Summary
穏やかなタッチフォースローディングマシンは、人間のヘアブラシ、ロボットアーム、コントローラーから構築されています。ヘアブラシは、機械に取り付けられたロボットアームによって駆動され、植物にタッチフォースを適用するために定期的に移動します。機械駆動のヘアタッチの強さは、手動で適用されたタッチの強度に匹敵します。
Abstract
細胞内および細胞外の機械的刺激(または力信号)の両方に応答し、特別な形態変化を開発する植物は、チグモルフォジェネシスと呼ばれる。過去数十年にわたり、いくつかのシグナル伝達成分が同定され、メカノトランスダクション(例えば、カルシウムイオン結合タンパク質およびジャスモン酸生合成酵素)に関与していると報告されている。しかし、力シグナル伝達またはチグモルフォ形成の研究における研究の比較的遅いペースは、主に2つの理由に起因する:チグモルフォジェネシスの手で操作されたタッチ誘導の面倒な人間の要求と力強度誤差人の手触りに関連付けられています。植物生物の外力負荷の効率を高めるために、自動タッチフォースローディングマシンを構築しました。このロボットアーム駆動ヘアブラシタッチは、省力で簡単に再現可能なタッチフォースシミュレーション、タッチ繰り返しの無制限のラウンドと調整可能なタッチ強度を提供します。この毛髪タッチフォースローディングマシンは、タッチフォースシグナリング変異体の大規模スクリーニングと植物チグモルフォジェネシスのフェノミクス研究の両方に使用することができます。また、人間の毛髪などのタッチ素材は、動物の毛髪、絹糸や綿繊維などの他の天然素材と置き換えることができます。機械の自動移動腕は、それぞれ雨滴と風の自然な力を模倣するために、水振りノズルと空気送風機を装備することができます。この自動ヘアタッチフォースローディングマシンを手で行った綿棒タッチと組み合わせて、M AP KINASE KINASE 1(MKK1)とMKK2プラントの2つの力シグナリング変異体のタッチ応答を調べました。.タッチフォースロード野生型植物と2つの変異体のフェノームを統計的に評価した。彼らはタッチ応答に大きな違いを示した。
Introduction
植物チグモルフォジェネシスは、1973年1月にJaffe、MJによって造られた用語です。これは植物のトロピズムですが、太陽光や重力の刺激によって引き起こされるよく知られた光トロピズムや重力とは異なります 2,3.これは、初期の時間4、5で植物学者によって頻繁に観察されている周期的な機械的刺激に関連する表現力学的変化について説明する。雨滴、風、植物、動物および人間の接触、動物咬傷であっても、植物4、5における力シグナル伝達を引き起こす異なるタイプのメカノ刺激であると考えられている。植物のチグモルフォジェネシスの特徴は、ボルト締めの遅れ、より短い茎、草本植物におけるより小さいロゼット/葉のサイズ、および木質植物6、7、8の厚い茎を含む。これは、ミモザ植物または他のメカノ感受性ブドウによく見られるチグモナスチックまたはチグモトロピック応答とは異なり、これらの急速なタッチ応答は1、9、10を観察することが容易である。一方、チグモルフォジェネシスは、成長応答が遅いため観察が比較的困難である。チグモルフォジェネシスは、通常、数週間または連続的な力負荷刺激の後に観察されます。植物のタッチ応答のこのユニークな性質は、強い方法でタッチフォースシグナリング耐性変異体を分離するために、人間の手のタッチ刺激を使用して前方遺伝スクリーンを実行することが困難になります。
チグモルフォジェネシス6、11の根底にある力信号伝達経路および分子機構を解明するために、過去6、分子および細胞生物学的実験が行われてきた。12,13,14.これらの研究は、植物力シグナル受容体が主にメカノ感受性イオンチャネル(MSC)と膜スパンタンパク質の多重体複合体によって構成されるテザリングMSC複合体で構成することを提案している11,14,15.最初のタッチの数秒以内に生成された細胞質Ca2+過渡スパイク。風、雨、または重力刺激は、下流のカルシウムセンサと相互作用して、力信号を核イベント14、16、17、18に伝達してもよい。分子および細胞の研究に加えて、植物の手動指触りを持つ前方遺伝スクリーンは、植物ホルモンおよび二次代謝産物が、その後のタッチ誘導性(TCH)遺伝子発現に関与していることを発見した。タッチフォースローディング13,19.例えば、aosおよびopr3 20変異体は、遺伝的研究から遠く離れて同定されている。しかし、チグモルフォジェネシスの研究における前方遺伝学の適用に関連する主な問題は、タッチ応答のレベルを定量化し、遺伝的に変異した多数の集団に触れるのに必要な集中的な労働である。個々の植物。時間のかかる問題は、手触りベースの変異スクリーン14、20にも持続します。例えば、タッチフォース刺激の1ラウンドを完了するには、人は個々の植物で30〜60回(毎秒1タッチ)に触れる必要があります。統計的表現型解析に十分な数の植物を持つためには、通常、タッチフォースローディングプロセスには、同じ遺伝子型の20~50個の植物が必要です。このタッチフォースローディング体制は、人が選択した1つの遺伝子型に対して600-3,000タッチを繰り返し実行する必要があることを意味します。このタイプのタッチは通常、1日に3〜5ラウンド繰り返す必要があり、これは植物の遺伝子型ごとに1日あたり約1,800〜15,000本の指または綿棒のタッチに相当します。十分な訓練を受けた人は、通常、力と強度の大きな変動を避けるために、1日の繰り返しの多くのラウンドを通じて、望ましい範囲内で複数のタッチの強さと力を維持するために必要とされます。チグモルフォジェネシスが飽和性および用量依存性プロセス6、21であることがよく知られているように、タッチ力/強度は、植物のタッチ応答をトリガすることに成功するために重要になります。
人依存のタッチフォース負荷を除去し、許容誤差範囲内で機械的な適用を維持するために、我々は、したがって、手操作タッチを置き換えるために自動タッチフォースローディングマシンを設計しました。機械に4つの動く腕が造られて、それぞれ1つの人間の毛のブラシが装備されている。このバージョンは、人間の髪のタッチフォースローディングの特徴を指定するためにモデルK1と名付けられています。1台の機械下でのチグモ形態形成またはタッチ応答に対して4つの遺伝子型を定量的に測定すれば、遺伝子型当たり40~48個個体を測定することができます。タッチ繰り返しの各ラウンド(植物あたりのタッチの60回未満)は、移動速度調整可能なロボットアームを使用して5分未満持続します。したがって、モデルK1タッチマシン上の植物は、最初にプログラムされた一定のタッチフォース負荷または異なるレベルの強度を持つ1日に複数のラウンドのために機械的に刺激することができます。
したがって、モデル植物生物であるアラビドプシス・タリアナは、全自動ヘアタッチフォースローディングマシンアプリケーションをテストするためのターゲット植物種として選ばれました。変異体の様々な胚芽と開花の大きさを取り出すために利用可能ないくつかの大きな種子バンクがあるので、アラビドプシスは、モデルK1タッチマシンに取り付けられた成長棚で利用可能なスペースによくフィットします。
モデルK1自動タッチマシンは、(1)2つのベルト駆動リニアアクチュエータで構成されるH字型金属ラック、(2)ヘアブラシを装備したロボット金属アーム、(3)コントローラーの3つの主要コンポーネントで構成されています。カスタマイズされたモデルK1タッチマシンの場合、各X/Y軸モジュールは、1つのベルト駆動ガイドレール、2つのスライドブロック(赤)、1つの57ステッパーモータ(プリインストールおよび取り外し可能)で構成されています(図1A、B)。上部の水平アクチュエータは、ロボット金属アームを左右水平に動かすことを可能にし、下部垂直ベルト駆動の線形アクチュエータは、ロボット金属アームを垂直に上下に動かすことを可能にします(図1B、図2 A)).垂直アクチュエータには4本の取り外し可能なロボットアームが取り付けられました(図1C、図2B)。4本のヒト毛ブラシをそれぞれ4本のロボットアームに結合した(図1C、図2B)。下の太字フォントでモデルK1タッチマシンを構築するすべての機械部品は、図1Cにマークされています(また、材料の表を参照してください)。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 種子の準備
注:野生型(Col-0)とmkk1およびmkk2機能喪失変異体の両方のアラビドプシス種子は、アラビドプシス生物資源センター(ABRC、https://www.arabidopsis.org、コロンバス、オハイオ州)から購入した。
- 信頼性の高い統計分析に使用される各遺伝子型の植物個体数を計算します。各ラインの発芽率に基づいて十分な数の種子を準備し、通常は実験に必要なものよりも4〜5倍多く。健康で均一なサイズの植物の十分な数をタッチ応答アッセイに使用できることを確認します。このプロトコルによれば、遺伝子型当たり300〜500種子は、通常、同様のサイズの80〜90植物を生産するために使用される。
- 冷たい水に種子を浸し、種子浸漬のために4 °C(暗く保つためにアルミ箔で覆われた)にそれらを保存します。浸漬の5-7日後に種子をまきます。
2. 植物の成長
- 植物の成長に適した土壌を選択します(材料表を参照)。大きな塊を避け、均質にそれらを混ぜます。
- 24個のプラスチックカップを準備する:保持容量は207 mLで、上部の縁の直径は7.4センチメートルです。
- 混合土壌でこれらのプラスチックカップを埋めます。カップリムより1~2cm高く積み重ねて、積み重ねた土の表面を柔らかく平らにしましょう。
- 24カップをプラスチックトレイ(21インチ×10.8インチ×2.5インチ)に移し、一定の光条件下にトレイを置きます(下記参照)。
- 種子播種の2時間前に各トレイに2.5Lの水を加えます。カップの底にある穴から水を吸収し、土の表面がカップリムレベルに落ちるのを待つために土壌をしましょう。
- 3-4種子を単一の場所に種をまき、カップ内に4つの均等に分散したスポット。
- 各トレイの上に透明なプラスチックカバーを置き、種子を1週間発芽させます。その後、カバーを削除し、苗が別の週のために成長できるようにします。
- 間引きによって余分な植物を削除し、種子播種後9-10日、各カップで同様のサイズの4植物の個体を保ちます。
- 種子が発芽した後、1日おきに1.5Lの水で植物を灌漑します。
3. 成長条件
- 成長室の温度を23.5±1.5°C、湿度35~45%に設定します。
- 180 ~ 240 μE∙m-2°S-1 (IL 1700研究放射計、国際光)14の間の光強度を設定します。光合成活性放射は90~120 μE∙m-2°S-1です。
- 光条件を 24 h 定数に設定します。
4.タッチフォースローディングマシンの構築
注:このロボットヘアタッチフォースローディングマシン(モデルK1)は、タッチフォースシグナリング変異スクリーニングと植物チグモルフォジェネシス生成の両方の目的を果たすように設計されています(図1、図2)。
- プレインストール モジュール (マウント解除、図 1C)
- 2 つのスライド ブロック (I)と 1 つの57 ステッパー モータ (II)を X/Y 軸ガイド レール モジュール(III/V)に取り付けます。
- X/Y 軸補助桁(IV/VI)に 2 つのスライド ブロック (I)を取り付けます。
- その他の機械部品の取り付け (図 1C)
- ガイドレールの両端に2つのジャンクションプレート(VII)を組み立て、X軸ガイドレールモジュール(III)とX軸補助桁(IV)を一緒に固定します。
- Y軸ガイドレールモジュール(V)を2つのスライドブロック(X軸)の背面に固定し、その間に2つのジャンクションプレート(VIII)を組み立てることによって交差位置に固定します。
- Y軸補助桁(VI)を他の2つのスライドブロック(X軸)の背面に固定し、その間に2つのジャンクションプレート(VIII)を組み立てることによって交差位置に固定します。
- ロボットアーム(IX)のホルダーを2つのスライドブロック(Y軸)の前面にジャンクションプレート付きの交差位置に組み立てます(図2A)。
- クランプ付きロボットアーム(IX)に4本のヘアブラシ(X)を組み立てます(図2B)。
5.タッチフォースローディングマシン設定
注:下の太字フォントでモデルK1タッチマシンを設定するための制御パラメータはすべて、コントロールパネル(図2F)に示されています。
- ロボットアームにタッチヘアブラシを取り付けます。330 mm の長さのスチール ルーラーをホルダーとして使用して、人間の髪の 1 つの層(3,600~4,600 本のヘア/ブラシ)を均等に固定します。髪の長さは126mm(図1C)です。
- これらのスチールルーラーを 2 つの金属クランプでロボットアームに固定します。
- 最初に垂直寸法(Y軸)に沿ってマシンアームの高さを設定します。ジョグ F+を押して上げ、ジョグ R-を押してロボットアームとブラシを下げます。ヘアブラシの先端をカップリムより0.5cm低くします。ゼロセットを押します。すべての植物の個人が触れていることを確認するためにマシン1-2サイクルを事前に実行します。タッチ期間中、ブラシとヘアチップを毎日同じ高さに調整し、調整します。
- 電子スケールを使用してタッチフォース(垂直ローディング)を測定し、タッチフォースレベルを1-2 mN14で維持します。
- 水平寸法(X軸)に沿った機械アームの開始位置を手動で設定します。ヘアブラシを各トレイの端に掛け、触れる実験が始まる前に植物が触れていないことを確認します。ジョグF+/ジョグR-を押して、マシンアームを少しずつ水平に動かして開始位置を設定します。
- 移動ボタンを押して、ヘアブラシの移動距離を水平寸法(X軸)で365mmに設定します。プレス株式会社F+/Inc. R-は、完全な移動距離を取得し、すべての処理された植物が全体の接触実験中に触れていることを確認するために、マシンアームを移動します。
- 自動速度ボタンを押して、マシンアームのX軸に沿った移動速度を5,000mm/minに設定します。タッチ実験全体で同じ移動速度を維持します。
- マイナーサイクルボタンを押して、20回のトライアルでタッチタイムを設定します。タッチ実験全体の間にラウンドあたりのタッチ数を同じにしてください。
注:1マイナーサイクルは2つの移動距離に等し、マシンアームが開始位置から終了位置に移動し、開始位置に戻ることを意味します。1つのマイナーサイクルは2つのタッチを生成します。ヘアブラシは20回の試行内で植物に40回触れる(2タッチ×20トライアル=40タッチ)。40タッチは、タッチフォースローディングの1ラウンドであると定義されています。 - メジャー期間ボタンを押して、タッチラウンドの繰り返し間隔を1日あたり480分に設定します。タッチ実験全体の間、タッチラウンドの同じ頻度を維持します。
注:これは、ヘアブラシが1日3ラウンドの植物に触れ、各ラウンド間の間隔時間は480分(8時間)です。表示される青色の数字は、各タッチラウンドの間隔時間を表します。マシンは、下のカウントダウン(赤い数字)が0000に変わると、自動的にタッチの新しいラウンドを開始します。 - メジャーサイクルを12回のトライアルで設定すると、機械は4日間以内に12ラウンドのプラントに自動的に触れます。この 12 の試行の設定は、タッチの日をスキップする人為的なエラーを回避するために使用されます。
- 開始ボタンを押して、あらかじめ設定されたプログラムを開始します。モデルK1タッチマシンは、自動的に設定に応じてタッチフォースロードを実行します。
6. 生理学的データ収集・分析
-
ボルト締めまでの日数: 触れる実験の中で、各プラントのボルト締結日を個別に記録します。ボルト締めは、植物が成長期を栄養相から生殖段階に変化させるシンボルです。アラビドプシスでは、ボルト締結日は、植物が最初の花序の茎の長さが1cmに達するために使用される日数として定義されます。
注:上記の成長条件下では、野生型植物のボルト締めは通常、種子播種後19日から23日に開始し、28-32日で終了します。 -
ロゼット半径:ロゼットの中心から最も長い葉の先端までの距離を測定します。
- 上からトレイ全体の写真を撮ります。対照群とタッチ処理グループの写真を別々に撮ります。
- 適切なソフトウェアをダウンロードします。たとえば、無料でダウンロードしたソフトウェアImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/download.html) を使用します。
- 写真ファイルを開き、ズーム機能を使用して写真を適切なサイズにズームします。
- ロゼットの中心と最も長い葉の先端の間に直線を描画するには、[直線]ツールを選択して、ロゼット半径を測定します。
- 1つのプラントを選択し、左ボタンを押して、ロゼットの中心から最も長い葉の先端に直線を描きます。
- 分析測定機能を選択するか、Ctrl + Mキーを押して線の距離を分析します。
- 1 つのカップを選択し、前の 2 つの手順を繰り返して、各プラスチック カップの直径を同時に分析します。これらのデータを使用して計算を実行し、写真撮影によるバイアスを排除します。
注: 方程式は次のとおりです。
Ra/Da = Rm/Dm
(Ra, 植物の実際のロゼット半径;Da, プラスチックカップの実際の直径;Rm, ソフトウェアによって決定された同じプラントの測定ロゼット半径;Dm、同じ植物を栽培するために使用されるプラスチックカップの測定直径)
-
ロゼット面積:ロゼットの葉の水平2次元表面積を測定します。
- ロゼット器官の残りの部分に影響を与えることなく、花序を削除します。
- 近くに配置されたスケール定規と一緒に各植物の上部から写真を撮ります。
- ImageJ、ロゼットトラッカーの1つの無料プラグインを使用し、以前に公開されたプロトコルに従ってください22.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
自動ヘアタッチフォースローディングマシン
植物の形態変化を観察するためには、再現可能な成長条件と治療方法の両方が反復可能な結果を得るための鍵となります。このハイスループットと自動タッチフォースシグナリング変異スクリーニングは、新たに構築されたヘアタッチフォースローディングマシン、モデルK1(図1、図2)によって達成されます。これらのヘアブラシは、同時に植物の最大4トレイに触れることができます。トレイに24杯入れられ、12カップの植物が対照植物と処理植物の両方として使用されたグループ(図2C,D)。各カップで、4つの植物が栽培され、合計48以下の植物の個体が同じヘアブラシに触れられ、後の統計分析に十分な植物を保証します。植物の最大4つのゲノムタイプは、1つのモデルK1タッチマシンで同時にタッチ処理することができます。チグモルフォジェネシスは用量依存性6、21であるため、重要なポイントの1つは、タッチマシンアーム/ヘアの高さの設定です。植物ロゼット葉の位置に関する異なる髪の位置は、全く異なるチグモルフォジェネシス結果を生成する可能性があり、異なるタッチ力を生成する可能性があります。我々の実験では、毛髪の植物接触先端は、以前に公開されたタッチフォース14に類似した力を生成するカップリム(図2E)よりも0.5cm低く配置されるべきである。タッチパネルに取り付けられたプログラマブルコントローラを使用して、タッチフォースローディングマシン全体を制御します(図2F、材料の表を参照)。
2つの異なるタッチ方法の比較
この自動機械駆動ヘア法を従来の手動綿綿触り法と比較するために、Col-0(図3)で2つの独立した実験を行った。綿棒タッチ群では、12日前の植物から触れ始めた。各ラウンドは40タッチ(1タッチ/s)を持っていました。合計で、毎日3ラウンドが行われました(図3A)。連続綿棒タッチ処理後のボルト締めの遅延は1.7日(22.1±0.2日対23.8±0.2日)を示した。同様に、自動機械駆動ヘアタッチでは、14日前の植物から開始されたタッチフォースローディングと40回のタッチ(3分以内)をラウンドに適用しました。合計で、1日に3回のタッチを正確に8時間間隔で行いました(図3B)。Col-0植物では遅延ボルト締めが認められた。平均ボルト締め時間は23.0±0.3日、モデルK1タッチ機処理プラントのボルト締結時間は24.7±0.2日であった。その結果、コントロール植物とタッチ処理植物の違いを、ユニバリエートCox比例ハザードモデルで解析した。推定ハザード比(HR)0.31(綿棒タッチ)と0.52(機械駆動のヘアタッチ)をそれぞれ提供し(図3C)、触れた群の植物のボルト締めリスク/確率は31%と52%と比較した。それぞれ対照群内の植物。これは、触れた野生型植物のボルト締めの可能性は、綿棒で手動で触れたか、自動ヘアタッチであるかにかかわらず、手つかずの制御植物の場合と比較して約半分であることを示しています。
異なるタッチ変異体の見込み結果
最近の予備データは、MKK1およびMKK2がアラビドプシス14のタッチ応答において重要な役割を果たすかもしれないことを示唆した。これら2つの変異体を選択し、自動毛髪タッチフォースローディングマシンを用いてこれらの接タッチ応答変異体に触れる実験を行った(図4、表1)。野生型制御プラントは、前回の報告14と同様に1.8日のボルト締め遅延(24.1 ±0.3日対25.9±0.2日、図4A)を示したが、このボルト締め遅延はT-DNA挿入変異体、mkk1(24.6 ±0.2)では観察されなかった。 日対 24.4 ± 0.3 日、図 4Bおよび表1) およびmkk2 (23.9 ± 0.1 日対 24.2 ± 0.2 日、図 4Cおよび表1)これらのデータをユニバリアントCox比例ハザードモデルで分析することにより、野生型Col-0のみが、推定HR0.41(図4D)のコントロール植物と触れた植物との間に有意な差を示した。自動ヘアタッチフォースローディングマシンで行われたこれらのタッチフォースローディング実験では、mkk1およびmkk2変異体がタッチ応答変異体であることを実証しました。
その他の形態学的指標の測定
チグモルフォ形成に関連する形態学的変化は、ボルト締めの遅延に限定されない。短い茎と小さなロゼットの葉のサイズの両方もチグモ形態形成6、7、9、14の成分です。そこで、タッチ応答の形態指数、ロゼット半径/葉の長さ、ロゼット(投影)領域に関する2種類の追加測定を報告しました(図5)。以前に観察された表現型の変化と同様に、野生型Col-0植物は、一定かつ反復的な自動機械駆動ヘアタッチ(1.77 ± 0.05 cm対 1.50 ± 0.04)の3日後に有意に小さいロゼット半径と短い葉の長さを示しました。cm、図 5A)。投影されたロゼット面積を、タッチの13日後に20.32 ±0.53 cm2から16.19±0.48cm2に変更した(図5 B)。mkk1とmkk2の両方が同様の減少したロゼット半径および面積を持っていた。これらのデータを組み合わせることで、MKK1およびMKK2タンパク質はアラビドプシスのボルト締め遅延に重要であり、ロゼットサイズとロゼット領域の形成には必要ないことが示されました。
統計分析
図2と図3に示すボックスとウィスカーのプロットと図5に示す列チャートに関しては、統計的有意性は、2つの尾の学生のt検定によって分析され、有意性は***とn.s.で表されます。< 0.001 とp > 0.05 それぞれ。図2および図3に示すカプラン・マイヤープロットでは、バルバリート・コックスハザード分析を用いて、ボルト締結事象23,24に対するタッチ処理の効果を分析した。ハザード比(HR)、95%信頼区間(95%CI)およびp値は、以下の表に示されています。たとえば、HR = 0.5 は、特定の日に、接触したグループ内の植物のボルト締結リスク/確率が対照群のプラントと比較して 0.5 または 50% であることを意味します。
図 1.自動ヘアタッチフォースローディングマシンの構造とパラメータ。(A) 線形アクチュエータの既定の回路図。左上のパネルは横向きのビューで、左下のパネルは後ろ向きのビューです。X軸モジュールとY軸モジュールの全長はそれぞれ843mmと1,038mmです。各デフォルトのX/Yモジュールは、1つのガイドレール、1つのスライドブロック、1つの57ステッパーモーター(プリインストールおよび取り外し可能)で構成されています。カスタマイズされたモデルK1タッチマシンの場合、各X/Yモジュールは2つのスライドブロック(赤色)で構成されています。Xモジュールの接合板は56 mmから100mmに拡大され、より良い接続とサポートを提供します。右上パネルはガイドレールの断面、右下パネルは57ステッピングモータです。(B) 構築された二重X軸および二重Y軸線形アクチュエータの回路図。これは、タッチフォースローディングマシンの主要な部分です。左下パネルは、構築された線形アクチュエータの後景です。左上のパネルは、X軸モジュール(843mm)の横図です。中央パネルはY軸モジュール(1,038mm)の横図です。右上のパネルは、YモジュールとY補助桁上の4つのスライドブロックの背面図です。右下パネルは、Xモジュールのジャンクションプレートの後景です。(C) 機械部品アセンブリのフローチャート。図に異なるパーツがマークされ、名前が付けられています。詳細な組み立てプロセスについては、プロトコルで説明しました。表示されている単位は mm.ここをクリックして、この図のより大きなバージョンを表示してください。
図 2.自動ヘアタッチフォースローディングマシンの全体的なデザイン。(A) 完成したモデルK1タッチマシン。写真は正面から撮影した。上部線形アクチュエータは、水平方向に移動するロボットアームを制御し、下部線形アクチュエータは垂直方向に移動するロボットアームを制御します。(B) 取り外し可能なロボットアームを示す横図。ヘアブラシはロボットアームに締め付けられた。(C および D)人間の毛がブラシが植物に触れる様子を示す写真で、それぞれ前面と横側から撮影した。(E) カップリムに対してヘアブラシの高さを設定する方法を示す横図。機械アームとヘアブラシの両方が見えます。(F) モデルK1タッチマシンの操作インターフェース。タッチパネル(MT6070i)に連動したプログラマブルコントローラ(AFPX-C30T)を使用してマシン全体を制御します。詳細な設定と操作手順については、プロトコルで説明します。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 3.チグモルフォジェネシスに対する2つのタッチ法の効果を比較する。(A-B)自動タッチフォースローディングマシン(B)による手動綿綿タッチ(A)と人間の毛髪タッチの比較。ボックスとウィスカーのプロットが左側のパネルに表示され、コントロールグループとタッチされたグループの平均ボルト日の比較が表示されます。手段±SEが示されている。統計分析は、学生のt検定によって行われました。p < 0.001での有意性は***として示されます。カプラン・マイヤーのプロットは、成長時間(播種後の日数)に対するボルト締結植物の割合である中央に示されています。右のパネルは、ボルト締め時間と花序の茎の高さの違いを示す手つかずのコントロールと触れた植物の代表的な個人を示しています。(C) 集計表:制御列と接触柱の数値は、統計分析に使用されるプラント番号です。ハザード比(HR)、95%信頼区間(95%CI)、およびユニバーサルコックスハザード分析のセクションの下のp値が提供されます。接触群における植物のボルト締めリスクと確率は、それぞれ手つかずの群と比較して31%と52%であった。ユニバーサリーコックスハザード分析はSPSSによって推定された。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 4.mkk1およびmkk2変異体のチグモルフォジェネシスと、自動ヘアタッチによって誘導される野生型植物(Col-0)。(A-C)自動タッチフォースローディングマシンによる人間の毛髪タッチの繰り返しにより生成されたCol-0(A)、mkk1(B)、およびmkk2(C)の将来のタッチ応答。 ボックスとウィスカーのプロットが左側のパネルに表示され、これは対照群とタッチされたグループ間の平均ボルト日の比較です。手段±SEが示されている。統計分析は、学生のt検定によって行われました。*** と n.s. はそれぞれp < 0.001とp > 0.05を表します。カプラン・マイヤーのプロットは、成長期間(播種後の日数)におけるボルト植物の割合である中央に示されています。右側のパネルは、手つかずのコントロールとボルトの違いを示す触れた植物の代表的な個人を示しています。mkk1(B)およびmkk2(C)のデータは、それぞれ2つと3つの生物学的反復からコンパイルされた。 各反復で使用される詳細なプラント番号を表 1に示します。(D) 要約表:制御列とタッチカラムの下の数値は、それぞれこれら2つのグループで使用/分析された植物番号であった。ユニバカリート・コックスハザード分析のセクションの下のHR、95%のCIおよびp値が提供された。接触群中の野生型植物のボルト締結リスク/確率は、対照群と比較して41%である。ユニバーサリーコックスハザード分析はSPSSによって推定された。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 5.チグモルフォジェネシスを定義するためのロゼット半径および面積測定。(A-B)野生型のロゼット半径とロゼット面積をそれぞれ種まき後の17日目及び27日目に測定した。左上のパネルに表示されるバーは、コントロールグループとタッチされたグループの間のロゼット半径またはロゼット領域の比較です。手段±SEが示されている。統計分析は、学生のt検定によって行われました。p < 0.001.右上パネルに表示されている写真は、代表的な個々の植物です。以下の要約表は、対照群で分析されたプラント番号とタッチされたグループを示しています。17日目のロゼット半径(cm)と27日目のロゼット領域(cm2)の両方も示されている。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
表 1.異なる生物学的複製のボルトデータ。要約された表には、mkk1の2つの生物学的反復とmkk2の3つの生物学的反復が含まれています。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
チグモルフォジェネシスは、細胞シグナル伝達と植物ホルモンの作用のネットワークを含む機械的摂動に対する複雑な植物成長応答である。それは望ましくない環境条件の下で生き残るために植物の適応進化の結果である25,26.機械的な接触、特に人間の指のタッチおよび手持ち型綿棒タッチは、以前のチグモ形態遺伝学的研究14、20におけるこの形態学的変化を研究するために選択されている。植物の接触応答をトリガするタッチフォースローディングのこの簡素化されたバージョンは、制御し、適用することが容易です。さらに、このタイプのタッチフォースローディング方法は、自然環境19で生成される風および雨滴滴刺激力信号を何らかの方法で模倣することができる。タッチ力は、カルシウムスパイクを引き起こすことができる、タンパク質リン酸化14および下流遺伝子発現接感タッチ応答19を誘導する。同様に、自動移動アームに取り付けられた人間の毛髪ブラシは、人間の手操作タッチを模倣することによって植物のタッチ応答を生成することもできます。力の適用のタイプを多様化するために、水振りノズルおよび/または風送風機はまた機械のロボット腕に取付けられ、生理学的実験に使用することができる(図2)。独特な特徴は形態遺伝学および生理学的研究の自動機械力のローディング機械をより多目的にする。この自動機械的力のローディングマシンの最大の利点は、おそらくその無労働、反復可能で時間を節約する機能であり、多数の変異型表現型の選択を多数の変異型から選択することを可能にする。人間の手操作された接触の時間とは対照的に、モデルK1の接触機械は同時にさまざまな突然変異体に触れることができ、3〜5分以内に接触のラウンドを完了できる。タッチのラウンドの時間枠は、主に治療の開始時のプログラム設定に依存します。各プラントがラウンドで40回触れる場合、モデルK1マシンは1日以内に3ラウンドのタッチ処理を完了するのに9-15分しか必要とされません。タッチの各ラウンド間の間隔時間を正確に制御することができます。人間がそのような精度を達成する可能性は低い。
タッチ処理に関するもう一つの重要な問題は、植物の成長のどの段階にタッチ力を適用する必要があることです。我々の実践では、これら3つの遺伝子型の成長率が類似しているので、野生のタイプと2つの変異体の両方の種子播種後14日後に触れ始めました。野生のタイプとは開発時間に大きな違いがある変異体の場合、触れるのに別の最初の日を選択できます。複数の比較のために野生型植物と変異体の両方のボルトデータに対して一方通行の分散分析を実行すると、14を助けることができます。この統計分析は、ジェノタイプによって生成されるボルト締め時間の違いに関する適切な結論を提供することができます。この場合、多変量 Cox 比例ハザード解析を使用して、2 つの変数パラメータを考慮する必要があります。
モデルK1タッチマシンに取り付けられた人間の毛のタッチフォースレベルを設定するために、ヘアブラシの高さ(垂直力)と速度(水平力)の両方を調整しました(図2E)。正しい設定は、電子スケールに置かれたアラビドプシス工場の力レベルテストの多くのラウンドから収集された予備データに基づいて決定されました。我々が見つけたように、タッチ応答実験全体を通して髪の高さと速度の両方を変えずに保つことは、アラビドプシスラインの反復間で同様かつ一定のチグモ形態遺伝的表現型を生成します。タッチフォースが重すぎると、速く動く毛ブラシが葉の表面に傷を負う可能性があるため、若い苗を殺す可能性があります。対照的に、タッチフォースが軽すぎると、タッチの繰り返しの2週間以内にボルト締めの遅延を引き起こすには十分でない場合があります。前回の実験では、適切なタッチフォース負荷をタッチ14,19あたり1-2mNと判断しました。カップリムより0.5cm低い髪の長さは、穏やかな水平移動速度5000 mm/min(図2E)でモデルK1マシンベースのヘアタッチで同様の垂直タッチ力を生成するために使用されます。モデルK1マシンのこの固定設定は、ヒューマンエラーに起因する力強度の変動を低減します。
全体的に、自動タッチフォースローディングマシンによって行われるヘアタッチは、植物に平均的なタッチフォース負荷を提供します。適用される正確なタッチフォース、特にロードされた水平方向の力は、単一のヘアまたはブラシ上のヘアのグループのどちらでも計算が困難です。さらに、植物の形状と茎の高さの分散は、水平力の適用を妨げる可能性があります。この種の体力または応力を測定するには、髪や毛のグループにリンクされたより正確な圧力センサーが必要です。今後、より精密な圧力センサや数学的モデリングを応用し、自動タッチフォースローディング機の改良を進める。光強度、土壌の水分、温室の温度、栄養素の供給などの成長条件は、いずれもタッチ応答表現型の発達において重要な役割を果たします。干ばつ、90 μE°m-2°C-1未満の弱い光条件、およびアラビドプシスの正常な成長に影響を与える可能性のある高いまたは低い温度などのストレス条件は、両方の野生タイプのタッチ応答の測定を妨げます。そして変異体。
要するに、この自動タッチフォースローディングマシンは、人間の指のタッチや綿棒のタッチよりも、より省力で均一な平均タッチフォース負荷を提供することができます。モデルK1タッチマシンは、農業作物やおそらくタッチフォースローディングのいくつかの変更を伴う動物モデル間の様々なハイスループットタッチフォースシグナリング変異スクリーニングとタッチ応答分析に適用される予定です。マシン。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者は何も開示していない。
Acknowledgments
この研究は、以下の助成金によって支援されました: 31370315, 31570187, 31870231 (中国国立科学財団), 16100318, 661013, 16101114, 16103615, 16103617, AoE/M-4GC/香港(香港)。著者は、図1に示すいくつかの回路図の提供のためにJu Feng Precisionとオートメーション技術リミテッド(深セン、中国)に感謝したいと思います。
著者はまた、タッチフォースローディングマシンの開発に貢献してくれたS.K.チャンとW.C.リーに感謝したいと思います。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4 hair brushes | customized | ||
| 4 robot arms with one holder | customized | 1000 mm length holder and 560 mm length robot arm | |
| 57 stepper motor | 57HS22-A | ||
| All purpose potting soil | Plantmate, Hong Kong | ||
| Arabidopsis plant seeds | Arabidopsis Biological Resource Centers, Columbus, OH | For arabidopsis seed purchase | |
| BIO-MIX potting substratum | Jiffy Products International BV, the Netherlands | 1000682050 | Two soils were mixed together to grow Arabidopsis. The ratio of All purpos potting soil and BIO-MIX is 1:2 |
| IL 1700 research radiometer | International Light, Newburyport, MA | The light intensity of both full-wavelength and photosynthetic active radiation can be measured. | |
| ImageJ | https://imagej.nih.gov/ij/download.html | Free downloaded software | |
| Ju Feng Precision and Automation Technology Limited | Shenzhen, China | For belt-driven linear actuators and other mechanical modules purchase | |
| Junction plate of the slide block | To fix the Y guide-rail module or Y auxiliary girder onto backs of slide blocks | ||
| Junction plate of the X axis module | customized | To connect the X guide-rail module and X auxiliary girder | |
| Slide block | |||
| WDT4045 X axis guide-rail module | 843 mm, customized | Pre-installed with two slide blocks and one 57 stepper motor | |
| WDT4045 Y axis guide-rail module | 1038 mm, customized | Pre-installed with two slide blocks and one 57 stepper motor | |
| X axis auxiliary girder | 843 mm, customized | Pre-installed with two slide blocks | |
| Y axis auxiliary girder | 1038 mm, customized | Pre-installed with two slide blocks |
References
- Jaffe, M. J. Thigmomorphogenesis: the response of plant growth and development to mechanical stimulation with special reference to Bryonia dioica. Planta. 114, 143-157 (1973).
- Vandenbrink, J. P., Kiss, J. Z., Herranz, R., Medina, F. J. Light and gravity signals synergize in modulating plant development. Frontiers in Plant Science. 5, 563 (2014).
- Hashiguchi, Y., Tasaka, M., Morita, M. T. Mechanism of higher plant gravity sensing. American Journal of Botany. 100, 91-100 (2013).
- Salisbury, F. B. The Flowering Process. , Macmillan. New York. (1963).
- Darwin, C. The Power of Movement in Plants. , Appleton. New York. (1881).
- Chehab, E. W., Eich, E., Braam, J. Thigmomorphogenesis: a complex plant response to mechano-stimulation. Journal of Experimental Botany. 60, 43-56 (2008).
- Telewski, F. W., Jaffe, M. J. Thigmomorphogenesis: anatomical, morphological and mechanical analysis of genetically different sibs of Pinus taeda in response to mechanical perturbation. Physiologia Plantarum. 66, 219-226 (1986).
- Vogel, M. Automatic precision measurements of radial increment in a mature spruce stand and interpretation variants of short term changes in increment values. Allgemeine Forst-und Jagdzeitung. , Germany. (1994).
- Braam, J. In touch: plant responses to mechanical stimuli. New Phytologist. 165, 373-389 (2005).
- Jaffe, M. J., Leopold, A. C., Staples, R. C. Thigmo responses in plants and fungi. American Journal of Botany. 89, 375-382 (2002).
- Telewski, F. W. A unified hypothesis of mechanoperception in plants. American Journal of Botany. 93, 1466-1476 (2006).
- Gutiérrez, R. A., Ewing, R. M., Cherry, J. M., Green, P. J. Identification of unstable transcripts in Arabidopsis by cDNA microarray analysis: rapid decay is associated with a group of touch-and specific clock-controlled genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 11513-11518 (2002).
- Lee, D., Polisensky, D. H., Braam, J. Genome-wide identification of touch-and darkness-regulated Arabidopsis genes: a focus on calmodulin-like and XTH genes. New Phytologist. 165, 429-444 (2005).
- Wang, K., et al. Quantitative and functional posttranslational modification proteomics reveals that TREPH1 plays a role in plant touch-delayed bolting. Proceedings of the National Academy of Sciences United States of America. 115, 10265-10274 (2018).
- Hamilton, E. S., Schlegel, A. M., Haswell, E. S. United in diversity: mechanosensitive ion channels in plants. Annual Review of Plant Biology. 66, 113-137 (2015).
- Knight, M. R., Campbell, A. K., Smith, S. M., Trewavas, A. J. Transgenic plant aequorin reports the effects of touch and cold-shock and elicitors on cytoplasmic calcium. Nature. 352, 524 (1991).
- Toyota, M., Furuichi, T., Tatsumi, H., Sokabe, M. Cytoplasmic calcium increases in response to changes in the gravity vector in hypocotyls and petioles of Arabidopsis seedlings. Plant Physiology. 146, 505-514 (2008).
- Knight, M. R., Smith, S. M., Trewavas, A. J. Wind-induced plant motion immediately increases cytosolic calcium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89, 4967-4971 (1992).
- Braam, J., Davis, R. W. Rain-, wind-, and touch-induced expression of calmodulin and calmodulin-related genes in Arabidopsis. Cell. 60, 357-364 (1990).
- Chehab, E. W., Yao, C., Henderson, Z., Kim, S., Braam, J. Arabidopsis touch-induced morphogenesis is jasmonate mediated and protects against pests. Current Biology. 22, 701-706 (2012).
- Telewski, F. W., Pruyn, M. L. Thigmomorphogenesis: a dose response to flexing in Ulmus americana seedlings. Tree Physiology. 18, 65-68 (1998).
- De Vylder, J., Vandenbussche, F. J., Hu, Y., Philips, W., Van Der Straeten, D. Rosette tracker: an open source image analysis tool for automatic quantification of genotype effects. Plant Physiology. , (2012).
- Clark, T., Bradburn, M., Love, S., Altman, D. Survival analysis part I: basic concepts and first analyses. British Journal of Cancer. 89, 232 (2003).
- Bradburn, M. J., Clark, T. G., Love, S., Altman, D. Survival analysis part II: multivariate data analysis–an introduction to concepts and methods. British Journal of Cancer. 89, 431 (2003).
- Jaffe, M., Forbes, S. Thigmomorphogenesis: the effect of mechanical perturbation on plants. Plant Growth Regulation. 12, 313-324 (1993).
- Kutschera, U., Niklas, K. J. Evolutionary plant physiology: Charles Darwin’s forgotten synthesis. Naturwissenschaften. 96, 1339 (2009).
