Summary
Une douce machine de chargement à force tactile est construite à partir de brosses à cheveux humaines, de bras robotiques et d'un contrôleur. Les brosses à cheveux sont entraînées par des bras robotiques installés sur la machine et se déplacent périodiquement pour appliquer la force tactile sur les plantes. La force des touches de cheveux entraînées par la machine est comparable à celle des touches appliquées manuellement.
Abstract
Les plantes répondant aux stimulations mécaniques intracellulaires et extracellulaires (ou signaux de force) et développent des changements morphologiques spéciaux, une thigmomorphogénèse appelée. Au cours des dernières décennies, plusieurs composants de signalisation ont été identifiés et signalés pour être impliqués dans la mécanotransduction (par exemple, protéines de liaison d'ion de calcium et enzymes de biosynthèse d'acide jasmonique). Cependant, le rythme relativement lent de la recherche dans l'étude de la signalisation de force ou de la thigmomorphogégénèse est largement attribué à deux raisons : l'exigence d'induction tactile humaine laborieuse manipulée à la main de la thigmomorphogégénèse et les erreurs de force de force associé à la main-touch des gens. Afin d'améliorer l'efficacité du chargement de la force externe sur un organisme végétal, une machine de chargement automatique à force tactile a été construite. Cette brosse à cheveux robotisée à bras offre une simulation de force tactile facile à sauver la main-d'œuvre et facilement répétable, des cycles illimités de répétition tactile et une force tactile réglable. Cette machine de chargement de force tactile de cheveux peut être employée pour le criblage à grande échelle des mutants de signalisation de force tactile et pour l'étude de phénoménèse de la thigmomorphogégénèse végétale. En outre, les matériaux tactiles tels que les cheveux humains, peuvent être remplacés par d'autres matériaux naturels comme les poils d'animaux, les fils de soie et les fibres de coton. Les bras mobiles automatisés de la machine peuvent être équipés de buses arrosées et de souffleurs d'air pour imiter les forces naturelles des gouttes de pluie et du vent, respectivement. En utilisant cette machine automatique de chargement à force tactile de cheveux en combinaison avec le toucher de l'écouvillon de coton effectué à la main, nous avons étudié la réponse tactile de deux mutants de signalisation de force, MAP KINASE KINASE 1 (MKK1) et MKK2 plantes . Les phénoménes des plantes sauvages chargées par force tactile et de deux mutants ont été évalués statistiquement. Ils ont montré des différences significatives dans la réponse au toucher.
Introduction
La thigmomorphogénèse végétale est un terme inventé par Jaffe, MJ en 19731. Il s'agit d'un tropisme végétal, mais différent du phototropisme bien connu ou gravitropisme causé par des stimuli de la lumière du soleil ou de la gravité2,3. Il décrit les altérations phénotypiques associées aux stimulations mécaniques périodiques, qui ont été fréquemment observées par les botanistes dans les temps antérieurs4,5. Les gouttes de pluie, le vent, les plantes, les touches animales et humaines, même les morsures animales, sont tous considérés comme différents types de mécano-stimuli qui déclenchent la signalisation de la force dans les plantes4,5. Les caractéristiques de la thigmomorphogégénèse végétale comprennent le retard du boulonnage, une tige plus courte, une rosette plus petite / taille de feuille dans les plantes herbacées, et la tige plus épaisse dans les plantes ligneuses6,7,8. Ceci est différent de la réponse thigmonastique ou thigmotropic souvent trouvée dans la plante de Mimosa ou d'autres vignes mécano-sensibles, où ces réponses rapides de contact sont plus faciles à observer1,9,10. La thigmomorphogégenèse, d'autre part, est relativement difficile à observer en raison de sa réponse lente de croissance. La thigmomorphogénèse est habituellement observée après des semaines ou même des années de stimulation continue de force-chargement. Cette nature unique de la réponse tactile de la plante rend difficile l'exécution d'un écran génétique avancé en utilisant la stimulation tactile de la main humaine pour isoler les mutants résistants à la signalisation de force tactile d'une manière robuste.
Pour élucider les voies de transduction de signal de force et les mécanismes moléculaires sous-jacents à la thigmomorphogenesis6,11, des expériences biologiques moléculaires et cellulaires ont été effectuées au cours des6dernières, 12,13,14. Ces études ont proposé que les récepteurs de signal de force de la force végétale se composent principalement de canaux ioniques mécanosensibles (MSC) et les complexes MSC attachés composés de complexes multimériques de protéines membranaires11,14 , 15. Le pic transitoire cytoplasmique Ca2mD généré en quelques secondes après le toucher initial. Le vent, la pluie ou la gravi-stimulation peuvent interagir avec les capteurs de calcium en aval pour transduire les signaux de force aux événements nucléaires14,16,17,18. En plus des études moléculaires et cellulaires, l'écran génétique avant avec le toucher manuel des doigts des plantes a constaté que les phytohormones et les métabolites secondaires sont impliqués dans l'expression du gène tactile-inductible (TCH) qui en résulte à la suite de la chargement à force tactile13,19. Par exemple, aos et opr320 mutants ont été identifiés jusqu'à présent loin des études génétiques. Cependant, le problème majeur lié à l'application de la génétique avancée dans l'étude de la thigmomorphogénèse est toujours le travail intensif requis pour quantifier le niveau de réponse tactile et toucher une grande population de génétiquement muté plantes individuelles. Le problème de temps persiste également dans la main touchant à base d'écran mutant14,20. Par exemple, pour effectuer une série de stimulation par force tactile, une personne doit toucher 30 à 60 fois (une touche par seconde) sur une plante individuelle. Afin d'avoir un nombre suffisant de plantes pour l'analyse statistique du phénotype, 20-50 plantes individuelles du même génotype sont normalement nécessaires pour le processus de chargement par force tactile. Ce régime de chargement de force tactile signifie qu'une personne doit effectuer de façon répétitive 600-3000 touches sur un génotype de choix. Ce type de toucher doit normalement être répété 3 à 5 tours par jour, ce qui équivaut à environ 1 800-15 000 touches de doigt ou de coton par jour par génotype de plantes. Une personne bien formée est normalement nécessaire pour maintenir la force et la force de multiples touches dans une gamme souhaitable tout au long de nombreux tours de répétition dans une journée pour éviter la grande variation de force et de force. Comme il est bien connu que la thigmomorphogégénèse est un processus saturable et dépendant de la dose6,21, la force tactile / force devient essentielle à un succès dans le déclenchement de la réponse tactile d'une plante.
Pour supprimer le chargement de force tactile dépendant de la personne et pour maintenir l'application mécanique dans une plage d'erreur acceptable14, nous avons donc conçu une machine de chargement automatique à force tactile pour remplacer les touches manipulées à la main. La machine a 4 bras mobiles construits, dont chacun est équipé d'une brosse à cheveux humaine. Cette version est nommée Modèle K1 pour spécifier sa caractéristique de la charge de force tactile des cheveux humains. Si 4 génotypes sont mesurés quantitativement pour leur thigmomorphogénèse ou leur réponse tactile sous une seule machine, 40-48 individus par génotype peuvent être mesurés. Chaque cycle de répétition tactile (moins de 60 fois de toucher par plante) dure moins de 5 minutes à l'aide d'un bras robotique réglable à vitesse mobile. Ainsi, les plantes d'une machine tactile modèle K1 peuvent être stimulées mécaniquement pendant plusieurs tours par jour, soit avec un chargement constant de force tactile, soit avec différents niveaux de forces comme initialement programmé.
Arabidopsis thaliana, un organisme végétal modèle, a donc été choisi comme espèce végétale cible pour tester l'application entièrement automatique de la machine de chargement par force tactile. Parce qu'il ya plusieurs grandes banques de semences disponibles pour récupérer les divers germplasmes de mutants et la taille de la floraison, Arabidopsis s'adapte bien à l'espace disponible dans l'étagère de croissance monté avec la machine tactile modèle K1.
La machine tactile automatique Model K1 se compose de trois composants principaux : (1) le support métallique en forme de H composé de deux actionneurs linéaires à courroie, (2) des bras métalliques robotiques équipés de brosses à cheveux et (3) un contrôleur. Pour une machine tactile modèle K1 personnalisée, chaque module d'axe X/Y est composé d'un guide-rail à courroie, de deux blocs de glissière (rouge) et d'un moteur de 57 stepper (préinstallé et démontable) (Figure 1A,B). L'actionneur horizontal supérieur permet au bras métallique robotique de se déplacer horizontalement à gauche et à droite, l'actionneur linéaire vertical inférieur à courroie permet au bras métallique robotique de se déplacer verticalement (Figure1B, Figure 2A ). Quatre bras robotiques démontables ont été installés sur l'actionneur vertical (Figure 1C, Figure 2B). Quatre brosses à cheveux humaines étaient liées à quatre bras robotiques, respectivement (Figure 1C, Figure 2B). Toutes les pièces mécaniques pour construire la machine tactile modèle K1 en caractères en gras ci-dessous sont indiquées dans la figure 1C (voir aussi le tableau des matériaux).
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Protocol
1. Préparation des semences
REMARQUE : Les graines d'Arabidopsis de type sauvage (Col-0) ainsi que les mutants mkk1 et mkk2 utilisés ont été achetées auprès du Centre de ressources biologiques d'Arabidopsis (ABRC, https://www.arabidopsis.org, Columbus, OH).
- Calculez le nombre d'individus végétaux de chaque génotype qui seront utilisés pour une analyse statistique fiable. Préparer un nombre suffisant de graines en fonction du taux de germination de chaque ligne, généralement 4-5 fois plus que ce qui est nécessaire pour une expérience. Assurez-vous qu'un nombre suffisant de plantes saines et uniformes peuvent être utilisées pour l'analyse de réponse tactile. Selon ce protocole, 300-500 graines par génotype sont généralement utilisées pour produire 80-90 plantes de taille similaire.
- Immerger les graines dans l'eau froide et les conserver dans 4 oC (recouvertes de papier d'aluminium pour les garder dans l'obscurité) pour l'imbibition des graines. Semez les graines 5-7 jours après l'imbibition.
2. Croissance des plantes
- Sélectionnez le sol approprié pour la croissance des plantes (voir le Tableau des matériaux). Évitez les gros touffes et mélangez-les homogènement.
- Préparer 24 gobelets en plastique : la capacité de fixation est de 207 ml et le diamètre supérieur de la jante est de 7,4 cm. Percer trois trous ronds au fond d'une tasse à des fins d'irrigation.
- Remplissez ces gobelets en plastique avec le sol mélangé. Laissez le sol s'accumuler jusqu'à 1-2 cm plus haut que la jante de tasse et aplatir la surface du sol empilé doucement.
- Transférer 24 tasses dans un bac en plastique (21 pouces x 10,8 pouces x 2,5 pouces) et placer le plateau dans un état de lumière constante (voir ci-dessous).
- Ajouter 2,5 L d'eau dans chaque plateau deux heures avant l'ensemencement des graines. Laissez le sol absorber l'eau des trous situés au fond des tasses et attendez que la surface du sol tombe au niveau de la jante de tasse.
- Semer 3-4 graines en un seul endroit, et 4 taches réparties uniformément dans une tasse.
- Placer un couvercle en plastique transparent au-dessus de chaque plateau et laisser germer les graines pendant une semaine. Retirez ensuite le couvercle et laissez les semis pousser pendant une autre semaine.
- Enlever les plantes supplémentaires en amincissement et garder 4 individus de plante de taille similaire dans chaque tasse 9-10 jours après l'ensemencement des graines.
- Irriguer les plantes avec 1,5 L d'eau tous les deux jours après la germination des graines.
3. État de croissance
- Fixer la température de la chambre de croissance à 23,5 à 1,5 oC, et l'humidité entre 35 et 45 %.
- Définir l'intensité lumineuse entre 180 et 240 'E-2's-1 (mesuré par le radiomètre de recherche IL 1700, Lumière internationale)14. Le rayonnement actif photosynthétique est de 90 à 120 'E 'm-2-1.
- Définir l'état de lumière à 24 h constante.
4. La construction d'une machine de chargement à force tactile
REMARQUE : Cette machine robotique de chargement de force tactile de cheveux (modèle K1) est conçue pour servir des buts du criblage mutant de signalisation de force tactile et de la génération de thigmomorphogenesis de plante (figure 1, figure 2).
- Modules de pré-installation (démontables, figure 1C)
- Installez deux blocs de glissière (I) et un moteur 57 stepper (II) sur le module guide-rail de l'axe X/Y (III/V).
- Installez deux blocs de diapositives (I) sur la poutre auxiliaire de l'axe X/Y (IV/VI).
- Installation d'autres pièces mécaniques (figure 1C)
- Fixer ensemble le module guide-rail de l'axe X (III) et la poutre auxiliaire de l'axe X (IV) en assemblant deux plaques de jonction (VII) à chaque extrémité du guide-rail.
- Fixer le module guide-rail de l'axe Y (V) sur le dorsal de deux blocs de glissement (axe X) en position de croisement en assemblant deux plaques de jonction (VIII) entre les deux.
- Fixez la poutre auxiliaire de l'axe Y (VI) sur le dorsal des deux autres blocs de glissement (axe X) en position de croisement en assemblant deux plaques de jonction (VIII) entre les deux.
- Assembler le support des bras robotisés (IX) à l'avant de deux blocs de glissement (axe Y) en position de croisement avec une plaque de jonction (Figure 2A).
- Assembler 4 brosses à cheveux (X) sur les bras robotisés (IX) avec des pinces (Figure 2B).
5. Réglage de la machine de chargement Touch-Force
REMARQUE : Tous les paramètres de contrôle pour définir la machine tactile modèle K1 en caractères en gras ci-dessous sont indiqués dans le panneau de contrôle (Figure 2F).
- Installez des brosses tactiles sur les bras robotiques. Utilisez une règle en acier de 330 mm de long comme support pour fixer une couche de cheveux humains (3 600 à 4 600 poils/brosse) uniformément. La longueur des cheveux est de 126 mm (Figure 1C).
- Fixez ces règles en acier sur les bras robotiques avec deux pinces métalliques.
- Définir la hauteur des bras de la machine le long de la dimension verticale (axe Y) en premier. Appuyez sur Jog Fpour soulever et Jog R- pour abaisser les bras et les brosses robotiques. Laissez la pointe des brosses à cheveux 0,5 cm plus bas que la jante de tasse. Appuyez sur l'ensemble ZERO. Pré-exécuter la machine 1-2 cycles pour s'assurer que tous les individus de la plante sont touchés. Ajuster et calibrer les brosses et les pointes de cheveux à la même hauteur tous les jours pendant toute la période de toucher.
- Utilisez une balance électronique pour mesurer la force tactile (chargement vertical) et maintenir le niveau de force tactile à 1-2 mN14.
- Placez manuellement la position de départ des bras de la machine le long de la dimension horizontale (axe X). Laissez les brosses à cheveux accrocher au bord de chaque plateau et assurez-vous qu'aucune plante n'est touchée avant le début de l'expérience de toucher. Appuyez sur Jog FMD/Jog R- pour déplacer le bras de la machine horizontalement peu à peu pour définir la position de départ.
- Définir la distance de déplacement de la brosse à cheveux dans la dimension horizontale (axe X) à 365 mm en appuyant sur le bouton Voyage. Press Inc. FMD/Inc. R- pour déplacer les bras de la machine afin d'obtenir une distance de déplacement complète et de s'assurer que toutes les plantes traitées sont touchées pendant toute l'expérience de toucher.
- Définir la vitesse de déplacement le long de l'axe X des bras de la machine à 5 000 mm/min en appuyant sur le bouton Vitesse automatique. Gardez la même vitesse de déplacement pendant toute l'expérience de toucher.
- Définir le temps de contact à 20 essais en appuyant sur le bouton Cycle mineur. Conservez le même nombre de touches par tour pendant toute l'expérience de toucher.
REMARQUE : Un cycle mineur équivaut à deux distances de déplacement, ce qui signifie que les bras de la machine se déplaceront de la position de départ à la position d'extrémité, puis de nouveau à la position de départ. Un cycle mineur génère deux touches. Les brosses à cheveux touchent les plantes 40 fois en 20 essais (2 touches x 20 essais et 40 touches). Le 40-touch est défini comme un tour de chargement de force tactile. - Définir l'intervalle de répétition du toucher à 480 min par jour en appuyant sur le bouton Période majeure. Conservez la même fréquence de balles tactiles pendant toute une expérience de toucher.
REMARQUE: Cela permet aux brosses à cheveux de toucher les plantes pendant 3 tours par jour, et le temps d'intervalle entre chaque tour est de 480 min (8 h). Le numéro bleu affiché représente le temps d'intervalle de chaque tour de touche. La machine démarre automatiquement un nouveau cycle de toucher lorsque le compte à rebours ci-dessous (numéro rouge) tourne à 0000. - Définir le cycle majeur à 12 essais, ce qui signifie que la machine touchera les plantes pendant 12 tours dans un délai de 4 jours automatiquement. Ce paramètre de 12 essais est utilisé pour éviter l'erreur humaine en sautant une journée de toucher.
- Appuyez sur le bouton de démarrage pour lancer le programme pré-réglé. La machine tactile modèle K1 effectuera automatiquement le chargement de force tactile selon les paramètres.
6. Collecte et analyse de données physiologiques
-
Jours à boulonnage: Enregistrez le jour de boulonnage de chaque plante individuellement dans le cadre d'une expérience touchante. Le boulonnage est un symbole qu'une plante change son stade de croissance de la phase végétative à la phase de reproduction. Dans Arabidopsis, le jour de boulonnage est défini comme le nombre de jours utilisés par une plante pour avoir sa première tige d'inflorescence atteindre 1 cm de longueur.
REMARQUE : Dans les conditions de croissance décrites ci-dessus, le boulonnage des plantes de type sauvage commence normalement de 19 à 23 jours après l'ensemencement des graines et se termine à 28-32 jours. -
Rayon rosette: Mesurer la distance entre le centre de la rosette et la pointe de la plus longue feuille.
- Prenez des photos de l'ensemble du plateau à partir du haut. Prenez des photos du groupe témoin et du groupe traité au toucher séparément.
- Téléchargez le logiciel approprié. Utilisez le logiciel téléchargé gratuitement ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/download.html) par exemple.
- Ouvrez un fichier photo, utilisez la fonction zoom pour zoomer la photo dans une taille appropriée.
- Choisissez l'outil Straight pour tracer une ligne droite entre le centre de rosette et la pointe d'une feuille la plus longue pour mesurer le rayon de rosette.
- Sélectionnez une plante et appuyez sur le bouton gauche pour tracer une ligne droite du centre de rosette à la pointe de la feuille la plus longue.
- Choisissez la fonction Analyse-Mesure ou appuyez sur Ctrl et M pour analyser la distance de ligne.
- Sélectionnez une tasse et répétez les deux étapes précédentes pour analyser le diamètre de chaque tasse en plastique en même temps. Utilisez ces données pour effectuer le calcul afin d'éliminer le biais résultant de la prise de photos.
REMARQUE: L'équation est:
Ra/Da 'Rm/Dm
(Ra, le rayon Rosette réel d'une plante; Da, le diamètre réel de la tasse en plastique; Rm, le rosette Radius mesuré de la même plante déterminé par un logiciel; Dm, le diamètre mesuré de la tasse en plastique qui est utilisé pour la culture de la même plante)
-
Zone Rosette: Mesurer la surface horizontale en 2 dimensions des feuilles de rosette.
- Enlever l'inflorescence sans affecter le reste des organes de rosette.
- Prenez des photos du haut de chaque plante avec une règle d'échelle placée à proximité.
- Utilisez un plugin gratuit de ImageJ, Rosette Tracker et suivez le protocole publié précédemment22.
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Representative Results
La machine de chargement automatique de force tactile de cheveux
Pour l'observation des changements morphologiques sur les plantes, les conditions de croissance reproductibles et les méthodes de traitement sont essentielles pour obtenir des résultats reproductibles. Ce criblage mutant à haute vitesse et à force tactile est réalisé par la nouvelle machine de chargement à force tactile, le modèle K1 (Figure 1, Figure 2). Ces brosses à cheveux peuvent toucher un maximum de 4 plateaux de plantes simultanément. Il y avait 24 tasses placées dans un plateau, et 12 tasses de plantes dans un groupe utilisé à la fois comme contrôle et les plantes traitées (Figure 2C,D). Dans chaque tasse, quatre plantes ont été cultivées et un total de 48 individus de plantes ou moins ont été touchés par la même brosse à cheveux, ce qui garantit suffisamment de plantes pour une analyse statistique ultérieure. Un maximum de 4 génotypes de plantes peuvent être traités au toucher simultanément sur une machine tactile modèle K1. Un des points clés est le réglage de la machine tactile bras / hauteur des cheveux parce que la thigmomorphogégénèse est dépendante de la dose6,21. Différentes positions de cheveux par rapport à la position de feuille de rosette de plante génèrent différentes forces de contact, qui peuvent produire des résultats totalement différents de thigmomorphogenesis. Dans nos expériences, la pointe des poils qui contactent les plantes doit être placée 0,5 cm plus bas que la jante de la tasse (Figure 2E), qui génère des forces similaires à la force tactile précédemment publiée14. Un contrôleur programmable installé dans un panneau tactile est utilisé pour contrôler l'ensemble de la machine de chargement à force tactile (figure2F, voir Tableau des matériaux).
La comparaison de deux méthodes tactiles différentes
Pour comparer cette méthode de cheveux automatiques à la machine avec la méthode conventionnelle de toucher à l'écouvillon nageant manuellement, deux expériences indépendantes ont été réalisées sur le Col-0 (Figure 3). Dans le groupe de toucher d'écouvillon de coton, le contact a commencé à partir des usines de 12 jours-vieux. Chaque tour avait 40 touches (1 touche/s). Au total, 3 tours ont été effectués chaque jour (Figure 3A). Il a montré 1,7 jours de retard dans le boulonnage après un traitement continu de contact d'écouvillon de coton (22.1 - 0.2 jours contre 23.8 - 0.2 jours). De même, pour le toucher automatique des cheveux piloté par la machine, le chargement de force tactile initié à partir de plantes de 14 jours et 40 fois de toucher (dans les 3 minutes) ont été appliqués pour un tour. Au total, 3 tours de touches ont été effectués par jour avec exactement 8 heures d'intervalle (Figure 3B). Des boulons retardés ont été observés pour les usines du Col-0. Le temps moyen de boulonnage était de 23,0 à 0,3 jour, tandis que le temps de boulonnage des usines traitées à la machine tactile du modèle K1 était de 24,7 à 0,2 jour. Les différences entre les plantes témoins et les plantes traitées au toucher ont donc été analysées avec le modèle univarié de risques proportionnels Cox. Il a offert le ratio de danger estimé (HR) de 0,31 (toucher de coton-tige) et de 0,52 (toucher des cheveux à moteur machine), respectivement (figure 3C), ce qui signifie que le risque de boulonnage / probabilité des plantes dans le groupe touché est de 31% et 52% par rapport à usines du groupe témoin, respectivement. Cela indique que la possibilité de boulonnage des plantes de type sauvage touché est d'environ la moitié par rapport à celle des plantes témoins intactes, qu'il s'agisse d'un contact manuel avec un coton-tige ou de la touche de cheveux automatisée.
Les résultats prospectifs sur différents mutants tactiles
Des données préliminaires récentes suggèrent que MKK1 et MKK2 pourraient jouer un rôle important dans la réponse tactile d'Arabidopsis14. Nous avons sélectionné ces deux mutants et mené des expériences tactiles sur ces mutants à réponse tactile putative à l'aide de la machine de chargement automatique de la force tactile des cheveux (Figure 4, Tableau 1). Les usines de contrôle de type sauvage ont montré 1,8 jour de retard de boulonnage (24,1 à 0,3 jours contre 25,9 à 0,2 jour, figure 4A) tout comme le rapport précédent14 alors que ce retard de boulonnage n'a pas été observé sur les mutants insertionnels à l'ADN T, mkk1 (24,6 à 0,2 jours par rapport à 24,4 jours, figure 4B et tableau 1) et mkk2 (23,9 jours et 0,1 jour contre 24,2 à 0,2 jour, figure 4C et tableau 1). En analysant ces données avec le modèle univarié de risques proportionnels Cox, seul le type sauvage Col-0 présentait une différence significative entre les plantes témoins et touchées dont la HR est estimée à 0,41 (figure4D). Ces expériences de chargement par force tactile menées par la machine de chargement automatique de la force tactile des cheveux ont démontré que les mutants mkk1 et mkk2 sont des mutants à réponse tactile.
La mesure d'autres indices morphologiques
Les changements morphologiques associés à la thigmomorphogégénèse ne se limitent pas au retard du boulonnage. La tige plus courte et la plus petite taille de feuille de rosette sont également les composants de la thigmomorphogenesis6,7,9,14. Par conséquent, nous avons signalé ici deux autres types de mesures sur les indices morphologiques de la réponse tactile, le rayon de rosette/ la longueur des feuilles et la zone de rosette (projetée) (figure 5). Semblable au changement de phénotype précédemment observé, la plante sauvage de type Col-0 a montré le rayon sensiblement plus petit de rosette et la longueur plus courte de feuille après 3 jours de contact automatique constant et répétitif de cheveux machine-conduits (1.77 - 0.05 cm contre 1.50 - 0.04 cm, Figure 5A). La zone de rosette projetée a été changée de 20,32 à 0,53 cm2 à 16,19 à 0,48 cm2 après 13 jours de toucher (figure5B). Le mkk1 et le mkk2 ont eu le rayon et la zone réduits semblables de rosette. Prises ensemble, ces données ont démontré que les protéines MKK1 et MKK2 sont importantes pour le retard de boulonnage de l'Arabidopsis et ne sont pas nécessaires pour façonner la taille de la rosette et la zone de rosette.
analyse statistique
En ce qui concerne les parcelles de boîte et de moustaches présentées dans la figure 2 et la figure 3 et les diagrammes de colonne s'affichent à la figure 5, la signification statistique a été analysée par le test t de l'élève à deux queues, avec une signification représentée par les graphiques de l'élève à la p. 0,001 et p 0,05, respectivement. Pour les parcelles Kaplan-Meier présentées à la figure 2 et à la figure 3, une analyse des risques univariés de Cox a été utilisée pour analyser l'effet du traitement tactile sur l'événement de boulonnage23,24. Le ratio de risque (HR), l'intervalle de confiance de 95 % (IC à 95 %) et la valeur p sont offerts dans les tableaux ci-dessous. Par exemple, HR 0,5 signifie qu'un jour donné, le risque de boulonnage/probabilité des plantes du groupe touché était de 0,5 ou 50 % par rapport à ces usines du groupe témoin.
Figure 1 . La construction et les paramètres de la machine de chargement automatique de force tactile de cheveux. (A) Schémas par défaut de l'actionneur linéaire. Le panneau supérieur gauche est la vue latérale et le panneau inférieur gauche est la vue dorsale. Les longueurs totales du module de l'axe X et du module de l'axe Y sont respectivement de 843 mm et 1 038 mm. Chaque module X/Y par défaut est composé d'un guide-rail, d'un bloc de glissement et d'un moteur de 57 stepper (préinstallé et démontable). Pour une machine tactile Modèle K1 personnalisée, chaque module X/Y est composé de deux blocs de diapositives (rouge). La plaque de jonction du module X est agrandie de 56 mm à 100 mm pour offrir une meilleure connexion et un meilleur soutien. Le panneau supérieur droit est la section transversale du guide-rail et le panneau inférieur droit est le moteur 57 stepper. (B) Schémas de l'axe double X construit et des actionneurs linéaires à double axe Y. Il s'agit de la majeure partie de la machine de chargement à force tactile. Le panneau inférieur gauche est la vue dorsale des actionneurs linéaires construits. Le panneau supérieur gauche est la vue latérale du module de l'axe X (843 mm). Le panneau central est la vue latérale du module de l'axe Y (1 038 mm). Le panneau supérieur droit est la vue dorsale de 4 blocs de diapositives sur le module Y et la poutre auxiliaire Y. Le panneau inférieur droit est la vue dorsale de la plaque de jonction sur le module X. (C) Le diagramme de flux de l'assemblage de la pièce de la machine. Différentes parties sont marquées et nommées dans la figure. Des processus d'assemblage détaillés ont été décrits dans le protocole. L'unité indiquée est ce chiffre est mm. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 . La conception globale de la machine de chargement automatique de force tactile de cheveux. (A) La machine tactile finie Model K1. La photo a été prise de la face avant. L'actionneur linéaire supérieur contrôle le bras du robot se déplaçant horizontalement et l'actionneur linéaire inférieur contrôle le bras robotique se déplaçant verticalement. (B) La vue latérale montrant des bras robotiques démontables. Des brosses à cheveux ont été fixées sur les bras robotiques. (C et D) Photos montrant comment les brosses à poils humains touchent les plantes, qui ont été prises du côté avant et du côté latéral, respectivement. (E) La vue latérale montrant comment définir la hauteur de la brosse à cheveux contre la jante de la tasse. Les bras de la machine et les brosses à cheveux sont visibles. (F) L'interface de fonctionnement de la machine tactile Modèle K1. Un contrôleur programmable (AFPX-C30T) relié à un panneau tactile (MT6070i) est utilisé pour contrôler l'ensemble de la machine. Les paramètres détaillés et les procédures d'exploitation sont décrits dans le protocole. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 . Comparaison des effets de deux méthodes tactiles sur la thigmomorphogégénèse. (A-B) La comparaison du toucher manuel de coton-tige (A) et du contact humain de cheveux conduit par la machine automatique de chargement de force tactile (B),respectivement. Les parcelles de boîte et de moustaches sont indiquées dans le panneau gauche, qui montrent la comparaison du jour de boulonnage moyen entre le groupe témoin et le groupe touché. Les moyens et SE sont affichés. L'analyse statistique a été effectuée par le t-test d'un étudiant. Importance à p 'lt; 0.001 est indiqué comme '. Les parcelles Kaplan-Meier sont représentées au milieu, qui sont le pourcentage de plantes de boulonnage au cours de la période de croissance (jours après le semis). Le panneau droit montre des individus représentatifs de la commande intacte et des plantes touchées qui montrent la différence dans le temps de boulonnage et la hauteur de tige d'inflorescence. (C) Le tableau résumé : les nombres numériques en sous-témoins et les colonnes touchées sont le nombre de plantes utilisés pour l'analyse statistique. Le ratio de danger (HR), l'intervalle de confiance de 95 % (IC à 95 %) et la valeur p dans la section de l'analyse des risques univariés de Cox sont offerts. Le risque de boulonnage et la probabilité des plantes du groupe touché étaient respectivement de 31 % et 52 % par rapport au groupe non touché. L'analyse des risques univariés de Cox a été estimée par le SPSS. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 . La thigmomorphogénèse des mutants mkk1 et mkk2 ainsi que la plante de type sauvage (Col-0) induite par le toucher automatique des cheveux. (A-C) La réponse tactile prospective du Col-0 (A), mkk1 (B), et mkk2 (C) généré par la répétition des touches de cheveux humains entraînées par la machine de chargement automatique de force tactile. Les parcelles de boîte et de moustaches sont indiquées dans le panneau gauche, qui sont la comparaison du jour de boulonnage moyen entre le groupe témoin et le groupe touché. Les moyens et SE sont affichés. L'analyse statistique a été effectuée par le t-test d'un étudiant. Le 'et n.s. représentent p 'lt; 0.001 et p 'gt; 0.05, respectivement. Les parcelles Kaplan-Meier sont représentées au milieu, qui sont le pourcentage de plantes de boulonnage au cours de la période de croissance (jours après le semis). Le panneau de droite montre les individus représentatifs du contrôle intact et les plantes touchées qui montrent la différence de boulonnage. Les données de mkk1 (B) et de mkk2 (C) ont été compilées à partir de deux et trois répliques biologiques, respectivement. Les numéros détaillés des plantes utilisés dans chaque réplique ont été indiqués dans le tableau 1. (D) Le tableau résumé : les nombres sous contrôle et les colonnes tactiles étaient le nombre d'usines utilisées/analysées dans ces deux groupes, respectivement. Les RH, 95 % de L'IC et la valeur p dans le cadre de la section de l'analyse des risques univariés de Cox ont été offerts. Le risque de boulonnage/probabilité des plantes de type sauvage dans le groupe touché est de 41 % par rapport au groupe témoin. L'analyse des risques univariés de Cox a été estimée par le SPSS. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5 . Le rayon de rosette et la mesure de secteur pour définir la thigmomorphogégénèse. (A-B) Le rayon de rosette et la zone de rosette du type sauvage ont été mesurés au jour 17 et au jour 27 après le semis de graine, respectivement. Les barres indiquées dans le panneau supérieur gauche sont les comparaisons du rayon de rosette ou de la zone de rosette entre le groupe témoin et le groupe touché, respectivement. Les moyens et SE sont affichés. L'analyse statistique a été effectuée par le test t de l'étudiant; p lt; 0,001. Les photos montrées dans le panneau supérieur droit sont des plantes individuelles représentatives. Les tableaux résumés ci-dessous montrent le nombre d'usines analysés dans le groupe témoin et le groupe touché. Le rayon de rosette (cm) au jour 17 et la zone de rosette (cm2) au jour 27 sont également montrés. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Tableau 1. Les données de boulonnage de différentes répliques biologiques. Le tableau résumé contient deux répliques biologiques de mkk1 et trois répliques biologiques de mkk2.
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Discussion
La thigmomorphogégénèse est une réponse complexe de croissance de plante vers des perturbations mécaniques, qui implique un réseau de signalisation cellulaire et d'action des phytohormones. C'est une conséquence de l'évolution adaptative des plantes pour survivre dans les conditions environnementales indésirables25,26. Le toucher mécanique, en particulier le toucher humain des doigts et le toucher de coton-tige tenu à la main, ont été sélectionnés pour étudier ces changements morphologiques dans des études précédemment thigmomorphogenetic14,20. Cette version simplifiée du chargement par force tactile pour déclencher la réponse tactile de l'usine est plus facile à contrôler et à appliquer. En outre, ce type de méthode de chargement par force tactile peut en quelque sorte imiter les signaux de force stimulés par le vent et la pluie produits dans l'environnement naturel19. La force tactile est capable de déclencher des pics de calcium, d'induire la phosphorylation protéique14 et l'expression génique en aval qui assure la réaction tactile19. De même, les brosses à cheveux humaines montées sur des bras mobiles automatisés peuvent également générer la réponse tactile de la plante en imitant les touches manipulées à la main de l'homme. Pour diversifier les types d'application de la force, des buses et/ou des souffleurs de vent peuvent également être installés sur les bras robotiques de la machine et utilisés pour une expérience physiologique (Figure 2). La caractéristique unique rend la machine de chargement automatique à force mécanique plus polyvalente dans les études morphogénétiques et physiologiques. Le plus grand avantage de cette machine de chargement automatique à force mécanique est probablement sa fonction sans travail, répétable et qui permet d'effectuer une sélection spécifique de phénotypes mutants à partir d'un grand nombre d'individus mutagénaires. Contrairement à des heures de touches manipulées à la main humaine, la machine tactile Modèle K1 peut toucher divers mutants simultanément et compléter un tour de toucher dans les 3 à 5 minutes. Le délai pour un tour de touche dépend en grande partie de l'établissement du programme au début du traitement. Si chaque plante individuelle était touchée 40 fois dans un tour, la machine modèle K1 n'aurait besoin que de 9-15 min pour terminer trois tours de traitement tactile dans une journée. Le temps d'intervalle entre chaque cycle de touches peut être contrôlé avec précision; il est moins probable que les êtres humains atteignent une telle précision.
Une autre question importante concernant le traitement tactile est le stade de croissance de la plante sur lequel la force tactile doit être appliquée. Dans notre pratique, le toucher a commencé 14 jours après le semis de semences pour le type sauvage et deux mutants que les taux de croissance de ces trois génotypes sont similaires. Pour les mutants qui ont une différence significative dans le temps de développement du type sauvage, on peut choisir un jour initial différent pour commencer le toucher. L'exécution du test ANOVA à sens unique sur les données de boulonnage des plantes de type sauvage et des mutants pour des comparaisons multiples peut aider14. Cette analyse statistique peut offrir la bonne conclusion sur les différences de temps de boulonnage générées par les génotypes. Dans ce cas, une analyse multivariée des risques proportionnels Cox devrait être utilisée pour tenir compte de deux paramètres variables.
Pour définir le niveau de force tactile des poils humains montés sur la machine tactile Modèle K1, nous avons ajusté à la fois la hauteur (force verticale) et la vitesse (force horizontale) des brosses à cheveux (Figure 2E). Les bons paramètres ont été déterminés à partir des données préliminaires recueillies à partir de nombreuses séries de tests de niveau de force sur une usine d'Arabidopsis placée à l'échelle électronique. Comme nous l'avons constaté, en gardant à la fois la hauteur des cheveux et la vitesse inchangée tout au long de l'expérience de réponse tactile entière produira un phénotype thigmomorphogenetic similaire et constante parmi les répliques pour une ligne d'Arabidopsis. Une force tactile trop lourde peut tuer les jeunes plants, car les brosses à cheveux qui se déplacent rapidement peuvent entraîner des blessures à la surface d'une feuille. En revanche, une force tactile trop légère peut ne pas suffire à déclencher le retard du boulonnage dans les 2 semaines suivant la répétition du toucher. Dans notre expérience précédente, nous avons déterminé que le chargement de force tactile approprié était de 1-2 mN par contact14,19. La longueur des cheveux de 0,5 cm plus bas que la jante de tasse est utilisée pour générer une force tactile verticale similaire sur le modèle K1 à base de cheveux à base de machine toucher avec une vitesse de déplacement horizontale douce 5000 mm/min (Figure 2E). Ce réglage fixe de la machine modèle K1 réduit la variation de force résultant de l'erreur humaine.
Dans l'ensemble, les touches de cheveux effectuées par la machine de chargement automatique à force tactile ne fournissent qu'une charge moyenne de force tactile sur les plantes. La force tactile précise appliquée, en particulier la force horizontale chargée, est difficile à calculer soit pour un seul cheveu ou un groupe de poils sur une brosse. En outre, la variance de la forme de la plante et de la hauteur de la tige peut interférer avec l'application de la force horizontale. Mesurer ce type de force physique ou de stress nécessite un capteur de pression plus précis lié à un cheveu ou un groupe de poils. On croit que le capteur de pression plus précis et la modélisation mathématique seront appliquées pour améliorer la machine de chargement automatique de force tactile à l'avenir. Les conditions de croissance, telles que l'intensité lumineuse, l'humidité du sol et la température de la serre ainsi que les nutriments approvisionnements, jouent tous un rôle crucial dans le développement du phénotype de réponse tactile. Toutes les conditions de stress, telles que la sécheresse, l'état de lumière faible avec moins de 90 'E-2-s-1, et une température plus élevée ou plus basse qui peut affecter la croissance normale de l'Arabidopsis interfèrent avec la mesure de la réponse tactile de type sauvage et les mutants.
En bref, cette machine automatique de chargement à force tactile peut offrir plus de travail-économie et uniforme moyenne de chargement de force tactile que le toucher humain de doigt et le contact de coton-tige. On s'attend à ce que la machine tactile modèle K1 soit appliquée dans diverses analyses de criblage mutant à fort débit et d'analyse de réponse tactile parmi les cultures agricoles ou probablement des modèles animaux avec quelques modifications de la charge de force tactile machine.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Cette étude a été soutenue par les subventions suivantes : 31370315, 31570187, 31870231 (National Science Foundation of China), 16100318, 661613, 16101114, 16103615, 16103817, AoE/M-403/16 (RGC of Hong Kong). Les auteurs tient à remercier Ju Feng Precision and Automation Technology Limited (Shenzhen, Chine) pour leur offre de plusieurs schémas présentés à la figure 1.
Les auteurs souhaitent également remercier S. K. Cheung et W. C. Lee pour leur contribution au développement de la machine de chargement à force tactile.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4 hair brushes | customized | ||
| 4 robot arms with one holder | customized | 1000 mm length holder and 560 mm length robot arm | |
| 57 stepper motor | 57HS22-A | ||
| All purpose potting soil | Plantmate, Hong Kong | ||
| Arabidopsis plant seeds | Arabidopsis Biological Resource Centers, Columbus, OH | For arabidopsis seed purchase | |
| BIO-MIX potting substratum | Jiffy Products International BV, the Netherlands | 1000682050 | Two soils were mixed together to grow Arabidopsis. The ratio of All purpos potting soil and BIO-MIX is 1:2 |
| IL 1700 research radiometer | International Light, Newburyport, MA | The light intensity of both full-wavelength and photosynthetic active radiation can be measured. | |
| ImageJ | https://imagej.nih.gov/ij/download.html | Free downloaded software | |
| Ju Feng Precision and Automation Technology Limited | Shenzhen, China | For belt-driven linear actuators and other mechanical modules purchase | |
| Junction plate of the slide block | To fix the Y guide-rail module or Y auxiliary girder onto backs of slide blocks | ||
| Junction plate of the X axis module | customized | To connect the X guide-rail module and X auxiliary girder | |
| Slide block | |||
| WDT4045 X axis guide-rail module | 843 mm, customized | Pre-installed with two slide blocks and one 57 stepper motor | |
| WDT4045 Y axis guide-rail module | 1038 mm, customized | Pre-installed with two slide blocks and one 57 stepper motor | |
| X axis auxiliary girder | 843 mm, customized | Pre-installed with two slide blocks | |
| Y axis auxiliary girder | 1038 mm, customized | Pre-installed with two slide blocks |
References
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