Summary
En skonsam lastmaskin är byggd av människohår borstar, robotarmar och en Controller. Hårborstarna drivs av robotarmar installerade på maskinen och flytta regelbundet för att tillämpa touch-Force på växter. Styrkan i maskin-driven hår berör är jämförbar med den manuellt applicerade Detaljer.
Abstract
Växter som svarar på både intracellulära och extracellulära mekaniska stimuleringar (eller kraft signaler) och utveckla speciella morfologiska förändringar, en som kallas thigmomorphogenesis. Under de senaste decennierna har flera signaleringskomponenter identifierats och rapporterats för att vara involverade i mechanotransduction (t. ex. kalcium jonbindning proteiner och bildar Acid biosyntes enzymer). Men den relativt långsamma forsknings takten i studiet av Force signalering eller thigmomorphogenesis tillskrivs till stor del två skäl: kravet på mödosam mänsklig hand manipulerade touch induktion av tigmomorphogenesis och Force Strength fel förknippas med människors hand-touch. För att öka effektiviteten av yttre kraft lastning på en växtorganism, en automatisk touch-Force lastning maskin byggdes. Denna robot arm-driven hårborste berör ger en arbetsbesparande och lätt upprepningsbara touch-Force simulering, obegränsade rundor av touch upprepning och justerbar touch styrka. Detta hår touch-Force lastning maskin kan användas för både storskalig screening av touch-Force signalering mutanter och phenomics studie av växten tigmomorphogenesis. Dessutom, beröring material som människohår, kan ersättas med andra naturliga material som djurhår, silkestrådar och bomullsfibrer. Den automatiserade rörliga armar på maskinen kan utrustas med vattenstänk munstycken och luftblåsare för att efterlikna de naturliga krafterna av regndroppar och vind, respektive. Genom att använda denna automatiska hår touch-Force lastning maskin i kombination med hand-framförd bomullspinne röra, har vi undersökt touch svar av två Force signalering mutanter, MAP kinase kinase 1 (MKK1) och MKK2 växter . Phenomes av de laddade Wild typ växterna för handlag-Force och två mutanter utvärderades statistiskt. De har uppvisat betydande skillnader i beröring svar.
Introduction
Plant thigmomorphogenesis är en term som myntades av Jaffe, MJ i 19731. Det är en växt tropism men skiljer sig från den välkända phototropism eller gravitropism orsakad av stimuli av solljus eller gravitation2,3. Den beskriver fenotypiska förändringar i samband med periodiska mekaniska stimuleringar, som ofta har observerats av botanister i tidigare tider4,5. Regndroppar, vind, växt, djur och mänskliga berör, även djurbett, anses alla vara olika typer av Mechano-stimuli som utlöser kraft signalering i växter4,5. Egenskaper hos växten tigmomorphogenesis inkluderar förseningen av bultning, en kortare stam, mindre Rosette/bladstorlek i örtartade växter, och tjockare stam i vedartade växter6,7,8. Detta är till skillnad från den thigmonastic eller thigmotropic svar som ofta finns i Mimosa växten eller andra Mechano-känsliga vinstockar, där dessa snabba beröring svar är lättare att observeras1,9,10. Tigmomorphogenesis, å andra sidan, är relativt svårt att observeras på grund av dess långsamma tillväxt svar. Tigmomorphogenesis observeras vanligtvis efter veckor eller till och med år av kontinuerlig kraft lastning stimulering. Denna unika karaktär av växt beröring svar gör det svårt att utföra en framåt genetisk skärm med hjälp av mänsklig hand touch stimulering för att isolera touch-Force signal resistenta mutanter på ett robust sätt.
För att belysa kraften signal signaltransduktion vägar och de molekylära mekanismerna bakom thigmomorphogenesis6,11, molekylära och cellulära biologiska experiment har utförts under de senaste6, 12,13,14. Dessa studier har föreslagit att VÄXTKRAFTEN signal receptorer består huvudsakligen av mechanosensitive jonkanaler (MSC) och tjudrad MSC komplex består av multimeric komplex av membran-Spanning proteiner11,14 , 15. cytoplasmiska ca2 + övergående Spike genereras inom några sekunder efter den första beröring. Vind-, regn-, eller gravi-stimulering kan interagera med nedströms kalcium sensorer för att transduce kraften signaler till nukleära händelser14,16,17,18. Förutom molekylära och cellulära studier, den främre genetiska skärmen med manuell finger beröring av växter har funnit att fytohormoner och sekundära metaboliter är inblandade i den därav beröring-inducerbara (TCH) genuttryck efter Tryck-kraft lastning13,19. För exempel, AOS och opr320 mutanter har identifierats hittills från genetiska studier. Emellertid, det stora problemet i samband med tillämpningen av den framåt genetik i studien av tigmomorphogenesis är fortfarande den intensiva arbete som krävs för att kvantitera nivån på beröring svar och röra en stor population av genetiskt muterade enskilda anläggningar. Den tidskrävande frågan kvarstår också i handen beröring-baserade Mutant skärm14,20. För ett exempel, för att slutföra en omgång av touch-Force stimulering, en person behöver röra 30-60 gånger (en tryckning per sekund) på en enskild anläggning. För att få tillräckligt många växter för statistisk analys av fenotyp, krävs normalt 20-50 enskilda plantor av samma genotyp för den berörande belastnings processen. Denna touch-Force lastning regim innebär att en person behöver upprepade utföra 600-3000 berör en genotyp av val. Denna typ av beröring normalt måste upprepas 3 till 5 rundor om dagen, vilket motsvarar ungefär 1800-15000 finger eller bomullspinne berör per dag per genotyp av växter. En välutbildad person är normalt krävs för att bibehålla styrkan och kraften i flera inslag inom ett önskvärt intervall under många omgångar av upprepning på en dag för att undvika den stora variationen i kraft och styrka. Eftersom det är välkänt att tigmomorphogenesis är en mättningsbar och dosberoende process6,21, touch Force/Strength blir kritisk till en framgång i utlösande beröring svar av en anläggning.
För att ta bort den person beroende touch-Force lastning och för att bibehålla mekanisk tillämpning inom ett godtagbart fel område14, vi konstruerade därför en automatisk touch-Force lastning maskin för att ersätta de handmanipulerade berör. Maskinen har 4 rörliga armar byggda, som var och en är utrustad med en mänsklig hårborste. Denna version heter Model K1 för att specificera dess funktion av människohår touch-Force lastning. Om 4 genotyper mäts kvantitativt för sin tigmomorphogenesis eller beröring svar under en maskin, 40-48 individer per genotyp kan mätas. Varje omgång av touch upprepning (mindre än 60 gånger per planta) varar mindre än 5 minuter med en rörlig hastighet justerbar robotarm. Sålunda, växter på en modell K1 touch maskin kan mekaniskt stimuleras för flera omgångar om dagen antingen med en konstant touch-Force lastning eller olika nivåer av styrkor som initialt programmerade.
Arabidopsis thaliana, en modell växtorganism, valdes därför som mål växtarter för att testa den helautomatiska hår touch-Force lastning maskin ansökan. Eftersom det finns flera stora fröbanker tillgängliga för att hämta de olika arvsmassa av mutanter och storleken på blomningen, passar Arabidopsis väl till det utrymme som finns i tillväxt hylla monterad med modellen K1 touch maskin.
Modell K1 automatisk touch maskin består av tre huvudkomponenter: (1) H-form metall rack består av två remdrivna linjära manöverdon, (2) Robotic metall armar utrustade med hårborstar, och (3) en styrenhet. För en anpassad modell K1 touch maskin, varje X/Y Axelmodul består av en bälte-driven guide-Rail, två glid block (röd) och 1 57 stegmotor (förinstallerade och demonteras) (figur 1a,B). Det övre horisontella ställdon gör det möjligt för robot metall armen att flytta vänster och höger horisontellt, det undre vertikala remdrivna linjära ställdon gör det möjligt för robot metall armen att röra sig uppåt och nedåt vertikalt (figur 1B, figur 2A ). Fyra demonteras robotarmar installerades på det vertikala manöverdonet (figur 1C, figur 2B). Fyra människohår borstar var bundna till fyra robotarmar, respektive (figur 1C, figur 2B). Alla mekaniska delar att konstruera modellen K1 touch Machine i fetstil teckensnitt nedan är markerade i figur 1C (se även tabellen av material).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. beredning av utsäde
Obs: Arabidopsis frön av både vildtyp (Col-0) samt mkk1 och mkk2 förlust av funktion mutanter som används köptes från ARABIDOPSIS biologiska Resource Center (ABRC, https://www.Arabidopsis.org, Columbus, OH).
- Beräkna hur många växt individer av varje genotyp kommer att användas för en tillförlitlig statistisk analys. Förbered ett tillräckligt antal frön baserat på grobarheten för varje rad, vanligtvis 4-5 gånger mer än vad som behövs för ett experiment. Se till att tillräckligt många friska och enhetliga stora växter kan användas för touch Response assay. Enligt detta protokoll, 300-500 frön per genotyp vanligtvis används för att producera 80-90 plantor av liknande storlek.
- Sänk ner frön i kallt vatten och förvara dem i 4 ° c (täckt med aluminiumfolie för att hålla i mörker) för utsäde imbibition. Sugga fröna 5-7 dagar efter imbibitionen.
2. växternas tillväxt
- Välj lämplig jord för växternas tillväxt (se tabell över material). Undvik stora klumpar och blanda dem homously.
- Förbered 24 plastkoppar: anläggningen kapacitet är 207 mL och den övre fälgens diameter är 7,4 cm. borra tre runda hål i botten av en kopp för bevattning ändamål.
- Fyll dessa plastkoppar med blandad jord. Låt jorden staplas upp till 1-2 cm högre än koppen fälg och platta ytan av staplade jord mjukt.
- Överför 24 koppar till en plastbricka (21 inches x 10,8 inches x 2,5 inches) och placera facket under konstant ljusförhållanden (se nedan).
- Tillsätt 2,5 liter vatten i varje bricka två timmar före utsädessådd. Låt jorden att absorbera vattnet från hålen ligger vid bottnarna i koppar och vänta på ytan av jorden att sjunka till koppen RIM nivå.
- SOW 3-4 frön till en enda fläck, och 4 jämnt fördelade platser i en kopp.
- Placera ett genomskinligt plasthölje ovanför varje bricka och låt fröna gro i en vecka. Ta sedan bort locket och låt plantor att växa för en annan vecka.
- Ta bort extra växter genom gallring och hålla 4 växt individer av liknande storlek i varje kopp 9-10 dagar efter utsäde sådd.
- Bevattna växter med 1,5 L vatten varannan dag efter fröna gro.
3. tillväxtvillkor
- Ställ in temperaturen i tillväxt kammaren vid 23,5 ± 1,5 ° c och luftfuktighet mellan 35 och 45%.
- Ställ in ljusintensiteten mellan 180 och 240 μE ∙ m-2∙ s-1 (mätt med Il 1700 Research radiometer, internationellt ljus)14. Den photosynthetic aktiv utstrålningen är från 90 till 120 μE ∙ m-2∙ s-1.
- Ställ in ljus villkoret till 24 h konstant.
4. byggandet av touch-Force lastning maskin
Obs: detta Robotic hår touch-Force lastning maskin (modell K1) är utformad för att tjäna ändamål både Touch-Force signalering Mutant screening och plantera thigmomorphogenesis generation (figur 1, figur 2).
- Moduler före installation (demonteras, figur 1C)
- Installera två glid block (I) och en 57 stegmotor (II) på X/Y-Axelledaren-Rail module (III/V).
- Installera två glid block (i) på X/Y-axelns hjälp balk (IV/vi).
- Installation av andra mekaniska delar (figur 1C)
- Fäst X-axelstyrningsmodulen (III) och x-axelhjälparbalk (IV) tillsammans genom att montera två kopplings plåtar (VII) i vardera änden av styrskenan.
- Fäst Y-axelledaren-Rail module (V) på dorsala av två glid block (X-axeln) i en korsning position genom att montera två kopplingsplattor (VIII) däremellan.
- Fäst Y-axelns hjälp balk (vi) på dorsala av de andra två glid blocken (X-axeln) i ett korsnings läge genom att montera två kopplings plåtar (VIII) däremellan.
- Montera hållaren av robotarmar (IX) på framsidan av två glid block (Y-axeln) i ett korsnings läge med en kopplingsplatta (figur 2a).
- Montera 4 hårborstar (X) på robotarmar (IX) med klämmor (figur 2B).
5. Tryck-Force lastning Maskininställning
Obs: alla styrande parametrar för att ställa in modell K1 touch Machine i fetstil teckensnitt nedan visas i Kontrollpanelen (figur 2F).
- Installera touch Hair borstar på robot armarna. Använd en 330 mm lång stållinjal som hållare för att fixera ett lager av människohår (3600-4600 hårstrån/borste) jämnt. Längden på håret är 126 mm (figur 1C).
- Fix dessa stål linjaler på robotarmar med två metallklämmor.
- Ställ in höjden på maskin armarna längs den vertikala dimensionen (Y-axeln) först. Tryck JOG F + för att höja och jogga R- för att sänka robotarmar och borstar. Låt spetsen på håret borstar 0,5 cm lägre än koppen fälg. Tryck på nollset. Pre-Run maskinen 1-2 cykler för att se till att alla växt personer vidrörs. Justera och kalibrera borstar och hårtips till samma höjd varje dag under hela den berörande perioden.
- Använd en elektronisk skala för att mäta touch Force (vertikal belastning) och bibehålla touch Force-nivån vid 1-2 mN14.
- Ställ in startpositionen för maskin armarna längs den vågräta dimensionen (X-axeln) manuellt. Låt hårborstarna hänga i kanten på varje bricka och se till att ingen planta vidrörs innan det berörande experimentet startar. Tryck på JOG F +/JOG R- för att flytta maskin armen horisontellt lite i liten riktning för att ställa in startpositionen.
- Ställ hårborsten på distans i horisontal dimensionen (X-axeln) till 365 mm genom att trycka på Travel -knappen. Tryck på Inc. F +/Inc. R- för att flytta maskin armarna för att få ett fullständigt res avstånd och se till att alla behandlade växter vidrörs under hela det berörande experimentet.
- Ställ in förflyttningshastigheten längs X-axeln på maskin armarna med 5 000 mm/min genom att trycka på Auto Speed -knappen. Behåll samma rörelsehastighet under hela det berörande experimentet.
- Ställ in tryck tiden vid 20 försök genom att trycka på knappen för mindre cykel . Behåll samma antal tryckningar per runda under hela det berörande experimentet.
Obs: en mindre cykel är lika med två färd sträckor, vilket innebär att maskin armarna flyttas från startpositionen till ändläget och sedan tillbaka till startpositionen. En mindre cykel genererar två tryckningar. Hårborstar touch växter 40 gånger inom 20 prövningar (2 berör x 20 prövningar = 40 berör). Den 40-touch är definierad som en runda av touch-Force lastning. - Ställ in repetitionsintervallet för touch-rundan på 480 min per dag genom att trycka på knappen för större period . Behåll samma frekvens av touch-rundor under ett helt gripande experiment.
Obs: Detta gör hårborstar att beröra växter för 3 rundor om dagen, och intervalltiden mellan varje omgång är 480 min (8 h). Det blå talet som visas står för intervalltiden för varje touch-runda. Maskinen startar en ny runda automatiskt när nedräkningen nedan (röd siffra) ändras till 0000. - Ställ in den stora cykeln vid 12 prövningar, vilket innebär att maskinen kommer att beröra anläggningar för 12 rundor inom en period av 4 dagar automatiskt. Denna inställning av 12 prövningar används för att undvika mänskliga fel i hoppar över en dag av beröring.
- Tryck på Start -knappen för att initiera det förinställda programmet. Modell K1 touch maskin kommer automatiskt att utföra beröring kraft lastning enligt inställningar.
6. insamling och analys av fysiologiska data
-
Dagar till bultning: spela in bultning dag varje planta individuellt inom ett gripande experiment. Bultning är en symbol som en växt förändrar sin tillväxtskede från vegetativa fasen till fortplantnings fasen. I Arabidopsis, den bultning dag definieras som antalet dagar som används av en anläggning för att få sin första blomställning stammen når 1 cm i längd.
Anmärkning: enligt tillväxtvillkor som beskrivs ovan, bultning av vilda typ växter initierar normalt från 19 till 23 dagar efter utsäde sådd och slutar vid 28-32 dagar. -
Rosett radie: Mät avståndet från rosetten centrum till spetsen av den längsta blad.
- Ta bilder av hela facket från toppen. Ta bilder av kontrollgruppen och den touch-behandlade gruppen separat.
- Ladda ner lämplig programvara. Använd den gratis nedladdade programvaran imagej (https://imagej.NIH.gov/IJ/Download.html) till exempel.
- Öppna en fotofil, Använd zoomfunktionen för att zooma in fotot till en lämplig storlek.
- Välj det raka verktyget för att rita en rät linje mellan rosett centrum och spetsen på ett längsta blad för att mäta rosett radie.
- Välj en anläggning och tryck på den vänstra knappen för att rita en rät linje från rosett centrum till den längsta löv spetsen.
- Välj funktionen analysera-mått eller tryck på CTRL + M för att analysera radavståndet.
- Välj en kopp och upprepa de föregående två stegen för att analysera diametern på varje plastmugg på samma gång. Använd dessa data för att utföra beräkningen för att eliminera bias till följd av fotografering.
Anmärkning: ekvationen är:
Ra/da = rm/dm
(Ra, den faktiska rosett radien av en anläggning; Da, den faktiska diametern av plast kopp; Rm, den uppmätta rosett radie av samma anläggning bestäms av en programvara; Dm, den uppmätta diametern på plast koppen som används för odling av samma planta)
-
Rosett område: Mät den horisontella 2-dimensionell yta av rosett blad.
- Ta bort Blomställningen utan att påverka resten av rosett organ.
- Ta bilder från toppen av varje planta tillsammans med en skallinjal placerad i närheten.
- Använd en gratis plugin av imagej, Rosette Tracker och följ protokollet publicerades tidigare22.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den automatiska hår touch-Force lastning maskin
För observation av morfologiska förändringar på växter, både reproducerbara tillväxtförhållanden och behandlingsmetoder är nyckeln till att få repeterbara resultat. Denna höga genomströmning och automatisk touch-Force signalering Mutant screening uppnås genom den nybyggda hår touch-Force lastning maskin, modell K1 (figur 1, figur 2). Dessa hårborstar kan röra högst 4 brickor av växter samtidigt. Det fanns 24 koppar placerade i en bricka, och 12 koppar växter i en grupp som används som både kontroll och de behandlade växterna (figur 2C, D). I varje kopp, fyra växter odlades och totalt 48 eller mindre växt individer berördes av samma hårborste, som garanterar tillräckligt med växter för senare statistisk analys. Högst 4 genotyper av växter kan touch-behandlas samtidigt på en modell K1 touch maskin. En av de viktigaste punkterna är inställningen av touch Machine arm/hår höjd eftersom tigmomorphogenesis är dosberoende6,21. Olika hår positioner med avseende på anläggningen rosett Leaf position generera olika touch styrkor, som kan generera helt olika tigmomorphogenesis resultat. I våra experiment, den växt-kontakt spetsen av hårstrån bör placeras 0,5 cm lägre än koppen fälg (figur 2E), som genererar krafter som liknar den tidigare publicerade touch Force14. En programmerbar styrenhet installeras i en TouchPanel används för att styra hela touch-Force lastning maskin (figur 2F, se tabell över material).
Jämförelsen av två olika pekmetoder
För att jämföra denna automatiska maskin-driven hår metod med konventionella manuellt bomullspinne röra metod, två oberoende experiment utfördes på Col-0 (figur 3). I Cotton bomullstuss touch Group, beröring började från 12-dagars gamla växter. Varje omgång hade 40 inslag (1 touch/s). Totalt genomfördes 3 omgångar varje dag (figur 3a). Det visade 1,7 dagar av fördröjning i bultning efter en kontinuerlig bomullspinne beröring behandling (22,1 ± 0,2 dagar vs. 23,8 ± 0,2 dagar). Likaså för automatisk maskin-driven hår beröring, touch-Force lastning initieras från 14-dagars gamla anläggningar och 40 tider av beröring (inom 3 min) tillämpades för en runda. Totalt genomfördes 3 omgångar av tryckningar en dag med exakt 8 timmars intervall (figur 3B). Fördröjd bultning observerades för Col-0 växter. Den genomsnittliga bulttiden var 23,0 ± 0,3 dagar, medan bulttiden för modellen K1 touch maskinbehandlade växter var 24,7 ± 0,2 dagar. Skillnaderna mellan kontroll-och pekbehandlade växter analyserades följaktligen med modellen med univariat Cox proportionella risk. Det erbjöd den uppskattade hazard ratio (HR) av 0,31 (bomullstuss touch) och 0,52 (maskin-driven Hair touch), respektive (figur 3C), vilket innebär att bultning risk/sannolikhet för växter i den berörda gruppen är 31% och 52% jämfört med respektive anläggningar i kontrollgruppen. Detta indikerar att möjligheten av att bulta av de rörda Wild typ växterna är runt om halva, som jämförde till det av de orörda kontroll växterna, oavsett huruvida det är den manuella kontakten med en bomullspinne eller den automatiserade hårhandlag.
De prospektiva resultaten på olika touch mutanter
Senaste preliminära uppgifter föreslog att MKK1 och MKK2 kan spela en viktig roll i beröring svar Arabidopsis14. Vi valde dessa två mutanter och genomförde touch experiment på dessa förmodade touch svar mutanter med hjälp av automatisk hår touch-Force lastning maskin (figur 4, tabell 1). De vilda typkontroll anläggningarna visade 1,8 dagars bultfördröjning (24,1 ± 0,3 dagar jämfört med 25,9 ± 0,2 dagar, figur 4A) precis som den föregående rapporten14 medan denna fördröjnings fördröjning inte observerades på T-DNA insertionsmutationer Mutants, mkk1 (24,6 ± 0,2 dagar jämfört med 24,4 ± 0,3 dagar, figur 4B och tabell 1) och mkk2 (23,9 ± 0,1 dagar jämfört med 24,2 ± 0,2 dagar, figur 4C och tabell 1). Genom att analysera dessa data med univariat Cox proportionella-farliga modell uppvisade endast Wild Type Col-0 en signifikant skillnad mellan kontroll och vidrörda växter med en uppskattad HR på 0,41 (figur 4D). Dessa touch-Force lastning experiment som utförs av den automatiska hår touch-Force lastning maskin visade att mkk1 och mkk2 mutanter är beröring svar mutanter.
Mätningen av andra morfologiska index
Morfologiska förändringar i samband med tigmomorphogenesis är inte begränsade till att fördröja bultning. Både kortare stam och mindre rosett bladstorlek är också komponenterna i thigmomorphogenesis6,7,9,14. Därför rapporterade vi här två ytterligare typer av mätningar på morfologiska index av beröring svar, rosett radie/blad längd och rosett (projicerade) område (figur 5). Liknar den tidigare observerade fenotyp förändringen, den vilda typ Col-0 växten visade betydligt mindre rosett radie och kortare löv längd efter 3 dagar av konstant och repetitiva automatisk maskindriven hår beröring (1,77 ± 0,05 cm vs. 1,50 ± 0,04 cm, figur 5A). Den projicerade rosett området ändrades från 20,32 ± 0,53 cm2 till 16,19 ± 0,48 cm2 efter 13 dagars beröring (figur 5B). Både mkk1 och mkk2 hade liknande reducerad rosett radie och område. Sammantaget visade dessa data att MKK1 och MKK2 proteiner är viktiga för den fördröjnings fördröjning Arabidopsis och inte krävs för att forma rosetten storlek och rosett område.
Statistisk analys
När det gäller de fält och morrhår-diagram som visas i figur 2 och figur 3 och de stapeldiagram som visas i figur 5, analyserades den statistiska signifikansen av Students tvåsidiga t-test, med en signifikans som representeras av * * * och < 0,001 respektive p > 0,05. För Kaplan-Meier-områdena som visas i figur 2 och figur 3användes en univariat Cox-riskanalys för att analysera effekten av beröring behandling på bultning händelsen23,24. Riskkvoten (HR), 95% konfidensintervall (95% CI) och p -värde erbjuds i tabellerna nedan. Till exempel, HR = 0,5 innebär att på en viss dag, var bultning risk/sannolikhet för växter i den berörda gruppen 0,5 eller 50% jämfört med dessa anläggningar i kontrollgruppen.
Figur 1 . Konstruktionen och parametrarna för den automatiska hår touch-Force lastning maskin. (A) standardscheman för det linjära ställdonet. Den övre vänstra panelen är den laterala vyn och den nedre vänstra panelen är den dorsala vyn. X-axelmodulens och Y-axelmodulens totala längder är 843 mm respektive 1 038 mm. Varje standard X/Y modul består av en guide-Rail, en Slide block och 1 57 stegmotor (förinstallerade och demonteras). För en anpassad modell K1 touch maskin, varje X/Y-modul består av två bildblock (röd). Kopplingsplattan på X-modulen förstoras från 56 mm till 100 mm för att ge bättre anslutning och stöd. Den övre högra panelen är tvärsnittet av styrskenan och den nedre högra panelen är 57 stepper motor. (B) schematiska av den konstruerade dubbel X-axeln och dubbla Y-axelns linjära manöverdon. Detta är den största delen av touch-Force lastning maskin. Den nedre vänstra panelen är dorsala syn på konstruerade linjära manöverdon. Den övre vänstra panelen är den laterala vyn av X-axelmodulen (843 mm). Mittpanelen är den laterala vyn av Y-axelmodulen (1 038 mm). Den övre högra panelen är den dorsala bild av 4 bildblock på Y-modulen och Y extra balk. Den nedre högra panelen är den dorsala bild av kopplingsplattan på X-modulen. (C) flödesschemat för maskin dels montering. Olika delar markeras och namnges i figuren. Detaljerade monteringsprocesser beskrevs i protokollet. Enheten som visas är denna siffra är mm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 . Den övergripande utformningen av den automatiska hår touch-Force lastning maskin. (A) den färdiga modellen K1 touch Machine. Fotot togs från framsidan. Den övre linjära ställdon styr robotarmen rör sig horisontellt och den nedre linjära ställdon styr robotarmen rör sig vertikalt. (B) den laterala vyn visar demonteras robotarmar. Hårborstar kläms fast på robot armarna. (C och D) Bilder som visar hur hårstrån borstar röra växterna, som togs från framsidan och den laterala sidan, respektive. (E) den laterala vyn visar hur du ställer in höjden på hårborsten mot koppen kanten. Både maskin armarna och hårborstarna är synliga. Fmanöver gränssnittet för modell K1-pekmaskinen. En programmerbar styrenhet (AFPX-C30T) kopplad till en TouchPanel (MT6070i) används för att styra hela maskinen. Detaljerade inställningar och drifts procedurer beskrivs i protokollet. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 . Jämföra effekterna av två touch metoder på thigmomorphogenesis. (A-B) jämförelsen av manuell bomullstuss touch (a) och människohår beröring drivs av den automatiska touch-Force lastning maskin (B), respektive. Box och morrhår tomter visas i den vänstra panelen, som visar jämförelsen av genomsnittlig bultning dag mellan kontrollgruppen och den berörda gruppen. Medel ± SE visas. Statistisk analys utfördes av en students t-test. Signifikans vid p < 0,001 visas som * * *. Kaplan-Meier tomter visas i mitten, som är andelen bultning växter över tillväxt tiden (dagar efter sådd). Den högra panelen visar representativa individer av orörda kontroll och rörde växter som visar skillnaden i bultning tid och Blomställning Stem höjd. Cden sammanfattande tabellen: siffer numren i kontroll-och rörkolonnerna är det växt nummer som används för statistisk analys. Riskkvoten (HR), 95% konfidensintervall (95% KI) och p -värde under avsnittet av univariat Cox Hazard analys erbjuds. Bultning risken och sannolikheten för växter i den berörda gruppen var 31% och 52% jämfört med den orörda gruppen, respektive. Riskanalysen för univariat Cox uppskattades av SPSS. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 . Den thigmomorphogenesis av mkk1 och mkk2 mutanter samt den vilda typ växten (Col-0) induceras av den automatiska hår beröring. (A-C) den blivande beröring svar Col-0 (A), mkk1 (B), och mkk2 (C) genereras genom upprepning av mänskliga hår berör drivs av den automatiska touch-Force lastning maskin. Box och morrhår tomter visas i den vänstra panelen, som är en jämförelse av genomsnittlig bultning dag mellan kontrollgruppen och den berörda gruppen. Medel ± SE visas. Statistisk analys utfördes av en students t-test. * * * Och ns motsvarar p < 0,001 respektive p > 0,05. Kaplan-Meier tomter visas i mitten, som är andelen bultning växter under tillväxtperioden (dagar efter sådd). Den högra panelen visar representativa individer av den orörda kontrollen och de berörda växterna som visar bultning skillnaden. Data för mkk1 (B) och mkk2 (C) sammanställdes från två respektive tre biologiska replikat. Detaljerade växt nummer som används i varje replikat visades i tabell 1. Dden summerade tabellen: siffrorna under kontroll och pekkolonner var det växt nummer som användes/analyserades i dessa två grupper respektive. Den HR, 95% CI och p värde under avsnittet av univariat Cox faroanalys erbjöds. Bultrisk/sannolikhet för vilda typ växter i den berörda gruppen är 41% jämfört med kontrollgruppen. Riskanalysen för univariat Cox uppskattades av SPSS. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5 . Den rosett radie och områdes mätning för att definiera thigmomorphogenesis. (A-B) rosett radie och rosett område av vildtyp mättes vid dag 17 och dag 27 efter frö utsäde, respektive. Staplar som visas i den övre vänstra panelen är jämförelser av antingen rosett radie eller rosett område mellan kontrollgruppen och berörd grupp, respektive. Medel ± SE visas. Statistisk analys utfördes av Students t-test; p < 0,001. Bilder som visas i den övre högra panelen är representativa enskilda växter. De summerade tabellerna nedan visar växt numret som analyserades i kontrollgruppen och den berörde gruppen. Både rosett radie (cm) på dag 17 och rosett område (cm2) på dag 27 visas också. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Tabell 1. Bultning data av olika biologiska replikat. Den summerade tabellen innehåller två biologiska replikat av mkk1 och tre biologiska replikat av mkk2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Thigmomorphogenesis är en komplex växttillväxt svar mot mekaniska störningar, som innebär ett nätverk av cellulära signalering och åtgärder av fytohormoner. Det är en följd av adaptiv evolution av växter för att överleva under de oönskade miljöförhållandena25,26. Mekanisk beröring, särskilt mänskliga finger beröring och handhållna bomullspinne touch, har valts för att studera denna morfologiska förändringar i tidigare tigmomorfogenetiska studier14,20. Denna förenklade version av touch-Force lastning för att utlösa anläggningen beröring svar är lättare att kontrollera och tillämpa. Dessutom kan denna typ av touch-Force lastning metod på något sätt efterlikna vind-och regn Drop-stimulerade kraft signaler som produceras i den naturliga miljön19. Touch Force kan utlösa kalcium spikar, inducera proteinfosforylering14 och nedströms genuttrycket förmedlar touch Response19. Likaså, mänskliga hårborstar monterade på automatiserade rörliga armar kan också generera anläggningen beröring svar genom att imitera den mänskliga handmanipulerade berör. För att diversifiera olika typer av kraft användning kan vattenstänk munstycken och/eller blåsmaskiner även monteras på maskinens robotarmar och användas för ett fysiologiskt experiment (figur 2). Den unika funktionen gör automatisk mekanisk kraft lastning maskin mer mångsidig i morfogenetiska och fysiologiska studier. Den största fördelen med denna automatiska mekaniska-Force lastning maskin är förmodligen dess arbetsfria, repeterbara och tidsbesparande funktion, vilket gör det möjligt att utföra en specifik Mutant fenotyp urval från ett stort antal mutagenized individer. I motsats till timmar av mänsklig handmanipulerade handen, kan modellen K1 touch Machine röra olika mutanter samtidigt och slutföra en runda av beröring inom 3 till 5 min. Tidsramen för en runda av beröring beror till stor del på programinställningen i början av behandlingen. Om varje enskild anläggning skulle vidröras 40 gånger i en runda, modell K1 maskinen skulle bara behöva 9-15 min för att avsluta tre omgångar av beröring behandling inom en dag. Intervalltiden mellan varje omgång av tryckningar kan kontrolleras exakt; Det är mindre sannolikt för människor att uppnå en sådan precision.
En annan viktig fråga om touch-behandling är vilket skede av växternas tillväxt touch Force behöver appliceras på. I vår praktik, beröring började 14 dagar efter utsäde sådd för både vild typ och två mutanter som tillväxttakten för dessa tre genotyper är likartade. För de mutanter som har en betydande skillnad i utvecklingstid från vildtyp, kan man välja en annan initial dag för att starta beröring. Att utföra enkelriktad ANOVA-test på bultdata av både vild typ växt och mutanter för multipla jämförelser kan hjälpa14. Denna statistiska analys kan erbjuda en ordentlig slutsats om skillnaderna i bultning tid som genereras av genotyper. I detta fall bör en multivariat Cox proportionella faroanalys användas för att beakta två variabla parametrar.
För att ställa in Touch-Force nivå av de mänskliga hårstrån monterade på modell K1 touch maskin, justerade vi både höjden (vertikal kraft) och hastigheten (horisontell kraft) av hårborstar (figur 2E). De rätta inställningarna fastställdes utifrån de preliminära uppgifter som samlats in från många omgångar av Force Level tester på en Arabidopsis anläggning placeras på en elektronisk skala. Som vi har funnit, att hålla både hårets höjd och hastigheten oförändrad under hela touch Response experimentet kommer att producera en liknande och konstant tigmomorphogenetic fenotyp bland replikat för en Arabidopsis linje. För tung en touch-Force kan döda de unga plantorna som snabbrörliga hårborstar kan leda till att såra på ytan av ett löv. I kontrast, för lätt en touch-Force kanske inte tillräckligt för att utlösa förseningen av bultning inom 2 veckor efter upprepning av beröring. I vårt tidigare experiment har vi fastställt lämpliga touch-Force lastning vara 1-2 mn per touch14,19. Hårlängden på 0,5 cm lägre än koppen fälg används för att generera en liknande vertikal beröring kraft på modell K1 maskinbaserade hår beröring med en mild horisontell rörelsehastighet 5000 mm/min (figur 2E). Denna fasta inställning av modell K1 maskin minskar variationen av kraft styrka berodde på det mänskliga felet.
Övergripande, hår berör utförs av den automatiska touch-Force lastning maskin ger endast en genomsnittlig touch-Force lastning på växter. Den exakta touch-Force tillämpas, särskilt den horisontella kraft lastas, är svårt att beräkna antingen för ett enda hår eller en grupp av hårstrån på en borste. Dessutom kan variationen av Växtform och stjälkhöjd störa tillämpningen av horisontell kraft. Att mäta denna typ av fysisk styrka eller stress behöver en mer exakt trycksensor kopplad till ett hår eller en grupp av hårstrån. Man tror att mer exakt trycksensor och matematisk modellering kommer att tillämpas för att förbättra den automatiska touch-Force lastning maskin i framtiden. Tillväxtförhållanden, såsom ljusintensitet, fukt i marken och temperaturen i växthuset samt näringsämnen som levererar, alla spelar en avgörande roll i beröring svar fenotyp utveckling. Eventuella stressförhållanden, såsom torka, svagt ljus tillstånd med mindre än 90 μE ∙ m-2∙ s-1, och en högre eller en lägre temperatur som kan påverka den normala tillväxten av Arabidopsis kommer att störa mätningen av beröring svar av både vildtyp och mutanter.
Kort sagt, denna automatiska touch-Force lastning maskin kan erbjuda mer arbetsbesparande och uniformerade genomsnittliga touch-Force lastning än human finger touch och bomullspinne touch. Det förväntas att modellen K1 touch maskin kommer att tillämpas i olika hög genomströmning touch-Force signalering Mutant screening och beröring svar analys bland jordbruksgrödor eller förmodligen djurmodeller med några ändringar av touch-Force lastning Maskin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Denna studie stöddes av följande bidrag: 31370315, 31570187, 31870231 (National Science Foundation of China), 16100318, 661613, 16101114, 16103615, 16103817, AoE/M-403/16 (RGC of Hong Kong). Författarna vill tacka ju Feng precision och automation Technology Limited (Shenzhen, Kina) för deras erbjudande av flera scheman som visas i figur 1.
Författarna skulle också vilja tacka S. K. Cheung och W. C. Lee för deras bidrag till utvecklingen av touch-Force lastning maskin.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4 hair brushes | customized | ||
| 4 robot arms with one holder | customized | 1000 mm length holder and 560 mm length robot arm | |
| 57 stepper motor | 57HS22-A | ||
| All purpose potting soil | Plantmate, Hong Kong | ||
| Arabidopsis plant seeds | Arabidopsis Biological Resource Centers, Columbus, OH | For arabidopsis seed purchase | |
| BIO-MIX potting substratum | Jiffy Products International BV, the Netherlands | 1000682050 | Two soils were mixed together to grow Arabidopsis. The ratio of All purpos potting soil and BIO-MIX is 1:2 |
| IL 1700 research radiometer | International Light, Newburyport, MA | The light intensity of both full-wavelength and photosynthetic active radiation can be measured. | |
| ImageJ | https://imagej.nih.gov/ij/download.html | Free downloaded software | |
| Ju Feng Precision and Automation Technology Limited | Shenzhen, China | For belt-driven linear actuators and other mechanical modules purchase | |
| Junction plate of the slide block | To fix the Y guide-rail module or Y auxiliary girder onto backs of slide blocks | ||
| Junction plate of the X axis module | customized | To connect the X guide-rail module and X auxiliary girder | |
| Slide block | |||
| WDT4045 X axis guide-rail module | 843 mm, customized | Pre-installed with two slide blocks and one 57 stepper motor | |
| WDT4045 Y axis guide-rail module | 1038 mm, customized | Pre-installed with two slide blocks and one 57 stepper motor | |
| X axis auxiliary girder | 843 mm, customized | Pre-installed with two slide blocks | |
| Y axis auxiliary girder | 1038 mm, customized | Pre-installed with two slide blocks |
References
- Jaffe, M. J. Thigmomorphogenesis: the response of plant growth and development to mechanical stimulation with special reference to Bryonia dioica. Planta. 114, 143-157 (1973).
- Vandenbrink, J. P., Kiss, J. Z., Herranz, R., Medina, F. J. Light and gravity signals synergize in modulating plant development. Frontiers in Plant Science. 5, 563 (2014).
- Hashiguchi, Y., Tasaka, M., Morita, M. T. Mechanism of higher plant gravity sensing. American Journal of Botany. 100, 91-100 (2013).
- Salisbury, F. B. The Flowering Process. , Macmillan. New York. (1963).
- Darwin, C. The Power of Movement in Plants. , Appleton. New York. (1881).
- Chehab, E. W., Eich, E., Braam, J. Thigmomorphogenesis: a complex plant response to mechano-stimulation. Journal of Experimental Botany. 60, 43-56 (2008).
- Telewski, F. W., Jaffe, M. J. Thigmomorphogenesis: anatomical, morphological and mechanical analysis of genetically different sibs of Pinus taeda in response to mechanical perturbation. Physiologia Plantarum. 66, 219-226 (1986).
- Vogel, M. Automatic precision measurements of radial increment in a mature spruce stand and interpretation variants of short term changes in increment values. Allgemeine Forst-und Jagdzeitung. , Germany. (1994).
- Braam, J. In touch: plant responses to mechanical stimuli. New Phytologist. 165, 373-389 (2005).
- Jaffe, M. J., Leopold, A. C., Staples, R. C. Thigmo responses in plants and fungi. American Journal of Botany. 89, 375-382 (2002).
- Telewski, F. W. A unified hypothesis of mechanoperception in plants. American Journal of Botany. 93, 1466-1476 (2006).
- Gutiérrez, R. A., Ewing, R. M., Cherry, J. M., Green, P. J. Identification of unstable transcripts in Arabidopsis by cDNA microarray analysis: rapid decay is associated with a group of touch-and specific clock-controlled genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 11513-11518 (2002).
- Lee, D., Polisensky, D. H., Braam, J. Genome-wide identification of touch-and darkness-regulated Arabidopsis genes: a focus on calmodulin-like and XTH genes. New Phytologist. 165, 429-444 (2005).
- Wang, K., et al. Quantitative and functional posttranslational modification proteomics reveals that TREPH1 plays a role in plant touch-delayed bolting. Proceedings of the National Academy of Sciences United States of America. 115, 10265-10274 (2018).
- Hamilton, E. S., Schlegel, A. M., Haswell, E. S. United in diversity: mechanosensitive ion channels in plants. Annual Review of Plant Biology. 66, 113-137 (2015).
- Knight, M. R., Campbell, A. K., Smith, S. M., Trewavas, A. J. Transgenic plant aequorin reports the effects of touch and cold-shock and elicitors on cytoplasmic calcium. Nature. 352, 524 (1991).
- Toyota, M., Furuichi, T., Tatsumi, H., Sokabe, M. Cytoplasmic calcium increases in response to changes in the gravity vector in hypocotyls and petioles of Arabidopsis seedlings. Plant Physiology. 146, 505-514 (2008).
- Knight, M. R., Smith, S. M., Trewavas, A. J. Wind-induced plant motion immediately increases cytosolic calcium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89, 4967-4971 (1992).
- Braam, J., Davis, R. W. Rain-, wind-, and touch-induced expression of calmodulin and calmodulin-related genes in Arabidopsis. Cell. 60, 357-364 (1990).
- Chehab, E. W., Yao, C., Henderson, Z., Kim, S., Braam, J. Arabidopsis touch-induced morphogenesis is jasmonate mediated and protects against pests. Current Biology. 22, 701-706 (2012).
- Telewski, F. W., Pruyn, M. L. Thigmomorphogenesis: a dose response to flexing in Ulmus americana seedlings. Tree Physiology. 18, 65-68 (1998).
- De Vylder, J., Vandenbussche, F. J., Hu, Y., Philips, W., Van Der Straeten, D. Rosette tracker: an open source image analysis tool for automatic quantification of genotype effects. Plant Physiology. , (2012).
- Clark, T., Bradburn, M., Love, S., Altman, D. Survival analysis part I: basic concepts and first analyses. British Journal of Cancer. 89, 232 (2003).
- Bradburn, M. J., Clark, T. G., Love, S., Altman, D. Survival analysis part II: multivariate data analysis–an introduction to concepts and methods. British Journal of Cancer. 89, 431 (2003).
- Jaffe, M., Forbes, S. Thigmomorphogenesis: the effect of mechanical perturbation on plants. Plant Growth Regulation. 12, 313-324 (1993).
- Kutschera, U., Niklas, K. J. Evolutionary plant physiology: Charles Darwin’s forgotten synthesis. Naturwissenschaften. 96, 1339 (2009).
