Summary
부드러운 터치 포스 로딩 기계는 인간의 머리 브러시, 로봇 팔 과 컨트롤러에서 내장되어 있습니다. 헤어 브러쉬는 기계에 설치된 로봇 팔에 의해 구동되며 주기적으로 이동하여 식물에 터치 포스를 가합니다. 기계 구동 헤어 터치의 강도는 수동으로 적용된 터치의 강도와 비슷합니다.
Abstract
세포내 및 세포외 기계적 자극(또는 힘 신호)에 반응하는 식물은 특별한 형태학적 변화를 일으킵니다. 지난 수십 년 동안, 몇몇 신호 성분은 메카노트랜스덕션(예를 들어, 칼슘 이온 결합 단백질 및 자스몬산 생합성 효소)에 관여하기 위해 확인되고 보고되었다. 그러나, 힘 신호 또는 thigmomorphogenesis의 연구에서 연구의 상대적으로 느린 속도는 크게 두 가지 이유에 기인: 힘든 인간의 손으로 조작 터치 유도에 대 한 요구 사항 thigmomorphogenesis 및 힘 강도 오류 사람의 손터치와 관련이 있습니다. 식물 유기체에 대한 외부 하중의 효율성을 향상시키기 위해 자동 터치 포스 로딩 기계가 제작되었습니다. 이 로봇 팔 구동 헤어 브러시 터치는 노동력을 절약하고 쉽게 반복 할 수있는 터치 포스 시뮬레이션, 무제한 터치 반복 및 조정 가능한 터치 강도를 제공합니다. 이 모발 터치 포스 로딩 기계는 터치 포스 신호 돌연변이의 대규모 스크리닝과 식물 의 회모 형성의 페노믹스 연구에 모두 사용될 수 있다. 또한, 인간의 머리카락과 같은 터치 재료는 동물 털, 실크 스레드 및 면섬유와 같은 다른 천연 재료로 대체 될 수 있습니다. 기계의 자동 이동 암에는 각각 빗방울과 바람의 자연적인 힘을 모방하기 위해 물을 뿌리는 노즐과 에어 블로어가 장착 될 수 있습니다. 이 자동 헤어 터치 포스 로딩 기계를 손으로 수행 된 면봉 터치와 결합하여, 우리는 두 개의 힘 신호 돌연변이, MAP KINASE KINASE 1 (MKK1) 및 MKK2 식물의 터치 응답을 조사했습니다. . 접촉력 로드 야생형 식물 및 2개의 돌연변이체의 현상을 통계적으로 평가하였다. 그들은 터치 응답에 상당한 차이를 나타냈다.
Introduction
식물 티그모모포제네시스는 1973년 MJ자페에 의해 만들어진용어이다. 그것은 식물 tropism하지만 햇빛이나 중력의 자극에 의해 발생하는 잘 알려진 포토로피즘 또는중력과 는 다른 2,3. 그것은 주기적인 기계적인 자극과 관련되었던 표현형 변경을 기술합니다, 이전 시간4,5에서식물학자에 의해 빈번히 관찰되었습니다. 빗방울, 바람, 식물, 동물 및 인간의 손길, 심지어 동물물림조차도 식물4,5에서힘 신호를 유발하는 메카노 자극의 상이한 유형으로 간주된다. 식물 의 특징은 볼팅의 지연을 포함, 짧은 줄기, 초본 식물에서 작은 장미 / 잎 크기, 우디 식물두꺼운 줄기6,7,8. 이것은 미모사 식물 또는 다른 메카노에 민감한 덩굴에서 흔히 발견되는 티그모나스틱 또는 티그모트로픽 반응과는달리, 이러한 빠른 터치 반응이 관찰되기 쉬운 1,9,10. 반면, 티그모모포제네시스는 성장 반응이 느리기 때문에 관찰하기가 상대적으로 어렵다. Thigmomorphogenesis는 일반적으로 연속적인 힘 하중 자극의 주 또는 년 다음 에 따라 관찰됩니다. 식물 터치 반응의 이 독특한 특성은 강력한 방식으로 터치 포스 신호 내성 돌연변이를 격리하기 위해 인간의 손 터치 자극을 사용하여 전방 유전 스크린을 수행하기 어렵게 만든다.
지난 6일, 6, 11, 분자 및 세포 생물학적 실험이 수행되어 온 힘 신호 전이 경로 및 분자 기전을 해명하기 위해, 11, 12,13,14. 이러한 연구는 식물력 신호 수용체가 주로 메카노민성 이온 채널(MSC)과 막 스패니어 단백질의 다중 복합체로 구성된 테더드 MSC 복합체로 구성된다는 것을 제안했습니다11,14 , 15. 세포질 Ca2+ 과도 스파이크는 초기 터치의 초 이내에 생성. 바람, 비, 또는 그라비 자극은 핵 이벤트14,16,17,18에힘 신호를 변환하기 위해 다운스트림 칼슘 센서와 상호 작용할 수 있다. 분자 및 세포 연구 이외에, 식물의 수동 손가락 접촉을 가진 전방 유전 스크린은 식물 호르몬 및 이차 대사 산물이 다음의 결과적인 터치 유도성 (TCH) 유전자 발현에 관여한다는 것을 것을을 발견했습니다 터치 포스 로딩13,19. 예를 들어, aos 및 opr320 돌연변이체는 유전 학원으로부터 지금까지 확인되었습니다. 그러나, thigmomorphogenesis의 연구 결과에 있는 전방 유전학의 응용과 관련되었던 중요한 문제점은 아직도 접촉 반응의 수준을 양량화하고 유전으로 돌연변이된의 큰 인구를 만지기 위하여 요구된 집중적인 노동입니다 개별 식물. 시간 소모적인 문제는 또한 손 만지기 기반 돌연변이화면(14,20)에서지속된다. 예를 들어, 터치 포스 자극의 한 라운드를 완료하려면, 사람은 개별 식물에 30-60 번 (초당 원터치)을 터치해야합니다. 통계적 표현형 분석을 위한 충분한 수의 식물을 갖기 위해서는, 동일한 유전자형의 20-50개의 개별 식물이 일반적으로 터치 포스 로딩 공정에 필요합니다. 이 터치 포스 로딩 정권은 사람이 반복적으로 선택의 한 유전자형에 600-3,000 터치를 수행 할 필요가 있음을 의미한다. 이 유형의 터치는 일반적으로 식물의 유전자 형 당 하루에 약 1,800-15,000 손가락 또는 면봉 터치와 같은 하루에 3 ~ 5 라운드를 반복해야합니다. 잘 훈련 된 사람은 일반적으로 힘과 강도의 큰 변화를 피하기 위해 하루에 반복의 많은 라운드를 통해 바람직한 범위 내에서 여러 접촉의 강도와 힘을 유지하는 데 필요합니다. 티그모모포제네시스는 포화및 투여량 의존적 과정6,21,터치력/강도가 식물의 터치 반응을 촉발시키는 데 성공하는 데 매우 중요한 것으로 알려져 있다.
사람에 의존하는 터치 포스 하중을 제거하고 허용 가능한 오차 범위14내에서 기계적 적용을 유지하기 위해 수동 조작 된 터치를 대체하는 자동 터치 포스 로딩 기계를 설계했습니다. 이 기계에는 4 개의 움직이는 팔이 내장되어 있으며, 각 팔에는 하나의 인간 헤어 브러시가 장착되어 있습니다. 이 버전은 인간의 머리카락 터치 힘 하중의 기능을 지정하기 위해 모델 K1이라는 이름입니다. 4개의 유전자형이 1개의 기계의 밑에 그들의 thigmomorphogenesis 또는 접촉 반응을 위해 정량적으로 측정되는 경우에, 유전자형 당 40-48명의 개별은 측정될 수 있습니다. 각 터치 반복(식물당 60회 미만의 터치)은 움직이는 속도 조절식 로봇 팔을 사용하여 5분 미만지속됩니다. 따라서 Model K1 터치 머신의 플랜트는 처음에 프로그래밍된 대로 일정한 터치 포스 로딩 또는 다양한 강도 레벨로 하루에 여러 라운드를 기계적으로 자극할 수 있습니다.
애기장대,모델 식물 유기체, 따라서 전자동 헤어 터치 포스 로딩 기계 응용 프로그램을 테스트하기위한 대상 식물 종으로 선택되었다. 돌연변이의 다양한 세균과 꽃의 크기를 검색 할 수있는 여러 개의 큰 종자 은행이 있기 때문에, 애기장은 모델 K1 터치 기계와 함께 장착 성장 선반에서 사용할 수있는 공간에 잘 맞는.
Model K1 자동 터치 머신은 (1) 벨트 구동 선형 액추에이터 2개로 구성된 H자형 금속 랙, (2) 헤어 브러시가 장착된 로봇 금속 암, (3) 컨트롤러의 세 가지 주요 구성 요소로 구성됩니다. 맞춤형 모델 K1 터치 머신의 경우 각 X/Y 축 모듈은 벨트 구동 가이드 레일 1개, 슬라이드 블록 2개(빨간색) 및 57스테퍼 모터 1개(사전 설치 및 분리 가능)로 구성됩니다(그림1A, B). 상부 수평 액추에이터는 로봇 금속 암이 좌우로 수평으로 움직일 수 있게 해주며, 하부 수직 벨트 구동 선형 액추에이터는 로봇 금속 암이 수직으로 위아래로 움직일 수 있게 합니다(그림1B, 그림 2AA) ). 4개의 분리가능한 로봇 암이 수직 액추에이터에 설치되었다(그림1C, 도 2B). 4개의 인간 모발 브러쉬는 각각 4개의 로봇 팔에 결합되었다(도1C, 도 2B). 모델 K1 터치 머신을 아래 굵게 표시된 글꼴로 구성하는 모든 기계 부품은 그림 1C에 표시됩니다(재질 표참조).
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Protocol
1. 종자 준비
참고: 야생형(Col-0)의 애기장대 종자뿐만 아니라 MKk1 및 mkk2 기능 상실 돌연변이체는 애기장대 생물자원센터(ABRC, https://www.arabidopsis.org, Columbus, OH)로부터 구입하였다.
- 신뢰할 수 있는 통계 분석을 위해 각 유전자형의 얼마나 많은 식물 개인을 사용할지 계산합니다. 각 라인의 발아 속도에 따라 충분한 수의 씨앗을 준비하십시오( 일반적으로 실험에 필요한 것보다 4-5 배 더 많은 시간). 터치 응답 분석에 사용할 수 있는 건강하고 균일한 크기의 식물의 수를 충분히 보장합니다. 이 프로토콜에 따르면, 유전자형 당 300-500 씨앗은 일반적으로 비슷한 크기의 80-90 식물을 생산하는 데 사용됩니다.
- 차가운 물에 씨앗을 담그고 4 °C (알루미늄 호일로 덮여 서 어둡게 유지)에 저장하여 종자 침폐를 하십시오. 씨앗을 뿌리고 5-7 일 후에 심미를 뿌린후.
2. 식물 성장
- 식물 성장에 적합한 토양을 선택합니다(재료 표참조). 큰 덩어리를 피하고 균일하게 섞는다.
- 24 플라스틱 컵 준비 : 보유 용량은 207 mL이며 상부 림 직경은 7.4 cm입니다. 관개 목적으로 컵 바닥에 세 개의 둥근 구멍을 뚫습니다.
- 혼합 토양이 플라스틱 컵을 채웁니다. 컵 테두리보다 1-2cm 더 높은 토양을 쌓아 놓고 쌓인 토양의 표면을 부드럽게 평평하게 합니다.
- 24컵을 플라스틱 트레이(21인치 x 10.8인치 x 2.5인치)에 옮기고 트레이를 일정한 조명 조건(아래 참조)에 놓습니다.
- 씨앗 파종 하기 2 시간 전에 각 트레이에 물 2.5 L을 추가 합니다. 토양이 컵의 바닥에있는 구멍에서 물을 흡수하고 컵 림 수준으로 떨어질 토양의 표면을 기다립니다.
- 한 자리에 3-4 씨앗을 뿌리고, 컵 안에 4 개의 고르게 분포된 반점을 뿌림.
- 각 트레이 위에 투명한 플라스틱 커버를 놓고 씨앗을 일주일 동안 발아시십시오. 그런 다음 덮개를 제거하고 모종을 다른 주 동안 자라고 합니다.
- 숱이 에 의해 여분의 식물을 제거하고 유지 4 각 컵에 비슷한 크기의 식물 개인 9-10 종자 파종 후 일.
- 씨앗이 발아 한 후 격일로 1.5 L의 물로 식물을 관개하십시오.
3. 성장 상태
- 성장 챔버의 온도를 23.5 ±1.5 °C로 설정하고 35 ~45 %의 습도를 설정합니다.
- 180 및 240 μE∙m-2∙s-1 사이의 광 강도를 설정 (IL 1700 연구 방사계, 국제 빛에 의해 측정)14. 광합성 활성 방사선은 90~120μE∙m-2∙s-1이다.
- 라이트 조건을 24시간 상수로 설정합니다.
4. 터치 포스 로딩 기계의 건설
참고 : 이 로봇 헤어 터치 포스 로딩 기계 (모델 K1)는 터치 포스 신호 돌연변이 스크리닝 및식물 의 시그모모포제생성 을 모두 목적으로 설계되었습니다 (그림 1, 그림2).
- 사전 설치 모듈(분리 가능, 그림 1C)
- X/Y 축 가이드 레일 모듈(III/V)에슬라이드 블록 2개(I)와 57스테퍼 모터(II) 1개를 설치합니다.
- X/Y축 보조 거더(IV/VI)에두 개의 슬라이드 블록(I)을 설치합니다.
- 기타 기계 부품 설치(그림1C)
- 가이드 레일의 각 끝에 두 개의 접합 플레이트(VII)를 조립하여 X축 가이드 레일 모듈(III) 및 X축 보조 거더(IV)를 함께 고정합니다.
- Y축 가이드 레일 모듈(V)을 두 개의 접합판(VIII)을 그 사이에 조립하여 교차 위치에서 두 개의 슬라이드 블록(X축)의 등쪽 위에 고정합니다.
- Y축 보조 거더(VI)를 다른 두 슬라이드 블록(X축)의 등쪽 위에 고정하여 그 사이에 두 개의 접합판(VIII)을 조립하여 교차 위치에 놓습니다.
- 로봇 암(IX)의 홀더를 접합판이 있는 교차 위치에서 두 개의 슬라이드 블록(Y축)의 전면에 조립합니다(그림2A).
- 4개의 헤어 브러쉬(X)를 클램프로 로봇 암(IX)에 조립합니다(그림2B).
5. 터치 포스 로딩 기계 설정
참고: 모델 K1 터치 머신을 아래 굵게 표시된 글꼴로 설정하는 모든 제어 매개 변수는 제어 판넬에 표시됩니다(그림2F).
- 터치 헤어 브러시를 로봇 팔에 설치합니다. 330mm 길이의 강철 눈금자를 홀더로 사용하여 사람의 머리카락 한 겹(3,600-4,600개의 머리카락/브러시)을 균등하게 고정합니다. 머리카락의 길이는 126mm입니다 (그림1C).
- 두 개의 금속 클램프로 로봇 팔에 강철 눈금자를 고정합니다.
- 수직 치수(Y축)를 따라 기계 암의 높이를 먼저 설정합니다. 조그 F+를 눌러 높이고 조그 R-를 눌러 로봇 팔과 브러시를 낮춥춥습니다. 머리 끝을 컵 테두리보다 0.5cm 낮게 브러쉬합니다. 제로 세트를누릅니다. 기계 1-2 사이클을 미리 실행하여 모든 식물 개인이 만지고 있는지 확인하십시오. 브러쉬와 헤어 팁을 전체 터치 기간 동안 매일 같은 높이로 조정하고 보정합니다.
- 전자 스케일을 사용하여 터치 력(수직 하중)을 측정하고 1-2 mN14에서터치 력 레벨을 유지합니다.
- 수평 치수(X축)를 따라 기계 암의 시작 위치를 수동으로 설정합니다. 헤어 브러쉬가 각 트레이의 가장자리에 매달려 있는지 확인하고 만지는 실험이 시작되기 전에 식물이 만지지 않도록 하십시오. 조그 F+/조그 R-를 눌러 기계 암을 수평으로 조금씩 움직여 시작 위치를 설정합니다.
- 이동 버튼을 눌러 머리 브러시 이동 거리를 수평 치수(X축)에서 365mm로 설정합니다. 프레스 Inc. F + /Inc. R-전체 이동 거리를 얻고 처리 된 식물의 모든 전체 터치 실험 중에 만지고 있는지 확인하기 위해 기계 팔을 이동합니다.
- 자동 속도 버튼을 눌러 기계 암의 X축을 따라 이동 속도를 5,000mm/min로 설정합니다. 전체 터치 실험 중에 동일한 이동 속도를 유지합니다.
- 마이너 사이클 버튼을 눌러 20 번의 시험에서 터치 시간을 설정합니다. 전체 터치 실험 중에 라운드당 동일한 횟수를 유지합니다.
주: 하나의 마이너 사이클은 두 개의 이동 거리와 같으며, 이는 기계 암이 시작 위치에서 끝 위치로 이동한 다음 다시 시작 위치로 이동한다는 것을 의미합니다. 하나의 사소한 주기는 두 개의 터치를 생성합니다. 헤어 브러쉬는 20번의 시험 에서 식물을 40 번 만집니다 (2 터치 x 20 번의 시험 = 40 터치). 40터치는 터치 포스 로딩의 한 라운드로 정의됩니다. - 메이저 피리어드 버튼을 눌러 터치 라운드의 반복 간격을 하루 480분으로 설정합니다. 전체 터치 실험 중에 터치 라운드의 주파수를 동일하게 유지합니다.
참고 : 이것은 헤어 브러시가 하루에 3 라운드 동안 식물을 터치 할 수 있으며, 각 라운드 사이의 간격 시간은 480 분 (8 시간)입니다. 표시된 파란색 숫자는 각 터치 라운드의 간격 시간을 의미합니다. 아래 카운트 다운 (빨간색 번호)가 0000으로 바뀌면 기기가 자동으로 새로운 터치 라운드를 시작합니다. - 12번의 시험에서 주요 주기를 설정하면 기계가 4일 이내에 12회 동안 식물을 자동으로 만질 수 있습니다. 12 개의 시험의이 설정은 만지는 하루를 건너 뛰는 인간의 실수를 피하기 위해 사용됩니다.
- 시작 버튼을 눌러 미리 설정된 프로그램을 시작합니다. 모델 K1 터치 머신은 설정에 따라 터치 포스 로딩을 자동으로 수행합니다.
6. 생리학적 데이터 수집 및 분석
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볼팅일: 감동적인 실험에서 각 플랜트의 볼트 일을 개별적으로 기록합니다. 볼팅은 식물이 식물 단계에서 생식 단계로 성장 단계를 변경하는 상징이다. 애기장대에서 볼팅 데이는 식물이 첫 번째 꽃줄기를 가지고 사용하는 일수로 정의됩니다 길이가 1cm에 도달합니다.
참고 : 위에서 설명한 성장 조건하에서 야생 형 식물의 볼트는 일반적으로 종자 파종 후 19 일에서 23 일까지 시작되고 28-32 일에 끝납니다. -
로제트 반경: 로제트 중심에서 가장 긴 잎의 끝까지의 거리를 측정합니다.
- 상단에서 전체 트레이의 사진을 찍습니다. 대조군과 터치 처리된 그룹의 사진을 따로 찍는다.
- 적절한 소프트웨어를 다운로드합니다. 예를 들어 무료로 다운로드한 소프트웨어 ImageJ(https://imagej.nih.gov/ij/download.html)를 사용합니다.
- 사진 파일을 열고 확대/축소 기능을 사용하여 사진을 적절한 크기로 확대합니다.
- 직선 도구를 선택하여 로제트 중심과 가장 긴 잎의 끝 사이에 직선을 그려 로제트 반경을 측정합니다.
- 하나의 식물을 선택하고 왼쪽 버튼을 눌러 로제트 중심에서 가장 긴 잎 끝까지 직선을 그립니다.
- 분석-측정 기능을 선택하거나 Ctrl + M을 눌러 선 거리를 분석합니다.
- 한 컵을 선택하고 앞의 두 단계를 반복하여 각 플라스틱 컵의 직경을 동시에 분석합니다. 이러한 데이터를 사용하여 계산을 수행하여 사진 촬영으로 인한 바이어스를 제거합니다.
참고: 방정식은 다음과 같은 것입니다.
Ra/Da = R m/Dm
(Ra, 식물의 실제 로제트 반경; Da, 플라스틱 컵의 실제 직경; Rm, 소프트웨어에 의해 결정된 동일한 식물의 측정된 로제트 반경; Dm, 동일한 식물을 재배하는 데 사용되는 플라스틱 컵의 측정 직경)
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로제트 영역: 장미 잎의 수평 2 차원 표면적을 측정합니다.
- 로제트 기관의 나머지 부분에 영향을 주지 않고 꽃을 제거하십시오.
- 각 식물의 꼭대기에서 근처에 배치 된 스케일 눈금과 함께 사진을 찍습니다.
- ImageJ, 로제트 트래커의 하나의 무료 플러그인을 사용하고 이전에 게시 된 프로토콜을 따르십시오22.
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Representative Results
자동 헤어 터치 포스 로딩 기계
식물의 형태학적 변화를 관찰하기 위해 재현 가능한 성장 조건과 치료 방법은 반복 가능한 결과를 얻는 데 핵심적인 것입니다. 이 고처리량 및 자동 터치 포스 신호 돌연변이 스크리닝은 새로 구축된 헤어 터치포스 로딩 머신인 Model K1(그림 1, 그림2)에 의해 달성된다. 이 헤어 브러쉬는 최대 4 개의 식물 트레이를 동시에 만질 수 있습니다. 트레이에 24 컵이 놓여 있었고, 대조군과 처리된 식물로 사용되는 그룹에서 12 컵의 식물이 있었습니다(그림2C,D). 각 컵에, 4 개의 식물을 재배 하 고 총 48 이하 식물 개인 같은 머리 브러시에 의해 감동 했다, 나중에 통계 분석을 위한 충분 한 식물을 보장. 하나의 Model K1 터치 머신에서 최대 4개의 유전자형을 동시에 터치처리할 수 있습니다. 핵심 포인트 중 하나는 터치 머신 팔 / 머리 높이의 설정입니다. 식물 로제트 잎 위치에 대하여 다른 머리 위치는 완전히 다른 thigmomorphogenesis 결과를 생성할 수 있는 다른 접촉 힘을 생성합니다. 우리의 실험에서, 모발의 식물 접촉 팁은 컵 림(도2E)보다 0.5 cm 낮게 배치되어야 하며, 이는 이전에 발표된 터치포스(14)와유사한 힘을 생성한다. 터치 패널에 설치된 프로그래밍 가능한 컨트롤러는 전체 터치 포스 로딩 머신을 제어하는 데 사용됩니다(그림2F, 재료 표참조).
두 가지 터치 방법의 비교
이러한 자동 기계 구동 모발 방법을 기존의 수동 면봉 접촉 방법과 비교하기 위해, Col-0에서 두 가지 독립적인 실험을 수행하였다(그림 3). 면봉 터치 그룹에서 12 일 된 식물에서 만지기 시작 했습니다. 각 라운드는 40 터치 (1 터치 / s)를했다. 총 3라운드가 매일 수행되었다(그림3A). 연속면봉터치 처리 후 볼트에 1.7일간의 지연을 보였다(22.1±0.2 일 대 23.8±0.2일). 마찬가지로, 자동 기계 구동 헤어 터치의 경우, 14일 된 식물에서 시작된 터치 포스 하중과 40회 터치(3분 이내)를 라운드에 적용했습니다. 총 3회 터치가 정확히 8시간의 간격으로 하루에 수행되었다(그림3B). Col-0 식물에 대해 지연된 볼트가 관찰되었다. 평균 볼트 시간은 23.0±0.3일이었고, 모델 K1 터치 머신 처리 플랜트의 볼트 시간은 24.7±0.2일이었다. 제어 및 터치 처리 플랜트 간의 차이는 결과적으로 일변량 Cox 비례 위험 모델로 분석되었습니다. 0.31(면봉 터치)과 0.52(기계 구동 헤어 터치)의 예상 위험비율(HR)을각각 제공하였고,(그림 3C) 이는 만진군에 있는 식물의 볼트 위험/확률이 31%와 52%임을 의미합니다. 대조군에 있는 식물을 각각. 이는 면봉으로 수동 접촉이든 자동 모발 터치인지에 관계없이 손길이 닿지 않은 대조군 식물의 식물에 비해 만진 야생형 식물의 볼트 가 거의 절반 정도임을 나타냅니다.
다른 터치 돌연변이에 대한 미래의 결과
최근 예비 자료에 따르면 MKK1과 MKK2는 애기장의 터치 반응에 중요한 역할을 할 수 있습니다14. 우리는 이 2개의 돌연변이체를 선택하고 자동 모발 터치포스 로딩 머신을 사용하여 이러한가설 터치 반응 돌연변이체에 대한 터치 실험을 수행하였다(도 4,표1). 야생형 대조군 식물은 T-DNA 삽입 돌연변이체에서 이러한 볼팅 지연이 관찰되지 않은 반면, 이전 보고서14와 마찬가지로 볼트 지연(24.1±0.3일 대 25.9±0.2일) 1.8일을 보였으며, mkk1(24.6±0.2)에서 볼팅 지연이 관찰되지 않았다. 일 대 24.4 ± 0.3 일, 도 4B 및 표 1)및 mkk2 (23.9 ± 0.1 일 대 24.2 ± 0.2 일, 도 4C 및 표 1). 이러한 데이터를 일변량 Cox 비례 위험 모델로 분석하여 야생 형 Col-0만이 0.41의 추정 HR을 가진 대조군과 만진 식물 사이에 유의한 차이를 보였다(그림4D). 이러한 터치-포스 로딩 실험은 mkk1 및 mkk2 돌연변이체가 터치 응답 돌연변이체임을 입증하였다.
다른 형태학적 인덱스의 측정
티그모모포제네시스와 관련된 형태학적 변화는 볼팅의 지연에 한정되지 않는다. 줄기가 짧고 로제트 잎 크기도 6, 7,9,14의성분이다. 따라서 터치 응답, 로제트 반지름/잎 길이 및 로제트(투영) 영역(그림 5)의 형태학적 인덱스에 대한 두 가지 추가 측정 유형을 여기에서 보고했습니다. 이전에 관찰된 표현형 변화와 유사하게, 야생형 Col-0 식물은 3일 동안 일정하고 반복적인 자동 기계 구동 모발 접촉(1.77±0.05 cm 대 1.50±0.04) 후 훨씬 더 작은 로제트 반경과 짧은 잎 길이를 보였다. cm, 그림 5A)를 참조하십시오. 돌출된 로제트 영역은 20.32±0.53 cm2에서 16.19±0.48 cm2로 13일 후에 변경되었다(도5B). mkk1과 mkk2 모두 로제트 반경과 면적이 비슷했습니다. 이러한 데이터를 종합해 볼 때 MKK1과 MKK2 단백질은 애기장대의 볼트 지연에 중요하며 로제트 크기와 로제트 영역을 형성하는 데 필요하지 않다는 것을 보여주었습니다.
통계 분석
그림 2 와 그림 3에 표시된 상자 와 수염 플롯및 그림5에 표시된 열 차트에 관해서는, 통계적 유의는 두 꼬리 학생의 t-test로 분석되었으며, 의유는 *** 및 n.s.p로 나타낸다. 각각 0.001 및 p > 0.05. 도 2 및 도3에 도시된 카플란-마이어 플롯의 경우, 일변량 Cox 위험 분석은 볼트 이벤트23,24에대한 터치 처리의 효과를 분석하는 데 사용되었다. 위험 비율(HR), 95% 신뢰 구간(95% CI) 및 p 값은 아래 표에서 제공됩니다. 예를 들어, HR = 0.5는 특정 일에 접촉된 그룹의 식물의 볼트 위험/확률이 대조군의 식물과 비교하여 0.5 또는 50%였다는 것을 의미합니다.
그림 1 . 자동 헤어 터치 포스 로딩 기계의 구성 및 매개 변수. (A) 선형 액추에이터의 기본 회로도입니다. 왼쪽 위 패널은 측면 보기이고 왼쪽 아래 패널은 등쪽 보기입니다. X축 모듈과 Y축 모듈의 총 길이는 각각 843mm와 1,038mm입니다. 각 기본 X/Y 모듈은 가이드 레일 1개, 슬라이드 블록 1개, 스테퍼 모터 1개(사전 설치 및 분리 가능)로 구성됩니다. 맞춤형 모델 K1 터치 머신의 경우 각 X/Y 모듈은 두 개의 슬라이드 블록(빨간색)으로 구성됩니다. X 모듈의 접합판이 56mm에서 100mm로 확대되어 더 나은 연결과 지원을 제공합니다. 오른쪽 위 패널은 가이드 레일의 단면이고 오른쪽 아래 패널은 57 스테퍼 모터입니다. (B) 구성된 이중 X축 및 이중 Y축 선형 액추에이터의 회로도. 이것은 터치 포스 로딩 기계의 주요 부분입니다. 왼쪽 아래 패널은 구성된 선형 액추에이터의 등쪽 뷰입니다. 왼쪽 위 패널은 X축 모듈(843mm)의 측면 도면입니다. 중간 패널은 Y축 모듈(1,038mm)의 측면 도면입니다. 오른쪽 상단 패널은 Y 모듈과 Y 보조 거더의 4 개의 슬라이드 블록의 등쪽보기입니다. 오른쪽 아래 패널은 X 모듈의 접합판의 등쪽 보기입니다. (C) 기계 부품 어셈블리의 순서도입니다. 그림에 다른 부품이 표시되고 이름이 지정됩니다. 상세한 조립 공정은 프로토콜에 기재되었다. 표시된 단위는 이 수치가 mm입니다.
그림 2 . 자동 헤어 터치 포스 로딩 기계의 전반적인 디자인. (A) 완성 된 모델 K1 터치 머신. 사진은 정면에서 찍은 것입니다. 상부 선형 액추에이터는 수평으로 움직이는 로봇 암을 제어하고 하부 선형 액추에이터는 수직으로 움직이는 로봇 암을 제어합니다. (B) 분리 가능한 로봇 팔을 보여주는 측면 보기입니다. 머리카락 브러쉬는 로봇 팔에 고정되었습니다. (C와D) 인간의 머리카락이 식물에 닿는 모습을 담은 사진은 앞면과 측면에서 각각 찍은 것입니다. (E) 컵 테두리에 대해 헤어 브러시의 높이를 설정하는 방법을 보여주는 측면 보기입니다. 기계 팔과 헤어 브러시가 모두 표시됩니다. (F) 모델 K1 터치 머신의 작동 인터페이스입니다. 터치 패널(MT6070i)에 연결된 프로그래밍 가능한 컨트롤러(AFPX-C30T)가 전체 기계를 제어하는 데 사용됩니다. 자세한 설정 및 운영 절차는 프로토콜에 설명되어 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 . 두 가지 터치 방법의 효과를 비교하여 티그모모포제네시스. (A-B)수동 면봉 터치 (A)와 인간의 머리 터치를 각각 자동 터치 포스 로딩 기계 (B)에 의해 구동 비교. 상자와 수염 플롯은 왼쪽 패널에 표시되어 컨트롤 그룹과 터치 그룹 간의 평균 볼트 일의 비교를 보여줍니다. 평균 ± SE가 도시된다. 통계 분석은 학생의 t-시험에 의해 수행되었다. p < 0.001의 유의는 ***로 표시됩니다. 카플란 마이어 플롯은 성장 시간 (파종 후 일)에 걸쳐 볼트 식물의 비율인 중간에 표시됩니다. 오른쪽 패널은 볼트 시간과 꽃줄기 높이의 차이를 보여주는 손길이 닿지 않은 제어 및 만진 식물의 대표 개인을 보여줍니다. (C) 요약표: 대조군 및 접촉된 열의 숫자 숫자는 통계 분석에 사용되는 식물 번호입니다. 위험 비율(HR), 95% 신뢰 구간(95% CI) 및 단변량 Cox 위험 분석 섹션의 p 값이 제공됩니다. 접촉된 그룹의 식물의 볼트 위험과 확률은 손길이 닿지 않은 그룹에 비해 각각 31%와 52%였습니다. 일변량 Cox 위험 분석은 SPSS에 의해 추정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 . mkk1 및 mkk2 돌연변이체뿐만 아니라 야생형 식물(Col-0)의티그모모포제네시스는 자동 모발 터치에 의해 유도된다. (A-C)자동 터치 포스 로딩 기계에 의해 구동 되는 인간의 머리 접촉의 반복을 통해 생성 된 Col-0 (A), mkk1 (B) 및 mkk2 (C)의 장래 터치 응답. 상자와 수염 플롯은 컨트롤 그룹과 터치 그룹 간의 평균 볼트 일을 비교하는 왼쪽 패널에 표시됩니다. 평균 ± SE가 도시된다. 통계 분석은 학생의 t-시험에 의해 수행되었다. ***와 n.s.는 각각 p< 0.001 및 p> 0.05를나타낸다. 카플란 마이어 플롯은 성장 기간 동안 볼트 식물의 비율입니다 중간에 표시됩니다 (파종 후 일). 오른쪽 패널에는 손길이 닿지 않은 컨트롤의 대표개인과 볼트 차이를 보여주는 만진 식물이 표시됩니다. mkk1 (B) 및 mkk2 (C)의 데이터는 각각 2 및 3 개의 생물학적 복제물에서 컴파일되었습니다. 각 복제에 사용된 상세한 식물 번호는 표1에 나타내졌습니다. (D) 요약표: 제어 및 터치 컬럼 아래의 숫자는 각각 이 두 그룹에서 사용/분석된 식물 번호였다. 단변량 Cox 위험 분석 섹션에서 HR, 95% CI 및 p 값이 제공되었습니다. 접촉된 군에서 야생형 식물의 볼트 위험/확률은 대조군과 비교하여 41%이다. 일변량 Cox 위험 분석은 SPSS에 의해 추정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5 . 로제트 반경 및 티그모모포제네시스를 정의하기 위한 면적 측정. (A-B)야생형의 로제트 반경과 로제트 면적을 종자 파종 후 17일째와 27일째에 각각 측정하였다. 왼쪽 위 패널에 표시된 막대는 각각 대조군과 터치그룹 사이의 로제트 반경 또는 로제트 영역의 비교이다. 평균 ± SE가 도시된다. 통계 분석은 학생의 t-시험에 의해 수행되었다; p & 0.001. 오른쪽 상단 패널에 표시된 사진은 대표적인 개별 식물입니다. 아래 요약된 표는 대조군 및 접촉군에서 분석된 식물 수를 보여 준다. 17일의 로제트 반경(cm)과 27일의 로제트 면적(cm2)도 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
표 1. 다른 생물학적 복제의 볼트 데이터. 요약된 표에는 mkk1의 생물학적 복제물 2개와 mkk2의3개의 생물학적 복제가 포함되어 있습니다.
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Discussion
Thigmomorphogenesis는 기계적인 섭동을 향해 복잡한 식물 성장 반응입니다, 이는 세포 신호 및 식물 호르몬의 활동의 네트워크를 관련시킵니다. 바람직하지 않은 환경 조건25,26에서살아남기 위해 식물의 적응 진화의 결과입니다. 기계적 터치, 특히 인간의 손가락 터치 와 핸드 헬드 면봉 터치, 이전의 thigmomorphogenetic 연구14,20에서이러한 형태 학적 변화를 연구하기 위해 선택되었다. 플랜트 터치 응답을 트리거하는 이 단순화된 터치 포스 로딩 버전은 제어및 적용이 더 쉽습니다. 또한, 이러한 유형의 터치-포스 로딩 방법은 자연환경(19)에서생성된 바람 및 비-낙하 자극된 힘 신호를 어떤 식으로든 모방할 수 있다. 터치력은 칼슘 스파이크를 유발하고, 단백질 인산화(14)를 유도하고, 하류 유전자 발현을 중재하는 터치 반응(19)을 유발할 수 있다. 마찬가지로, 자동 움직이는 팔에 장착된 인간의 모발 브러시는 인간의 손으로 조작한 터치를 모방하여 식물 터치 반응을 생성할 수도 있습니다. 힘 응용 의 종류를 다양화하기 위해, 물 뿌리는 노즐 및 / 또는 바람 송풍기는 또한 기계의 로봇팔에 설치하고 생리 실험에 사용할 수 있습니다 (그림 2). 독특한 특징은 형태 유전학 및 생리학적 연구에서 자동 기계력 로딩 기계를 보다 다재다능하게 만듭니다. 이 자동 기계력 로딩 기계의 가장 큰 장점은 아마도 노동이 없고 반복 가능하며 시간 절약 기능으로, 많은 수의 돌연변이 체형 선택을 가능한 돌연변이 체형으로 수행할 수 있습니다. Model K1 터치 머신은 사람의 손으로 조작한 몇 시간 동안의 터치와 는 달리 다양한 돌연변이를 동시에 터치하고 3~5분 내에 터치라운드를 완료할 수 있습니다. 터치 라운드의 시간 프레임은 주로 치료 시작 시 프로그램 설정에 따라 달라집니다. 각 개별 플랜트가 한 라운드에서 40회 만질 경우 Model K1 기계는 하루 만에 3회 터치 처리를 완료하는 데 9-15분밖에 필요하지 않습니다. 각 터치 라운드 사이의 간격 시간은 정밀하게 제어 할 수 있습니다; 인간이 그러한 정밀도를 달성할 가능성은 적습니다.
터치 처리에 관한 또 다른 중요한 문제는 식물 성장 단계에 터치 력을 적용해야 하는 것입니다. 우리의 사례에서, 만지는 이 3개의 유전자형의 성장 속도가 유사하기 때문에 야생 모형 및 2개의 돌연변이둘 다에 대한 종자 파종 후에 14 일 시작했습니다. 야생 형에서 개발 시간에 상당한 차이가 그 돌연변이에 대 한, 하나는 접촉을 시작 하는 다른 초기 일을 선택할 수 있습니다. 다중 비교를 위해 야생 형 식물과 돌연변이체의 볼트 데이터에 대한 단방향 ANOVA 테스트를 수행하면14도움이 될 수 있습니다. 이 통계 분석은 유전자형에 의해 생성된 볼팅 시간의 차이에 대한 적절한 결론을 제공할 수 있습니다. 이 경우 다변량 Cox 비례 위험 해석을 사용하여 두 가지 변수 매개변수를 고려해야 합니다.
Model K1 터치 머신에 장착된 사람의 머리카락의 터치력 레벨을 설정하기 위해 헤어 브러시의 높이(수직 힘)와 속도(수평 힘)를 모두 조정했습니다(그림2E). 올바른 설정은 전자 스케일에 배치 된 애기장대 공장에서 힘 수준 테스트의 많은 라운드에서 수집 된 예비 데이터를 기반으로 결정되었다. 우리가 발견한 바와 같이, 전체 터치 반응 실험을 통해 모발 높이와 속도를 모두 변함없이 유지하면 애기장대 라인에 대한 복제중유사하고 일정한 치그모모포유전적 표현형을 생성할 것이다. 너무 무거운 터치 힘은 빠르게 움직이는 머리 브러시잎의 표면에 상처로 이어질 수 있기 때문에 젊은 묘목을 죽일 수 있습니다. 대조적으로, 너무 가벼운 터치 힘은 터치의 반복의 2 주 이내에 볼트의 지연을 트리거하기에 충분하지 않을 수 있습니다. 이전 실험에서, 우리는 터치 당 1-2 mN으로 적절한 터치 포스 하중을 결정했다14,19. 컵 테두리보다 0.5cm 낮은 머리 길이는 부드러운 수평 이동 속도 5000mm/min(그림2E)으로 Model K1 기계 기반 헤어 터치에서 유사한 수직 터치력을 생성하는 데 사용됩니다. Model K1 기계의 고정 된 설정은 인간의 실수로 인한 힘 강도의 변화를 줄입니다.
전반적으로, 자동 터치 포스 로딩 기계에 의해 수행 되는 머리 접촉 공장에 평균 터치 힘 하중만 제공 합니다. 적용된 정밀한 터치 포스, 특히 로드된 수평 힘은 단일 머리카락 또는 브러시의 머리카락 그룹에 대해 계산하기가 어렵습니다. 또한, 식물 형상과 줄기 높이의 차이는 수평력의 적용을 방해할 수 있다. 이러한 종류의 체력이나 스트레스를 측정하려면 머리카락이나 머리카락 그룹에 연결된 보다 정밀한 압력 센서가 필요합니다. 미래에 자동 터치 포스 로딩 기계를 개선하기 위해 보다 정밀한 압력 센서와 수학적 모델링이 적용될 것으로 여겨집니다. 온실의 빛 강도, 토양의 수분 및 온도뿐만 아니라 영양분 공급과 같은 성장 조건은 모두 터치 반응 표현형 개발에 중요한 역할을합니다. 가뭄, 90 μE∙m-2∙s-1미만의 약한 조명 상태 와 같은 스트레스 조건, 애기장대의 정상적인 성장에 영향을 줄 수 있는 더 높거나 낮은 온도는 두 야생 형의 터치 반응 측정을 방해합니다. 돌연변이.
즉, 이 자동 터치 포스 로딩 기계는 인간의 손가락 터치 및 면봉 터치보다 더 많은 노동력을 절약하고 균일한 평균 터치 포스 로딩을 제공 할 수 있습니다. 모델 K1 터치 머신은 다양한 고처리량 터치 포스 신호 돌연변이 스크리닝 및 터치 응답 분석에 적용될 것으로 예상되며, 농업 작물 또는 아마도 동물 모델중 터치 포스 로딩의 일부 수정이 있을 것으로 예상됩니다. 기계.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
이 연구는 다음과 같은 보조금에 의해 지원되었다: 31370315, 31570187, 31870231 (중국 국립 과학 재단), 16100318, 66101113, 16103114, 16103817, 16103817, AoE/M-403 홍콩의.. 저자는 주풍 정밀 및 자동화 기술 제한 (심천, 중국) 그림1에 표시된 여러 회로도의 제공에 감사드립니다 .
저자는 또한 터치 포스 로딩 기계의 개발에 기여 한 S. K. 청과 W. C. 리 에게 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4 hair brushes | customized | ||
| 4 robot arms with one holder | customized | 1000 mm length holder and 560 mm length robot arm | |
| 57 stepper motor | 57HS22-A | ||
| All purpose potting soil | Plantmate, Hong Kong | ||
| Arabidopsis plant seeds | Arabidopsis Biological Resource Centers, Columbus, OH | For arabidopsis seed purchase | |
| BIO-MIX potting substratum | Jiffy Products International BV, the Netherlands | 1000682050 | Two soils were mixed together to grow Arabidopsis. The ratio of All purpos potting soil and BIO-MIX is 1:2 |
| IL 1700 research radiometer | International Light, Newburyport, MA | The light intensity of both full-wavelength and photosynthetic active radiation can be measured. | |
| ImageJ | https://imagej.nih.gov/ij/download.html | Free downloaded software | |
| Ju Feng Precision and Automation Technology Limited | Shenzhen, China | For belt-driven linear actuators and other mechanical modules purchase | |
| Junction plate of the slide block | To fix the Y guide-rail module or Y auxiliary girder onto backs of slide blocks | ||
| Junction plate of the X axis module | customized | To connect the X guide-rail module and X auxiliary girder | |
| Slide block | |||
| WDT4045 X axis guide-rail module | 843 mm, customized | Pre-installed with two slide blocks and one 57 stepper motor | |
| WDT4045 Y axis guide-rail module | 1038 mm, customized | Pre-installed with two slide blocks and one 57 stepper motor | |
| X axis auxiliary girder | 843 mm, customized | Pre-installed with two slide blocks | |
| Y axis auxiliary girder | 1038 mm, customized | Pre-installed with two slide blocks |
References
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