица 1. Данные болтов различных биологических репликаток. Обобщенные таблицы содержит два биологических репликации mkk1 и три биологические репликации mkk2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Thigmomorphogenesis является сложной реакции роста растений на механические возмущения, которая включает в себя сеть клеточной сигнализации и действия фитогормонов. Это следствие адаптивной эволюции растений, чтобы выжить в нежелательных условиях окружающей среды25,26. Механическое прикосновение, особенно прикосновение человеческого пальца и ручной ватный тампон прикосновение, были выбраны для изучения этого морфологического изменения в ранее thigmomorphogenetic исследований14,20. Эта упрощенная версия сенсорной загрузки, чтобы вызвать реакцию сенсорного растения, легче контролировать и применять. Кроме того, этот тип сенсорной силы загрузки метод может каким-то образом имитировать ветер-и дождь капли стимулировали сигналы силы, производимые в естественной среде19. Сила касания способна вызвать всплески кальция, вызвать фосфорилирование белка14 и экспрессию генов вниз по течению, опосредовающей сенсорную реакцию19. Аналогичным образом, человеческие щетки для волос, установленные на автоматизированных движущихся оружия хавки может также генерировать растение сенсорный ответ, имитируя человека ручной манипулируют прикосновения. Для диверсификации видов применения силы, водоссыпание сопла и / или ветровых воздуходувок также могут быть установлены на роботизированные руки машины и использоваться для физиологического эксперимента(рисунок 2). Уникальная особенность делает автоматическую механическую погрузочную машину более универсальной в морфогенетических и физиологических исследованиях. Самым большим преимуществом этой автоматической механической погрузочной машины является, вероятно, ее безтрудная, повторяемая и экономящая время функция, которая позволяет выполнять определенный выбор фенотипа мутантов из большого числа мутагенизированных особей. В отличие от часов человеческих рук манипулируемых прикосновений, сенсорная машина Model K1 может одновременно прикасаться к различным мутантам и выполнять круг касания в течение 3-5 минут. Сроки для раунда касания во многом зависят от настройки программы в начале лечения. Если каждое отдельное растение будет коснулся 40 раз в раунде, модель K1 машина будет нужно только 9-15 минут, чтобы закончить три раунда сенсорной обработки в течение дня. Интервал времени между каждым раундом касаний можно точно контролировать; это менее вероятно, для человека для достижения такой точности.
Еще один важный вопрос, касающийся сенсорной обработки, заключается в том, на какой стадии роста растений необходимо применять сенсорную силу. В нашей практике, прикосновение началось через 14 дней после посева семян как для дикого типа, так и для двух мутантов, так как темпы роста этих трех генотипов схожи. Для тех мутантов, которые имеют значительную разницу во времени разработки от дикого типа, можно выбрать другой первый день, чтобы начать прикосновение. Выполнение одностороннего теста ANOVA на болтах данных как дикого типа растений и мутантов для нескольких сравнений может помочь14. Этот статистический анализ может предложить правильный вывод о различиях времени болтов, порожденных генотипами. В этом случае следует использовать многовариантный анализ пропорциональных опасностей Кокса для рассмотрения двух переменных параметров.
Чтобы установить сенсорный уровень человеческих волос, установленных на модели K1 сенсорной машины, мы отрегулировали как высоту (вертикальная сила) и скорость (горизонтальная сила) щетки для волос (Рисунок 2E). Правильные настройки были определены на основе предварительных данных, собранных в ходе многочисленных раундов испытаний уровня силы на заводе Арабидопсис, размещенных в электронном масштабе. Как мы обнаружили, сохраняя как рост волос и скорость без изменений на протяжении всего эксперимента сенсорного ответа будет производить аналогичные и постоянные thigmomorphogenetic фенотип среди репликдляет для линии Arabidopsis. Слишком тяжелая сенсорная сила может убить молодых саженцев, как быстро движущихся щетки для волос может привести к ранению на поверхности листа. В отличие от этого, слишком легкий сенсорной силы может быть недостаточно, чтобы вызвать задержку болтами в течение 2 недель после повторения прикосновения. В нашем предыдущем эксперименте мы определили, что соответствующая загрузка сенсорной силы составит 1-2 мн на касание14,19. Длина волос на 0,5 см ниже, чем обод чашки используется для создания аналогичной вертикальной силы касания на модели K1 на основе машины прикосновения волос с нежной горизонтальной скоростью перемещения 5000 мм/мин(Рисунок 2E). Эта фиксированная настройка машины Model K1 уменьшает изменение силы в результате человеческой ошибки.
В целом, прикосновения волос, выполняемые автоматической сенсорной погрузочной машиной, обеспечивают только среднюю загрузку сенсорной силы на растениях. Точную сенсорную силу, особенно горизонтальную силу, трудно вычислить либо для одного волоска, либо для группы волос на кисти. Кроме того, дисперсия формы растения и высота ствола может помешать применению горизонтальной силы. Измерение такого рода физической силы или стресса нуждается в более точном датчике давления, связанном с волосами или группой волос. Считается, что более точный датчик давления и математическое моделирование будут применяться для улучшения автоматической сенсорной загрузки машины в будущем. Условия роста, такие как интенсивность света, влажность почвы и температура теплицы, а также питательные вещества, снабжающие, играют решающую роль в развитии фенотипа сенотипа сенотипа. Любые стрессовые условия, такие как засуха, слабое состояние света с менее чем 90-М-2-1, и более высокая или более низкая температура, которая может повлиять на нормальный рост арабидопсиса, будут мешать измерению сенсорной реакции обоих диких типов и мутантов.
Короче говоря, эта автоматическая сенсорная загрузка может предложить больше экономии труда и в форме средней сенсорной силы загрузки, чем прикосновение человеческого пальца и ватный тампон прикасаться. Ожидается, что сенсорная машина Model K1 будет применяться в различных высокопроизводительных сенсорных сигнальных мутантов и сенсорный ответ анализа среди сельскохозяйственных культур или, вероятно, животных моделей с некоторыми изменениями сенсорной силы загрузки Машина.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано следующими грантами: 31370315, 31570187, 31870231 (Национальный научный фонд Китая), 16100318, 661613, 16101114, 16103615, 16103817, AoE/M-403/16 RGC (Гонконг). Авторы хотели бы поблагодарить Ju Feng Точности и автоматизации технологии Limited (Шэньчжэнь, Китай) за их предложение нескольких схем, показанных на рисунке 1.
Авторы также хотели бы поблагодарить С. К. Ченга и В. К. Ли за их вклад в развитие сенсорной погрузочной машины.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4 hair brushes | customized | ||
| 4 robot arms with one holder | customized | 1000 mm length holder and 560 mm length robot arm | |
| 57 stepper motor | 57HS22-A | ||
| All purpose potting soil | Plantmate, Hong Kong | ||
| Arabidopsis plant seeds | Arabidopsis Biological Resource Centers, Columbus, OH | For arabidopsis seed purchase | |
| BIO-MIX potting substratum | Jiffy Products International BV, the Netherlands | 1000682050 | Two soils were mixed together to grow Arabidopsis. The ratio of All purpos potting soil and BIO-MIX is 1:2 |
| IL 1700 research radiometer | International Light, Newburyport, MA | The light intensity of both full-wavelength and photosynthetic active radiation can be measured. | |
| ImageJ | https://imagej.nih.gov/ij/download.html | Free downloaded software | |
| Ju Feng Precision and Automation Technology Limited | Shenzhen, China | For belt-driven linear actuators and other mechanical modules purchase | |
| Junction plate of the slide block | To fix the Y guide-rail module or Y auxiliary girder onto backs of slide blocks | ||
| Junction plate of the X axis module | customized | To connect the X guide-rail module and X auxiliary girder | |
| Slide block | |||
| WDT4045 X axis guide-rail module | 843 mm, customized | Pre-installed with two slide blocks and one 57 stepper motor | |
| WDT4045 Y axis guide-rail module | 1038 mm, customized | Pre-installed with two slide blocks and one 57 stepper motor | |
| X axis auxiliary girder | 843 mm, customized | Pre-installed with two slide blocks | |
| Y axis auxiliary girder | 1038 mm, customized | Pre-installed with two slide blocks |
References
- Jaffe, M. J. Thigmomorphogenesis: the response of plant growth and development to mechanical stimulation with special reference to Bryonia dioica. Planta. 114, 143-157 (1973).
- Vandenbrink, J. P., Kiss, J. Z., Herranz, R., Medina, F. J. Light and gravity signals synergize in modulating plant development. Frontiers in Plant Science. 5, 563 (2014).
- Hashiguchi, Y., Tasaka, M., Morita, M. T. Mechanism of higher plant gravity sensing. American Journal of Botany. 100, 91-100 (2013).
- Salisbury, F. B. The Flowering Process. , Macmillan. New York. (1963).
- Darwin, C. The Power of Movement in Plants. , Appleton. New York. (1881).
- Chehab, E. W., Eich, E., Braam, J. Thigmomorphogenesis: a complex plant response to mechano-stimulation. Journal of Experimental Botany. 60, 43-56 (2008).
- Telewski, F. W., Jaffe, M. J. Thigmomorphogenesis: anatomical, morphological and mechanical analysis of genetically different sibs of Pinus taeda in response to mechanical perturbation. Physiologia Plantarum. 66, 219-226 (1986).
- Vogel, M. Automatic precision measurements of radial increment in a mature spruce stand and interpretation variants of short term changes in increment values. Allgemeine Forst-und Jagdzeitung. , Germany. (1994).
- Braam, J. In touch: plant responses to mechanical stimuli. New Phytologist. 165, 373-389 (2005).
- Jaffe, M. J., Leopold, A. C., Staples, R. C. Thigmo responses in plants and fungi. American Journal of Botany. 89, 375-382 (2002).
- Telewski, F. W. A unified hypothesis of mechanoperception in plants. American Journal of Botany. 93, 1466-1476 (2006).
- Gutiérrez, R. A., Ewing, R. M., Cherry, J. M., Green, P. J. Identification of unstable transcripts in Arabidopsis by cDNA microarray analysis: rapid decay is associated with a group of touch-and specific clock-controlled genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 11513-11518 (2002).
- Lee, D., Polisensky, D. H., Braam, J. Genome-wide identification of touch-and darkness-regulated Arabidopsis genes: a focus on calmodulin-like and XTH genes. New Phytologist. 165, 429-444 (2005).
- Wang, K., et al. Quantitative and functional posttranslational modification proteomics reveals that TREPH1 plays a role in plant touch-delayed bolting. Proceedings of the National Academy of Sciences United States of America. 115, 10265-10274 (2018).
- Hamilton, E. S., Schlegel, A. M., Haswell, E. S. United in diversity: mechanosensitive ion channels in plants. Annual Review of Plant Biology. 66, 113-137 (2015).
- Knight, M. R., Campbell, A. K., Smith, S. M., Trewavas, A. J. Transgenic plant aequorin reports the effects of touch and cold-shock and elicitors on cytoplasmic calcium. Nature. 352, 524 (1991).
- Toyota, M., Furuichi, T., Tatsumi, H., Sokabe, M. Cytoplasmic calcium increases in response to changes in the gravity vector in hypocotyls and petioles of Arabidopsis seedlings. Plant Physiology. 146, 505-514 (2008).
- Knight, M. R., Smith, S. M., Trewavas, A. J. Wind-induced plant motion immediately increases cytosolic calcium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89, 4967-4971 (1992).
- Braam, J., Davis, R. W. Rain-, wind-, and touch-induced expression of calmodulin and calmodulin-related genes in Arabidopsis. Cell. 60, 357-364 (1990).
- Chehab, E. W., Yao, C., Henderson, Z., Kim, S., Braam, J. Arabidopsis touch-induced morphogenesis is jasmonate mediated and protects against pests. Current Biology. 22, 701-706 (2012).
- Telewski, F. W., Pruyn, M. L. Thigmomorphogenesis: a dose response to flexing in Ulmus americana seedlings. Tree Physiology. 18, 65-68 (1998).
- De Vylder, J., Vandenbussche, F. J., Hu, Y., Philips, W., Van Der Straeten, D. Rosette tracker: an open source image analysis tool for automatic quantification of genotype effects. Plant Physiology. , (2012).
- Clark, T., Bradburn, M., Love, S., Altman, D. Survival analysis part I: basic concepts and first analyses. British Journal of Cancer. 89, 232 (2003).
- Bradburn, M. J., Clark, T. G., Love, S., Altman, D. Survival analysis part II: multivariate data analysis–an introduction to concepts and methods. British Journal of Cancer. 89, 431 (2003).
- Jaffe, M., Forbes, S. Thigmomorphogenesis: the effect of mechanical perturbation on plants. Plant Growth Regulation. 12, 313-324 (1993).
- Kutschera, U., Niklas, K. J. Evolutionary plant physiology: Charles Darwin’s forgotten synthesis. Naturwissenschaften. 96, 1339 (2009).
