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Bioengineering

Hyperpolarized के स्पिन-लेटिस विश्राम चुंबकीय क्षेत्र निर्भरता को मापने [1-13C$pyruvate

Published: September 13, 2019 doi: 10.3791/59399
Automatic Translation
1, 2, 1,2,3
1Department of Medical Biophysics, Western University, 2Imaging Research Laboratory, Robarts Research Institute, Western University, 3Ontario Institute for Cancer Research

Summary

हम 13सी समृद्ध यौगिकों के स्पिन-लेटिस विश्राम समय के चुंबकीय क्षेत्र निर्भरता को मापने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं, जो गतिशील परमाणु ध्रुवण के माध्यम से हाइपरpolarized, तेजी से क्षेत्र-चक्रित रिलैक्लोमिट्री का उपयोग करते हुए। विशेष रूप से, हम के साथ यह प्रदर्शन किया है [1-13C]pyruvate, लेकिन प्रोटोकॉल अन्य hyperpolarized substrates के लिए बढ़ाया जा सकता है.

Abstract

हाइपरpolarized 13सी समृद्ध यौगिकों के विवो इमेजिंग अनुप्रयोगों में मौलिक सीमा उनके परिमित स्पिन-लेटिस छूट बार है। विभिन्न कारक छूट दरों को प्रभावित करते हैं, जैसे बफर संरचना, समाधान पीएच, तापमान, और चुंबकीय क्षेत्र। इस अंतिम संबंध में, स्पिन-लेटिस विश्राम समय नैदानिक क्षेत्र शक्तियों पर मापा जा सकता है, लेकिन कम क्षेत्रों में, जहां इन यौगिकों polarizer से वितरित कर रहे हैं और एमआरआई करने के लिए ले जाया, छूट भी तेजी से और उपाय करने के लिए मुश्किल है। परिवहन के दौरान खो चुंबककरण की मात्रा की एक बेहतर समझ है करने के लिए, हम तेजी से क्षेत्र साइकिल आराम से मिलिएट्री का इस्तेमाल किया, चुंबकीय अनुनाद का पता लगाने के साथ 13सी नाभिक के $ 0.75 टी पर, परमाणु चुंबकीय अनुनाद फैलाव को मापने के लिए अतिध्रुवित [1-13सी]पिरुवेट का स्पिन-लेटिस विश्राम समय। विघटन गतिशील नाभिकीय ध्रुवण का उपयोग 80 mmol/L और शारीरिक पीएच ($7.8) की सांद्रता में पाइरुटेट के हाइपरपोलाइज्ड नमूने उत्पन्न करने के लिए किया गया था। इन समाधानों को तेजी से एक तेज क्षेत्र-साइकिलिंग रिसोमीटर में स्थानांतरित कर दिया गया ताकि नमूना चुंबकन की छूट को एक calibrated छोटे फ्लिप कोण (3 डिग्री-5 डिग्री) का उपयोग करके समय के एक समारोह के रूप में मापा जा सके। pyruvate केसी-1 के टी1 फैलाव नक्शा करने के लिए, हम 0.237 mT और 0.705 टी के बीच लेकर विभिन्न विश्राम क्षेत्रों के लिए डेटा दर्ज की गई। इस जानकारी के साथ, हमने चुंबकीय क्षेत्रों की उल्लिखित श्रेणी के भीतर अतिध्रुवित सब्सट्रेट के स्पिन-लेटिस विश्राम का अनुमान लगाने के लिए एक अनुभवजन्य समीकरण निर्धारित किया है। इन परिणामों के परिवहन के दौरान खो चुंबकन की मात्रा की भविष्यवाणी करने के लिए और संकेत हानि को कम करने के लिए प्रयोगात्मक डिजाइन में सुधार करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

Introduction

चुंबकीय अनुनाद स्पेक्ट्रोस्कोपिक इमेजिंग (MRSI) स्पेक्ट्रोस्कोपिक इमेजिंग द्वारा पता लगाया चयापचयों के स्थानिक नक्शे का उत्पादन कर सकते हैं, लेकिन इसके व्यावहारिक उपयोग अक्सर इसकी अपेक्षाकृत कम संवेदनशीलता द्वारा सीमित है. विवो चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग और स्पेक्ट्रोस्कोपी तरीकों में की यह कम संवेदनशीलता शरीर के तापमान और उचित चुंबकीय क्षेत्र ताकत पर प्राप्त परमाणु चुंबकन के छोटे डिग्री से उपजी है. हालांकि, इस सीमा गतिशील परमाणु ध्रुवीकरण के उपयोग से दूर किया जा सकता है (डीएनपी) बहुत तरल substrates के इन विट्रो चुंबकन बढ़ाने के लिए, जो बाद में MRSI का उपयोग कर विवो चयापचय में जांच करने के लिए इंजेक्शन कर रहे हैं1,2 , 3 , 4. डीएनपी गैर-शून्य परमाणु स्पिन के साथ अधिकांश नाभिक ों के चुंबकन को बढ़ाने में सक्षम है और इसका उपयोग 13सी-समृद्ध यौगिकों जैसे पिरुटेट5,6,बाइकार्बोनेट के विवो एमआरएसआई संवेदनशीलता में वृद्धि करने के लिए किया गया है 7,8, फ्यूरेट9, लैक्टेट10, ग्लूटामाइन11और अन्य परिमाण12के चार से अधिक आदेश . इसके अनुप्रयोगों में संवहनी रोग13,14,15, अंग परफ्यूजन13,16,17,18, कैंसर की इमेजिंग शामिल है . पता लगाना1,19,20,21,22, ट्यूमर मचान23,24, और चिकित्सीय प्रतिक्रिया की मात्रा2 , 6 , 23 , 24 , 25 , 26.

MRSI के साथ विवो का पता लगाने में धीमी गति से स्पिन-लेटिस छूट आवश्यक है। स्फूर्ति-लेटिस विश्रांस समय(ट1ै) दसियों सेकंड के क्रम पर समाधान में छोटे अणुओं के भीतर कम gyromagnetic अनुपात के साथ नाभिक के लिए संभव हो रहे हैं. कई भौतिक कारक नाभिकीय स्पिन संक्रमण तथा उसके पर्यावरण (लेटिस) के बीच ऊर्जा के अंतरण को प्रभावित करते हैं जिससे चुंबकीय क्षेत्र की शक्ति, ताप तथा आण्विक रचना27में भी छूट प्राप्त होती है। द्विध्रुवी विश्रांतनित को कार्बन स्थितियों के लिए अणुओं में कम किया जाता है, जिसमें कोई प्रोटॉन सीधे संलग्न नहीं होते हैं, और विघटन माध्यम का उत्क्रमन अंतराअणुक द्विध्रुवीय विश्राम को और कम कर सकता है। दुर्भाग्य से, deuterated सॉल्वैंट्स vivo छूट में विस्तार करने के लिए सीमित क्षमताओं है। कार्बोनिल या कार्बोक्सिलिक एसिड (जैसे पाइरुटेट) की बढ़ी हुई छूट रासायनिक पारी एनिसोट्रॉपी के कारण उच्च चुंबकीय क्षेत्र ताकत पर हो सकती है। ध्रुवीकरण के बाद विघटन के दौरान तरल पथ से paramagnetic impurities की उपस्थिति तेजी से छूट पैदा कर सकता है और से बचा या chelators का उपयोग कर समाप्त करने की आवश्यकता है.

कम क्षेत्रों में 13सी युक्त यौगिकों की छूट के लिए बहुत कम डेटा मौजूद हैं, जहां स्पिन-लेटिस छूट काफी तेजी से हो सकती है। हालांकि, यह vivo इमेजिंग में के लिए इस्तेमाल एजेंट की तैयारी के दौरान छूट को समझने के लिए कम क्षेत्रों में टी1 को मापने के लिए महत्वपूर्ण है, क्योंकि hyperpolarized विपरीत एजेंटों आमतौर पर डीएनपी उपकरण के पास या पृथ्वी पर से वितरित कर रहे हैं फ़ील्ड. अतिरिक्त भौतिक कारक जैसे 13सी-समृद्ध सब्सट्रेट एकाग्रता, समाधान पीएच, बफर और तापमान भी छूट को प्रभावित करते हैं, और इसके परिणामस्वरूप एजेंट के निर्माण पर प्रभाव पड़ता है। इन सभी कारकों डीएनपी विघटन प्रक्रिया के अनुकूलन में प्रमुख मापदंडों के निर्धारण में आवश्यक हैं, और संकेत हानि है कि इमेजिंग चुंबक के लिए डीएनपी उपकरण से नमूने के परिवहन में होता है के परिमाण की गणना.

परमाणु चुंबकीय अनुनाद फैलाव (NMRD) माप, अर्थात्, टी1 माप, चुंबकीय क्षेत्र के एक समारोह के रूप में आम तौर पर एक NMR स्पेक्ट्रोमीटर का उपयोग कर प्राप्त कर रहे हैं. इन मापों को प्राप्त करने के लिए, एक शटलिंग विधि का उपयोग किया जा सकता है जहां नमूना पहले स्पेक्ट्रोमीटर से बाहर बंद कर दिया जाता है चुंबक28,29,30 के किनारे क्षेत्र में अपनी स्थिति द्वारा निर्धारित कुछ क्षेत्र में आराम करने के लिए और फिर तेजी से अपने शेष चुंबकन को मापने के लिए एनएमआर चुंबक में वापस स्थानांतरित कर दिया। इस प्रक्रम को चुंबकीय क्षेत्र में एक ही बिंदु पर दोहराकर परंतु विश्राम की बढ़ती हुई अवधि के साथ एक विश्राम वक्र प्राप्त किया जा सकता है, जिसका विश्लेषण त1का अनुमान लगाने के लिए किया जा सकता है।

हम एक वैकल्पिक तकनीक का उपयोग करते हैं जिसे हमारे एनएमआरडी डेटा प्राप्त करने के लिए तेजी से फील्ड-साइकिलिंग रिलैक्ट्री31,32,33 के रूप में जाना जाता है। हम एक वाणिज्यिक क्षेत्र साइकिल relaxometer संशोधित किया है (सामग्री की तालिकादेखें), के लिए टी1 hyperpolarized 13सी नाभिक युक्त समाधान की माप. शटल विधि के साथ तुलना में, क्षेत्र-साइकिलिंग चुंबकीय क्षेत्र (0.25 मीटर से 1 टी) की एक छोटी रेंज पर व्यवस्थित रूप से NMRD डेटा प्राप्त करने के लिए इस relaxometer सक्षम बनाता है। यह तेजी से चुंबकीय क्षेत्र ही बदल रहा है, नहीं चुंबकीय क्षेत्र में नमूना स्थान से पूरा किया है. इसलिए, एक नमूना एक उच्च क्षेत्र की शक्ति पर magnetized किया जा सकता है, "आराम" एक कम क्षेत्र की शक्ति पर, और फिर एक निश्चित क्षेत्र में एक मुक्त प्रेरण-decay के अधिग्रहण से मापा (और Larmor आवृत्ति) संकेत को अधिकतम करने के लिए. इसका मतलब यह है कि नमूना तापमान माप के दौरान नियंत्रित किया जा सकता है, और NMR जांच पूरे चुंबकीय क्षेत्र रेंज पर स्वत: अधिग्रहण को बढ़ावा देने के प्रत्येक छूट क्षेत्र में देखते होने की जरूरत नहीं है.

वितरण और कम चुंबकीय क्षेत्र में hyperpolarized समाधान के परिवहन के प्रभाव के लिए हमारे प्रयासों पर ध्यान केंद्रित, यह काम तेजी से उपयोग कर hyperpolarized 13सी-pyruvate के स्पिन-लेटिस छूट समय को मापने के लिए एक विस्तृत पद्धति प्रस्तुत करता है 0.237 mT से 0.705 T की रेंज में चुंबकीय क्षेत्र के लिए क्षेत्र-चक्रण रिलैक्ट्री। इस पद्धति का उपयोग करने के मुख्य परिणाम पहले से प्रस्तुत किए गए हैं [1-13सी]पिरुवट34 और 13सी समृद्ध सोडियम और सीजियम बाइकार्बोनेट35 जहां कट्टरपंथी एकाग्रता और विघटन पीएच जैसे अन्य कारक हैं भी अध्ययन किया गया है.

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Protocol

1. नमूना तैयारी

नोट: चरण 1.1-1.8 सिर्फ एक बार प्रदर्शन कर रहे हैं

  1. स्टॉक 13सी समृद्ध पाइरुविक एसिड समाधान के 1 एमएल तैयार करें, जिसका व्यापक रूप से विवो अनुसंधानमें 1,2,5,6, ट्राइरिलमेथिल मूलक के 15-mmol/L से मिलकर 15-mmol/ 13 C$pyruvic एसिड (सामग्री की मेजदेखें). इस स्टॉक समाधान से Alicots नमूने है कि व्यक्तिगत रूप से polarized किया जाएगा और बाद में विभिन्न चुंबकीय क्षेत्रों में आराम से गुजरना के लिए इस्तेमाल किया जाएगा. 1-13ग$पिरुविक अम्ल अणु का निरूपण चित्र 1में दर्शाया गया है।
  2. गतिशील परमाणु polarizer सॉफ्टवेयर इंटरफ़ेस पर (सामग्री की तालिकादेखें), कूलडाउन बटन पर क्लिक करने के लिए चर तापमान डालने (VTI) के तापमान को कम करने के लिए 1.4 K.
  3. एक बार डीएनपी वांछित तापमान तक पहुँच गया है, एक नमूना कप में शेयर समाधान के 10 डिग्री सेल्सियस लोड, बुर्ज दरवाजे खोलने के लिए और विशेष रूप से इस कार्य के लिए डिजाइन एक प्रविष्टि छड़ी का उपयोग कर VTI में कप डालने.
  4. उसके बाद, जल्दी से छड़ी निकालने और सुनिश्चित करें कि कप जारी है. फिर बुर्ज दरवाजे बंद करें और निम्नलिखित चरणों के साथ जारी रखें, जबकि वीटीआई का तापमान 1.4 K पर वापस चला जाता है।
  5. डीएनपी को स्टॉक समाधान के हाइपरपोलीकरण के लिए इष्टतम आरएफ आवृत्ति खोजने के लिए एक माइक्रोवेव स्वीप चलाने के लिए तैयार करें।
    1. स्पेक्ट्रोमीटर (डीएनपी सिस्टम का हिस्सा) को नियंत्रित करने वाले कंप्यूटर पर, हाइपरटर्मिनल चिह्न पर डबल-क्लिक करके स्पेक्ट्रोमीटर और डीएनपी नियंत्रण सॉफ़्टवेयर के बीच संचार स्थापित करें, पहले उपयुक्त सीरियल संचार के साथ कॉन्फ़िगर किया गया पैरामीटर.
    2. एक बार संचार की स्थापना की है, RINMR सॉफ्टवेयर शुरू, अपनी कमांड लाइन में टाइप करें. HYPERSENSENMR,और फिर प्रवेशदबाएँ.
    3. उसके बाद, एक नई विंडो स्क्रीन पर दिखाई जाएगी और उस पर कॉन्फ़िगरेशन संख्या फ़ील्ड में नंबर एक (1) लिखें। उसके बाद, कॉन्फ़िगरेशन का चयन करें बटन पर क्लिक करें।
    4. बटन पर क्लिक करें माइक्रोवेव स्वीप करें| सेकंड के एक उतरते काउंटर के साथ एक छोटी सी खिड़की का संकेत है कि स्पेक्ट्रोमीटर के लिए तैयार है और यह आवधिक ट्रिगर संकेतों के लिए इंतज़ार कर रही हो जाएगा शुरू किया जाएगा, डीएनपी नियंत्रण सॉफ्टवेयर से आ रही है, ध्रुवीकरण का नमूना.
    5. DNP नियंत्रण सॉफ़्टवेयर पर, कैलिब्रेट टैब का चयन करें और जनरेट करें बटन पर क्लिक करें.
    6. अंशांकन सेटअप विंडो का उपयोग करके, निम्न जानकारी दर्ज करें: प्रारंभ आवृत्ति $ 94.117 GHz, अंत आवृत्ति ] 94.137 गीगा, चरण आकार ] 1 मेगाहर्ट्ज, चरण अवधि ] 300 s, पावर ] 50 mW, लिक्विड हीलियम स्तर ] 65%, और तापमान ] 1.4 K.
    7. बटन पर क्लिक करें उत्पन्न,जो सेटअप विंडो बंद हो जाएगा और Calibrate टैब है कि कदम और समय वांछित माइक्रोवेव स्वीप प्रदर्शन करने के लिए आवश्यक की संख्या प्रदर्शित करेगा पर वापस आ जाएगी.
    8. एक बार वांछित VTI तापमान प्राप्त किया है, सक्षम करें बटन क्लिक करें और फिर माइक्रोवेव स्वीप प्रक्रिया को प्रारंभ करने के लिए शुरू करें.
  6. माइक्रोवेव स्वीप के अंत में, नमूना ठीक है और अधिकतम ध्रुवीकरण हासिल की है, जहां इष्टतम आवृत्ति रिकॉर्ड. इस इष्टतम आवृत्ति को ध्रुवण आवृत्ति के रूप में परिभाषित किया गया है जो चित्र 2में दर्शाए अनुसार अधिकतम ध्रुवण प्रदान करती है। इस आवृत्ति का उपयोग पाइरुविक अम्ल के उस विशिष्ट स्टॉक विलयन से प्राप्त सभी एलिकोट्स को हाइपरपोलाइजिंग के लिए किया जाएगा।
  7. 40-mmol/L Tris बेस, सोडियम क्लोराइड के 50 mmol/L के विलयन का उपयोग करके स्टॉक विघटन माध्यम का 250 एमएल तथा विआयनित जल में 80-mmol/L सोडियम हाइड्रॉक्साइड तैयार की जा सकती है। किसी भी धातु आयन संदूषण को अलग करने के लिए 100 मिलीग्राम/एल की सांद्रता में एथिलीनडायमिनेटेट्रासेटिक एसिड (EDTA) जोड़ें। इसी तरह पाइरुविक एसिड स्टॉक समाधान के लिए, इस विघटन माध्यम का उपयोग सभी विभिन्न नमूनों के लिए किया जाएगा जो ध्रुवित हो जाएंगे। उपयोग किए गए रसायनों के बारे में अधिक विशिष्ट विवरण के लिए सामग्री तालिका का संदर्भ लें।
  8. इसके अलावा, स्टॉक सफाई समाधान के 500 एमएल तैयार करें जिसमें 100 मिलीग्राम/एल EDTA को deionized पानी में भंग कर दिया गया है। DNP के विघटन पथ को साफ करने के लिए प्रत्येक ध्रुवीकरण के बाद इस सफाई समाधान के लगभग 10 एमएल का उपयोग किया जाता है।
    नोट: चरण 1.9-1.27 प्रत्येक व्यक्ति के नमूने के लिए किया जाता है।
  9. डीएनपी मुख्य विंडो में कूलडाउन बटन दबाकर डीएनपीउपकरण को 1.4 K को 1.4 K को ठंडा करें।
  10. स्पेक्ट्रोमीटर के लिए इस्तेमाल किया सॉफ्टवेयर पहले से ही कॉन्फ़िगरेशन 1 चयनित के साथ सक्रिय है, तो निम्न चरणों के साथ आगे बढ़ें। अन्यथा, 1.5.1 से 1.5.3 चरण निष्पादित करें और उसके बाद निम्न चरणों के साथ जारी रखें।
  11. यह सत्यापित करने के बाद कि कॉन्फ़िगरेशन 1 DNP के स्पेक्ट्रोमीटर को नियंत्रित करने वाली विंडो में चयनित है, ठोस बिल्ड अप बटन पर क्लिक करें.
  12. फ़ाइल नाम SSBuilupXXX दर्ज करें, जहाँ "XXX" बिल्ड-अप डेटा के साथ संग्रहीत फ़ाइलों के अनुक्रम में एक संख्या है। यह संख्या स्वचालित रूप से सॉफ्टवेयर द्वारा वृद्धि की है. फिर ठीकक्लिक करें . इसी तरह माइक्रोवेव स्वीप मामले के लिए, सेकंड के एक उतरते काउंटर के साथ एक छोटी सी खिड़की का संकेत है कि स्पेक्ट्रोमीटर तैयार है और यह आवधिक ट्रिगर संकेतों के लिए इंतज़ार कर रही हो जाएगा शुरू किया जाएगा, डीएनपी नियंत्रण सॉफ्टवेयर से आ रहा है, ध्रुवीकरण का नमूना .
  13. पाइरुविक एसिड का उपयोग करना - कदम 1.1 में तैयार OX063 स्टॉक समाधान, एक नमूना कप में 30 मिलीग्राम वजन।
  14. जब वांछित VTI तापमान प्राप्त किया है (1.4 K) सम्मिलित नमूनापर क्लिक करें, तो सामान्य नमूना का चयन करें और फिर अगलापर क्लिक करें. स्क्रीन पर प्रदर्शित सुरक्षा सावधानियों के बाद, विशेष रूप से इस कार्य के लिए डिज़ाइन की गई एक लंबी छड़ी का उपयोग करके, ठंडे डीएनपी उपकरण में कप डालें।
  15. एक बार कप डाला जाता है, छड़ी हटा दिया, और DNP दरवाजे बंद कर दिया, अगलाक्लिक करें और फिर समाप्तकरें. उस बिंदु पर hyperpolarizer प्रणाली विकिरण कक्ष आंशिक रूप से भरा करने के लिए नमूना कप कम करती है (65%) तरल हीलियम के साथ.
  16. रुको जब तक तापमान 1.4K करने के लिए वापस आ गया है और फिर Polarize नमूना बटन पर क्लिक करें.
  17. नई पॉप अप विंडो में, आवृत्ति मूल्य सेट करने के लिए कि कदम 1.6 में माइक्रोवेव स्वीप से प्राप्त की. उसी विंडो में, पावर को 50 mW पर भी सेट करें और नमूना समय 300 s. अगलेपर क्लिक करें, बिल्ड-अप मॉनिटरिंग सक्षम करें बॉक्स की जाँच करें, और तब समाप्तपर क्लिक करें.
    नोट: एक बार ध्रुवीकरण शुरू कर दिया है, डीएनपी नियंत्रण सॉफ्टवेयर ट्रिगर संकेत उत्पन्न करता है हर 300 s एक छोटे टिप कोण का उपयोग कर ध्रुवीकरण का नमूना करने के लिए स्पेक्ट्रोमीटर निर्देश करने के लिए. इस तरह, स्पेक्ट्रोमीटर सॉफ्टवेयर एक ठोस राज्य चुंबकन वक्र करने के लिए एक नमूना बिंदु कहते हैं, अब दोनों स्पेक्ट्रोमीटर सॉफ्टवेयर में और टैब ध्रुवीकरण बिल्ड-अपके तहत डीएनपी नियंत्रण सॉफ्टवेयर में प्रदर्शित किया जाता है। 4 नमूना और उसके बाद हर नमूना के बाद, स्पेक्ट्रोमीटर सॉफ्टवेयर फार्म की एक घातीय विकास समारोह के लिए वक्र फिट बैठता है:

    स ] A *exp(-t/Tp) + y0

    जहाँ A ध्रुवण आयाम है, मनमाने ढंग से इकाइयों में, t नमूना समय है, Tp ध्रुवीकरण समय स्थिरांक है (दोनों सेकंड में), और y0 एक ऑफसेट है. फिट मानकों के आधार पर, सॉफ्टवेयर भी समय में उस बिंदु तक हासिल प्रतिशत ध्रुवीकरण की गणना करता है, जो भी डीएनपी के ध्रुवीकरण स्थिति टैब में प्रदर्शित किया जाता है.
  18. Polarize जब तक ठोस राज्य चुंबकन के निर्माण अधिकतम के कम से कम 95% तक पहुँचता है (लगभग एक घंटे).
  19. जबकि नमूना polarizing है, फास्ट फील्ड-साइक्लिंग Relaxometer तैयार के रूप में नीचे खंड 2 में समझाया.
  20. जब वांछित ध्रुवीकरण प्राप्त हो जाता है, तो चलाएँ विघटन पर क्लिक करें और विधिके तहत, पिरूविक एसिड टेस्टका चयन करें। उसके बाद, अगलापर क्लिक करें.
  21. स्क्रीन पर दिए गए निर्देशों का पालन करते हुए, डीएनपी बुर्ज के दरवाजे खोलें और उपकरण के शीर्ष पर हीटिंग और दबाव कक्ष को लोड करें, जिसमें खंड 1.5 में तैयार विघटन माध्यम का 4.55 एमएल है ताकि 80-mmol/L पाइरुटेट की सांद्रता का उत्पादन किया जा सके। $775 के पीएच पर विघटन तथा $37 डिग्री सेल्सियस का तापमान।
  22. सही स्थिति में ठीक छड़ी की स्थिति, बुर्ज दरवाजे बंद करें, और कंप्यूटर पर अगले पर क्लिक करें और फिर खत्मपर . उस बिंदु पर विघटन मीडिया superheated हो जाएगा जब तक दबाव 10 बार तक पहुँच ता.
  23. एक बार 10 बार दबाव प्राप्त हो जाता है, जमे हुए और hyperpolarized pyruvate स्वचालित रूप से तरल हीलियम स्नान से उठाया जाता है, जल्दी से मिश्रित, और superheated विघटन मीडिया के साथ thawed और एक केशिका ट्यूबिंग के माध्यम से एक नाशपाती के आकार का फ्लास्क में निकाल दिया. जबकि hyperpolarized pyruvate / विघटन मीडिया मिश्रण बाहर निकाल दिया जाता है, लगातार एक सजातीय मिश्रण सुनिश्चित करने के लिए फ्लास्क घूमता है।
  24. जब सभी मिश्रण निकाल दिया गया है, जल्दी से एक सिरिंज में तरल के 1.1 एमएल आकर्षित, एक पूर्व गर्म करने के लिए स्थानांतरण (37 डिग्री सेल्सियस) 10 मिमी व्यास NMR ट्यूब, और तेजी से क्षेत्र साइकिल आराम करने के लिए परिवहन (देखें कदम 2.2.12).
  25. संभव व्यवस्थित प्रयोगात्मक प्रभावों की जांच करने के लिए प्रत्येक पिरुवेट विघटन के शेष एलिकोट को 0.55-टी बेंचटॉप एनएमआर स्पेक्ट्रोमीटर में वितरित करें (सामग्री की तालिकादेखें)।
  26. तुरंत स्वच्छ विघटन माध्यम इथेनॉल के बाद का उपयोग कर डीएनपी तरल पदार्थ पथ को साफ करें। शेष सफाई तरल पदार्थ को हटाने और ऑक्सीजन के पथ शुद्ध करने के लिए तरल पदार्थ पथ के माध्यम से हीलियम गैस उड़ा। सभी कांच के बर्तन साफ करें।
  27. प्रत्येक माप के बाद, दोनों बेंच शीर्ष स्पेक्ट्रोमीटर और क्षेत्र साइकिल आराम करने के लिए से नमूनों की पीएच रिकॉर्ड.
    नोट: प्रत्येक टी1 माप डीएनपी उपकरण से एक अलग hyperpolarized विघटन है, इसलिए देखभाल नमूना संरचना की माप-से-माप reproducibility आश्वस्त करने के लिए आवश्यक है। यह अंतिम hyperpolarized समाधान की सटीक और reproduible तैयारी को आश्वस्त करने के लिए 0.1 मिलीग्राम की एक परिशुद्धता के साथ सभी एजेंटों और सॉल्वैंट्स वजन द्वारा पूरा किया है.

2. आराममिति

नोट निम्न चरणों में वर्णित विभिन्न पैरामीटरों के चयन और उपयोग की बेहतर समझ के लिए कृपया तालिका 1 देखें. विघटन से पहले, relaxometer फ्लिप कोण की गणना की जानी चाहिए और relaxometer सेटअप और hyperpolarized समाधान की माप के लिए तैयार होना चाहिए (नीचे देखें).

  1. फ्लिप कोण अंशांकन
    1. एनएमआर ट्यूब में 1 एमएल साफ करें [1-13सी]पिरुविक अम्ल की जिएं और 13सी न्यूक्लिय के टी1 को 200 से कम लेकिन 50 से अधिक एमएस के मूल्य में कम करने के लिए एक गैडोलीनियम कंट्रास्ट एजेंट जोड़ें।
    2. NMR ट्यूब सील तो यह एक अंशांकन मानक के रूप में कई बार इस्तेमाल किया जा सकता है.
    3. relaxometer की गहराई गेज का उपयोग करना, नमूना relaxometer आरएफ कुंडली के केंद्र में स्थित हो जाएगा सुनिश्चित करने के लिए उचित ऊंचाई के लिए NMR ट्यूब की प्रविष्टि की गहराई निर्धारित किया है.
    4. पुनरावर्तकता सुनिश्चित करने के लिए चिपकने वाला टेप के साथ 13सी पाइरुटेट अंशांकन मानक की सम्मिलन गहराई को चिह्नित करें।
    5. टेप द्वारा इंगित स्थिति के लिए NMR ट्यूब पर गहराई डाट प्लेस और क्षेत्र साइकिल आराम करने के बोर में इस अंशांकन मानक डालने. स्थिति में NMR ट्यूब रखने के लिए एक वजन का प्रयोग करें.
    6. साधन हवा वाल्व खोलें और relaxometer सामने पैनल से 37 डिग्री सेल्सियस के लिए तापमान नियंत्रक सेट। यह प्रयोग के दौरान गर्म हवा का उपयोग कर 37 डिग्री सेल्सियस ($ 0.5 डिग्री सेल्सियस) पर नमूने के तापमान को बनाए रखेगा।
    7. 13सी नाभिक संकेतों को प्राप्त करने के लिए फील्ड-साइकिलिंग रिलैक्टोमीटर हार्डवेयर सेटअप करें। इसमें बाह्य शिम कुंडली को स्थापित करना और ऊर्जा प्रदान करना (सामग्री की तालिकादेखें), RF कुंडली को 8 मेगाहर्ट्ज ($0ण्75 T 13C नाभिकों के लिए) को ट्यून करना और उसका मिलान करना, और उपयुक्त $ध4 केबल का उपयोग करना शामिल है.
    8. साधन सॉफ्टवेयर में, निम्न चरणों का पालन करें:
      1. मुख्य सममूल्य टैब का चयन करें
      2. लेबल प्रयोग के बगल में स्थित सेल पर क्लिक करें और पल्स अनुक्रम "13CANGLE" का चयन करने के लिए पॉप-अप विंडो में नीचे स्क्रॉल करें। एफएफसी ".
      3. निम्न प्राप्ति पैरामीटर सेट करें: RFA ] 5; SWT - 0.005, आरडी $ 0.5, BPOL ] 30 मेगाहर्ट्ज, TPOL - 0.5.
      4. AcQ. par टैब का चयन करें और फिर मूल उप-टैब का चयन करें।
      5. लेबल न्यूक्लियस के बगल वाले कक्ष पर क्लिक करें और 13Cका चयन करने के लिए पॉप-अप विंडो में नीचे स्क्रॉल करें।
      6. उसके बाद, निम्नलिखित पैरामीटर सेट करें: SF ] 8 मेगाहर्ट्ज, SW $ 1000000, BS ] 652, FLTR ] 100000, MS ] 32.
      7. कॉन्फ उप-टैब का चयन करें.
      8. निम्नलिखित पैरामीटर सेट करें: RINH $ 25, ACQD - 25.
      9. nDim उप-टैब का चयन करें
      10. सेट NBLK - 32, BINI ] 2, BEND - 62.
      11. मूल्यांकन टैब और उसके बाद पैरामीटर उप-टैब का चयन करें।
      12. निम्नलिखित पैरामीटर सेट करें: EWIP $ 10, EWEP ] 128, EWIB ] 1, EWEB ] 32.
      13. उसके बाद, पल्स अनुक्रम को चलाने के लिए प्राप्ति प्रारंभ करें चिह्न क्लिक करें।
    9. एक बार अधिग्रहण समाप्त हो गया है, डेटा को बचाने के लिए, मूल्यांकन संवाद चिह्न का चयन करें और विश्लेषण मेनू से WAM विंडो का चयन करें: निरपेक्ष परिमाण. फिर रिपोर्ट शीट, रेखांकन और निर्यात फ़ाइल का चयन करें और अंत में निष्पादितपर क्लिक करें .
    10. रिपोर्ट विंडो में आरएफ पल्स चौड़ाई है कि अधिकतम आयाम प्रदान करता है और प्रदर्शित ग्राफ में कर्सर की मदद से मूल्य ठीक धुन, जो चित्र 3के नीचे पंक्ति में दिखाए गए भूखंडों के समान है लगता है. इस पल्स चौड़ाई पैरामीटर PW90 निम्न प्रयोगों के लिए उपयोग किया जाएगा।
    11. relaxometer की आवृत्ति पारी को समायोजित करने के लिए F1 आइकन पर क्लिक करें.
      नोट: WAM विंडो: निरपेक्ष परिमाण EWEP द्वारा और ब्लॉक से निर्दिष्ट बिंदु के लिए EWIP द्वारा परिभाषित बिंदु से मुक्त प्रेरण क्षय अधिग्रहण (FIDs) के एक एकल या एक दृश्य के परिमाण को एकीकृत करने के लिए एक प्रक्रिया है EWEBद्वारा निर्दिष्ट ब्लॉक करने के लिए EWIB द्वारा परिभाषित .
  2. T1-माप
    1. सुनिश्चित करें कि बाहरी शिम कुंडली स्थापित और सक्रिय है।
    2. साधन सॉफ्टवेयर में निम्नलिखित चरणों का पालन करें:
      1. मुख्य सममूल्य टैब का चयन करें
      2. लेबल प्रयोग के बगल वाले कक्ष पर क्लिक करें और पल्स अनुक्रम HPUB/Sका चयन करने के लिए पॉप-अप विंडो में नीचे स्क्रॉल करें, जो चित्र 4में दिखाया गया है.
      3. निम्नलिखित प्राप्ति पैरामीटर सेट करें: RFA $ 25, T1MX ] मान 3 और 5 के बीच; SWT $ 0.2, आरडी ] 0, BRLX - मेगाहर्ट्ज (प्रोटोन Larmor आवृत्ति) में वांछित छूट क्षेत्र.
      4. AcQ. par टैब का चयन करें और फिर मूल उप-टैब का चयन करें।
      5. लेबल न्यूक्लियस के बगल वाले कक्ष पर क्लिक करें और 13Cका चयन करने के लिए पॉप-अप विंडो में नीचे स्क्रॉल करें।
      6. उसके बाद, निम्नलिखित पैरामीटर सेट करें: SF ] 8 मेगाहर्ट्ज, SW $ 1000000, BS ] 652, FLTR ] 50000.
      7. कॉन्फ उप-टैब का चयन करें.
      8. निम्न पैरामीटर सेट करें: PW90 चरण 2.1.10 में पाए गए मान के बराबर, RINH $ 25, ACQD $ 25.
      9. Puls उप-टैब का चयन करें और PW $ 5 सेट करें।
      10. nDim उप-टैब का चयन करें और NBLK $ 100 सेट करें।
      11. प्रतीक्षा करें और डेटा प्राप्ति आरंभ करने के लिए hyperpolarized समाधान प्राप्त करने के लिए तैयार हो जाओ।
      12. तुरंत relaxometer में नमूना डालने से पहले, मैन्युअल रूप से एक नल चुंबकीय क्षेत्र में नमूना डालने से बचने के लिए, कंसोल से पल्स अनुक्रम शुरू करते हैं. इस कारण से, यह डेटा विश्लेषण के दौरान पहले नि: शुल्क प्रेरण क्षय (FID) की उपेक्षा करने के लिए महत्वपूर्ण है.
      13. प्राप्ति के पूरा हो जाने के बाद, सहेजें बटन पर क्लिक करके डेटा सहेजें.
    3. विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करना, समय के एक समारोह के रूप में नमूना चुंबकन के शामिल एक डेटा श्रृंखला का उत्पादन करने के लिए प्रत्येक एफआईडी संकेत के परिमाण को एकीकृत.
    4. एक मानक गैर रेखीय कम से कम वर्गों फिटिंग एल्गोरिथ्म एक वाणिज्यिक विश्लेषणात्मक सॉफ्टवेयर में लागू का उपयोग कर एक तीन पैरामीटर घातीय मॉडल से स्पिन-लेटाइस छूट समय निकालें (सामग्री की तालिकादेखें) के लिए भी भार संभालने सभी डेटा:
      Equation 1
      जहां A प्रारंभिक संकेत आयाम(y-अवरोधन), T1 स्पिन-लेटिस विश्राम समय है, TR पुनरावृत्ति समय है, जो एक ज्ञात मान है, y0 संकेत है ऑफसेट, और कोस(द-1)($) एक फ्लिप कोण के लिए दवें माप पर अनुदैर्घ्य चुंबकन के नुकसान के लिए एक सुधार है, $.

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Representative Results

चित्रा 2 पाइरुविक एसिड के लिए एक उच्च संकल्प पूर्ण दूरी माइक्रोवेव स्वीप का एक उदाहरण प्रस्तुत करता है. प्रस्तुत मामले के लिए, कि इष्टतम माइक्रोवेव आवृत्ति से मेल खाती है 94.128 गीगा, आंकड़ा डालने में प्रकाश डाला. हमारे डीएनपी प्रणाली सामान्य रूप से 93.750 गीगा की रेंज में काम कर सकते हैं 94.241 गीगा के कदम आकार के साथ 1 मेगाहर्ट्ज, अप करने के लिए 600 s के ध्रुवीकरण समय, और अप करने के लिए की शक्ति 100 mW. आवृत्तियों की एक पूरी श्रृंखला केवल उपन्यास substrates के लिए जांच की है. हालांकि, 13सी-पाइरुविक एसिड के साथ पिछले अनुभव के आधार पर, हम इष्टतम आवृत्ति के आसपास होने की उम्मीद 94.127 गीगा. इसलिए, 94.117 गीगा के बीच एक स्कैन श्रेणी 94.137 गीगा करने के लिए, एक कदम आकार के साथ 1 मेगाहर्ट्ज और एक नमूना समय के साथ 300 s शक्ति का 50 mW के साथ, आम तौर पर उपयोग किया जाता है.

चित्रा 3 के बाएँ स्तंभ के लिए टिप कोण अंशांकन के लिए परिणाम प्रस्तुत करता है [1-13C]pyruvic एसिड, जो एक रैखिक अलग आरएफ पल्स durations के एक समारोह के रूप में संकेत माप की एक श्रृंखला के अधिग्रहण शामिल है पल्स निर्धारित करने के लिए चौड़ाई 13सी नाभिक के लिए 90 डिग्री और 180 डिग्री के फ्लिप कोण के लिए इसी। पल्स चौड़ाई है कि अधिकतम आयाम प्रदान करता है 90 डिग्री के एक फ्लिप कोण से मेल खाती है और शून्य पार 180 डिग्री के एक फ्लिप कोण से मेल खाती है. दो पल्स चौड़ाई के बीच संबंध दो का एक कारक होना चाहिए.

ऊपर दिखाए गए 13सी टिप कोण अंशांकन के लिए अधिग्रहण मापदंडों क्षेत्र चक्र relaxometer की संचारित शक्ति के आधार पर कुछ समायोजन की आवश्यकता हो सकती है, नमूना के टी1, और शोर विशेषता प्रणाली. कुछ परीक्षण और त्रुटि के रूप में अच्छी तरह से अच्छी तरह से प्रेरित प्रतिध्वनियों के प्रभाव के बिना 90 डिग्री और 180 "खोजने के लिए की जरूरत हो सकती है, एम्पलीफायर संतृप्ति, और गरीब SNR.

इस प्रक्रिया, हालांकि सटीक, सामान्य रूप से समय लगता है क्योंकि थर्मल polarized के गरीब SNR 13सी यौगिकों कई औसत की आवश्यकता है. एक वैकल्पिक और तेजी से विधि एक gadolinium-doped 1एच प्रेत के साथ फ्लिप कोण कैलिब्रेट करना और 13सी के लिए 90 डिग्री आरएफ पल्स की अवधि स्केलिंग शामिल है 90 डिग्री की अवधि गुणा-1एच आरएफ पल्स के अनुपात से 1ण्1ण्13ग का घूर्णचुंबकीय अनुपात, जो 3ण्976 के कारक से मेल खाता है। इस मामले के लिए, मानक अधिग्रहण पैरामीटर होना चाहिए: EXP ] ANGLE. एफएफसी, एनयूसी ] 1एच, टीपीओएल - 0ण्1 एस, बीपीओएल 30 मेगाहर्ट्ज, SWT ] 0.005, BINI ] 0 $s, BEND ] 15.5 ]s, NBLK ] 32, MS ] 1, RFA ] 25, आरडी ] 0.1 s, BS ] 652, SW ] 1 मेगाहर्ट्ज, FLTR ] 100 KHz, SF ] 8, RINH ] 25, ACQD ] 1, EWI ] 1 , और EWEB $ 32. इस वैकल्पिक विधि के परिणाम चित्र 3 के दाएँ स्तंभ में दिखाए जातेहैं। एक तुलना के रूप में, प्रस्तुत मामलों के लिए, टिप कोण अंशांकन के लिए कुल अधिग्रहण समय 13.5मिनट था जबकि 1एच के लिए 7.1 सेकंड था.

चित्र 5 क्षयित FIDs की विशिष्ट श्रृंखला दिखाता है के रूप में hyperpolarized चुंबकन नमूना है. दिए गए बीआरएलएक्स पर प्रत्येक टी1 माप डीएनपी उपकरण से एक अलग हाइपरपोलाइज्ड विघटन है। इस विशेष मामले के लिए, विश्राम क्षेत्र (बीआराम) 0.2916 mT था, 3.4 s की पुनरावृत्ति समय और 5 डिग्री का एक फ्लिप कोण के साथ. सभी नमूना तापमान 37 डिग्री सेल्सियस ($0.5 डिग्री सेल्सियस) तक नियंत्रित किए गए थे।

चित्र 6 हाइपरपोलाइज्ड [1-13C]pyruvate के लिए विश्राम वक्र प्रस्तुत करता है जो पिछले अंक के आँकड़ों से प्राप्त होता है। वक्र पर प्रत्येक नीला बिंदु एक FID के अंतर्गत क्षेत्र का प्रतिनिधित्व करता है। टी1 मान (53.9 ] 0.6s) क्षय वक्र डेटा के लिए संकेत समीकरण के एक गैर रेखीय कम से कम वर्गों फिट द्वारा प्राप्त किया गया था, जो उत्तेजना के लिए इस्तेमाल फ्लिप कोण के प्रभाव शामिल थे. फिट की अच्छाई आर2 मूल्य (0.9995) कंप्यूटिंग द्वारा मूल्यांकन किया गया था, डेटा अंक का भी भार संभालने. अवशिष्ट फिटिंग (डेटा-फिट) खुले त्रिकोण के रूप में दिखाए जाते हैं।

चित्र 7 0.237 mT और 0.705 T की एक सीमा पर सभी 26 माप के लिए टी1 परिणाम प्रस्तुत करता है 37 डिग्री सेल्सियस पर ($0.5 डिग्री सेल्सियस). टी1 सभी परिणामों के लिए $ 0.33 एस की एक औसत फिटिंग अनिश्चितता थी. एक विशेष छूट क्षेत्र में दोहराया माप के तितर बितर के विश्लेषण के ऊपर उद्धृत सांख्यिकीय अनिश्चितता से कई गुना बड़ा एक प्रयोगात्मक reproducibility मिले, 1.91 s के एक टी1 के साथ. 2.24 s की एक अनिश्चितता रूढ़िवादी सभी टी1 माप के लिए ऊपर उद्धृत दो अनिश्चितताओं की राशि के रूप में गणना सौंपा गया था. T1-विक्षेपण डेटा अच्छी तरह से अनुभवजन्य सूत्र T1 द्वारा विशेषता है (3.74 - 0.52) x लॉग10(बीआराम) + (63.0 ] 1.2) s; जहां बीआराम टेस्ला में मापा विश्राम क्षेत्र है. फिट पैरामीटर के लिए अनिश्चितताएं एक मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करती हैं। चित्र 7 पर ठोस रेखा 95% विश्वास बैंड का प्रतिनिधित्व डैश्ड लाइनों के साथ सूत्र का प्रतिनिधित्व करती है। इन नमूनों के लिए पीएच 7.63 से 7.93 तक, 7.75 के एक औसत पीएच और 0.09 के एक मानक विचलन के साथ लेकर. परिणामों के विश्लेषण से पता चला है कि C-1 नाभिक के लिए विश्राम समय पृथ्वी के चुंबकीय क्षेत्र (0ण्05 mT) पर $ 65 s की तुलना में है, जो 28% की कमी का प्रतिनिधित्व करता है।

Figure 1
चित्र 1 : [1-13C]पाइरुविक अम्ल अणु। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2 : पूर्ण दूरी माइक्रोवेव स्वीप और ज़ूम में इष्टतम ध्रुवीकरण आवृत्ति दिखा अनुभाग. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3 : 13सी (बाएं) और 1एच (दाएं) नमूनों के लिए टिप कोण अंशांकन। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4 : फील्ड-साइकिल पल्स अनुक्रम (HPUB/S) एक विशेष छूट क्षेत्र (बीआरएलएक्स) पर एक hyperpolarized नमूने के टी1-आराम समय को मापने के लिए। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5 : HPUB/S पल्स अनुक्रम के साथ प्राप्त FIDs के अनुक्रम. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्र 6 : विश्राम संकेत (नीले डॉट्स), वक्र फिटिंग (लाल रेखा), और फिटिंग त्रुटि (खुले त्रिकोण) में प्रस्तुत FIDs के अनुक्रम से प्राप्त चित्र 5| यह आंकड़ा चटरगोन एट अल से अनुमति के साथ संशोधित किया गया है 201334. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 7
चित्र 7 : हाइपरपोलाकिरेडकी की एनएमआरडी प्रोफाइल [1-13सी]पिरुविक एसिड कम चुंबकीय क्षेत्र में। यह आंकड़ा चटरगोन एट अल से अनुमति के साथ संशोधित किया गया है 201334. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पैरामीटर लघु विवरण टिप्पणियाँ इकाइयों
एसीक्यूडी अधिग्रहण में देरी चुंबकीय क्षेत्र संक्रमण के बाद और डेटा अधिग्रहण से पहले स्थिर स्थिति तक पहुँचने के लिए अनुमति देने के लिए आवश्यक देरी $s
बीएसीक्यू अधिग्रहण फ़ील्ड 1एच Larmor आवृत्ति के माध्यम से निर्दिष्ट मेगाहर्ट्ज
मोड़ना अंत मान व्यवस्थित पैरामीटर का अंतिम मान
बी.एन.आई. प्रारंभिक मान व्यवस्थित पैरामीटर का प्रथम मान
बीपीओएल ध्रुवीकरण फ़ील्ड 1एच Larmor आवृत्ति के माध्यम से निर्दिष्ट मेगाहर्ट्ज
बीआरएलएक्स विश्राम क्षेत्र 1एच Larmor आवृत्ति के माध्यम से निर्दिष्ट मेगाहर्ट्ज
बी एस ब्लॉक आकार एकल ब्लॉक में डेटा बिंदुओं की संख्या
ईडब्ल्यूईबी अंत ब्लॉक ब्लॉक (NBLK) की संख्या में कोई भी अंक संख्या. 0 का अर्थ है "सभी"
ईडब्ल्यूईपी समाप्ति बिंदु ब्लॉक आकार (BS) की श्रेणी में कोई भी अंक संख्या. 0 का अर्थ है "सभी"
ईडब्ल्यूआईबी प्रारंभिक ब्लॉक 1 से ब्लॉक की संख्या (NBLK)
ईडब्ल्यूईपी प्रारंभिक बिंदु 1 से ब्लॉक आकार (बीएस)
ऍक्स्प प्रयोग उपयोग किए जाने वाले स्पंद अनुक्रम का नाम
FLTR फ़िल्टर का निरीक्षण करें ऑडियो सिग्नल फिल्टर की कटऑफ आवृत्ति हर्ट्ज
सुश्री अधिकतम स्कैन औसत की वांछित संख्या
एनबीएलके ब्लॉक की संख्या व्यवस्थित पैरामीटर के लिए अनुभागों की संख्या. arrayed पैरामीटर है "PW90" के लिए "13CANGLE" और "ANGLE" पल्स अनुक्रम और "T1MX" के लिए "HPUB/S" पल्स अनुक्रम। PW90 प्रत्येक पुनरावृत्ति के बाद बदलता है, लेकिन T1MX स्थिर रहता है।
एनयूसी नाभिक इस प्रोटोकॉल के लिए 13C या 1H
Pw मुख्य आरएफ पल्स टिप कोण डिग्री (जेड)
PW90 90डेग स्पंद 90 डिग्री पल्स की अवधि $s
Rd रीसायकल देरी पूर्व स्कैन चुंबक शीतलन अंतराल एस
Rfa आरएफ क्षीणन आरएफ रिसीवर क्षीणन Db
आरआईएनएच रिसीवर संदमन आरएफ कुंडल बज के क्षय की अनुमति के लिए आवश्यक देरी $s
एस एफ सिस्टम आवृत्ति अधिग्रहण के दौरान इस्तेमाल किया Larmor आवृत्ति मेगाहर्ट्ज
Sw स्वीप चौड़ाई स्पेक्ट्रल विंडो चौड़ाई (निक्विस्ट आवृत्ति) हर्ट्ज
Swt समय स्विच कर रहा है वैश्विक चुंबक-स्विचिंग समय एस
T1MX अधिकतम T1 HPUB/S पल्स अनुक्रम द्वारा प्रत्येक पुनरावृत्ति के दौरान ध्रुवीकरण समय को परिभाषित करने के लिए उपयोग किया जाने वाले पैरामीटर एस
टीपीओएल ध्रुवीकरण समय प्रत्येक पुनरावृत्ति के दौरान ध्रुवीकरण समय को परिभाषित करने के लिए "ANGLE" और "13CANGLE" पल्स अनुक्रम द्वारा उपयोग किया गया पैरामीटर एस

तालिका 1: क्षेत्र साइकिल िंग रिसोमीटर द्वारा उपयोग किए जाने वाले पैरामीटरों का विवरण.

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Discussion

संकेत अधिग्रहण को बढ़ाने के लिए डीएनपी का उपयोग सीमित सांद्रता में 13सी नाभिक से उपलब्ध अपर्याप्त चुंबकीय अनुनाद संकेत के लिए एक तकनीकी समाधान है, पशु इंजेक्शन में इस्तेमाल उन लोगों के रूप में, लेकिन अन्य प्रयोगात्मक चुनौतियों प्रस्तुत करता है. चित्र 7 में दिखाया गया प्रत्येक छूट माप एक विशिष्ट रूप से तैयार किए गए नमूने के माप का प्रतिनिधित्व करता है क्योंकि इसे पुनर्माप के विघटन के बाद पुनः ध्रुवित नहीं किया जा सकता है। यह अनिवार्य रूप से नमूना और विघटन मीडिया या विघटन प्रक्रिया में ही बदलाव के वजन के दौरान नमूना तैयारी में मामूली अंतर के कारण प्रयोगात्मक परिवर्तनशीलता की ओर जाता है, जैसे अधूरा निष्कर्षण और नमूना की पूरी तरह से मिश्रण विघटन मीडिया के साथ. इस परिवर्तनशीलता आंशिक रूप से आराम मिति के बाद प्रत्येक pyruvate समाधान के पीएच को मापने के द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है. डीएनपी तंत्र में सम्मिलन से पहले स्टॉक पाइरुटेट/मूल मिश्रण और विघटन माध्यम के सावधानीपूर्वक वजन के बावजूद, हमारे प्रयोगों में पीएच एस 5.5 से 8.3 तक था। हम पीएच रेंज 7.6 से 8.0 के बाहर किसी भी टी1 डेटा को अस्वीकार करने के लिए चुना है।

जैसा कि ऊपर उल्लेख किया है, प्रत्येक नमूने के लिए ठोस राज्य ध्रुवीकरण स्तर कम से कम 95% है, जो के बारे में एक घंटे में प्राप्त किया गया था. प्रत्येक नमूने के लिए तरल-स्थिति ध्रुवीकरण का अनुमान नहीं लगाया गया था; तथापि, उसी नमूना तैयारी का उपयोग करते हुए डीएनपी प्रणाली की आवधिक गुणवत्ता आश्वासन के परिणामस्वरूप लगभग 15% का तरल राज्य ध्रुवीकरण स्तर हुआ।

नमूना तैयारी के दौरान, धातु आयन संदूषण विघटन माध्यम और डीएनपी विघटन तरल पदार्थ पथ के बीच संपर्क से हो सकता है। इस संभावना के लिए डिसोडियम एथिलीनडिमिनेटेरेसेटिक एसिड (EDTA) को किसी भी धातु आयन संदूषण को अलग करने और स्पिन-लेटिस छूट को संरक्षित करने की आवश्यकता थी।

संदर्भ में इस्तेमाल किया shutling विधि की तुलना28 और तेजी से क्षेत्र साइकिल चालन इस प्रोटोकॉल में प्रस्तुत किया, हम कह सकते हैं कि शटलिंग विधि ही संभव है जब शटल समय विश्राम समय की तुलना में छोटा है; अन्यथा, बंद समय के दौरान अनुभव औसत चुंबकीय क्षेत्र एक महत्वपूर्ण प्रभाव हो सकता है. तेजी से क्षेत्र साइकिल चालन relaxometer हम इस्तेमाल के साथ, उपयोगकर्ता स्विचन समय का पूरा नियंत्रण में है, जो के रूप में कम के रूप में जा सकते हैं 3 एमएस हालांकि, hyperpolarized substrates के लिए, एक धीमी स्विचन समय adiabaticity रखने के लिए और नहीं के ध्रुवीकरण को नष्ट करने के लिए आवश्यक है दायर संक्रमण के दौरान नमूना. हमारे अनुभव में, hyperpolarized 13सी-pyruvic एसिड के लिए, एक स्विचन समय के रूप में कम के रूप में 50 एमएस ध्रुवीकरण बनाए रखता है, लेकिन हम और अधिक सुसंगत परिणाम 100 या 200 एमएस के एक स्विचन समय का उपयोग कर मनाया. विश्राम से इस छोटे संक्रमण समय के लिए अधिग्रहण और विश्राम क्षेत्रों के लिए वापस मापा टी1 बार की तुलना में नगण्य है और इन माप पर कोई व्यवस्थित प्रभाव पड़ता है. हम मानते हैं कि विभिन्न चुंबकीय क्षेत्रों में विभिन्न अतिध्रुवित उपसंहरणों की आदीबाटीकी की सीमाओं को स्थापित करने के लिए और अधिक शोध की आवश्यकता है।

दो विधियों के बीच एक अन्य महत्वपूर्ण अंतर चुंबकीय क्षेत्र की सीमा है, जो शटलिंग विधि के लिए 2 मीटर से 18.8 टी और 0.237 मीटर से 0.705 टी क्षेत्र साइकिल चालन आराममापी के लिए है। इस संबंध में हम दो विधियों को एक-दूसरे के पूरक के रूप में देख सकते हैं। हालांकि, hyperpolarized यौगिकों के साथ vivo अध्ययन में के लिए, अप करने के लिए चुंबकीय क्षेत्र 3 टी अधिक आम हैं.

1 मीटर से कम की क्षेत्र शक्तियों पर, आस-पास की वस्तुओं से आवारा चुंबकीय क्षेत्र ों के लिए हमारे विश्राम माप पर एक व्यवस्थित प्रभाव देखा गया. इन क्षेत्रों को खत्म करने के लिए, हम डिजाइन और क्षेत्र साइकिल चुंबक के आसपास एक कस्टम चुंबकीय शिम जोड़ा. इसकी तुलना में, शटलिंग विधि र्-धातु बेलनाकार परिरक्षण का उपयोग करती है जो चुंबकीय क्षेत्र में लगभग 2 उT से 0ण्2 उत् तक अचानक परिवर्तन उत्पन्न करती है।

नमूना का तापमान नियंत्रण पूरे क्षय वक्र पर कब्जा करने के लिए 300 से 510 एस की आवश्यकता होती है अपेक्षाकृत लंबे अधिग्रहण समय के कारण महत्वपूर्ण था. हम hyperpolarized समाधान वितरण से पहले NMR ट्यूबों पहले warmed और फिर warmed उड़ाने से नमूना तापमान बनाए रखा, तापमान विनियमित (37 डिग्री सेल्सियस) आराम से मिलिएट्री के दौरान ट्यूबों पर हवा. नमूना माप के दौरान स्थिर है के बाद से नमूना का तापमान ठीक नियंत्रित किया जा सकता है क्योंकि यह शटलिंग विधि पर क्षेत्र-साइकिलिंग relaxometer का एक महत्वपूर्ण लाभ है।

इसके अलावा, यह polarizer और relaxometer के बीच संक्षिप्त हस्तांतरण समय के दौरान परिवेश के तापमान और चुंबकीय क्षेत्र के लिए नमूना जोखिम को नियंत्रित करने के लिए व्यावहारिक नहीं था. टी 1 नमूनों ज्ञात चुंबकीय क्षेत्र और relaxometer द्वारा नियंत्रित तापमान पर मापा गया था, इसलिए परिवहन सीमित प्रभाव था. परिवहन के दौरान शर्तों केवल hyperpolarization की मात्रा है कि relaxometer पर माप के लिए जीवित है प्रभावित कर सकते हैं. एक पोर्टेबल होल्डिंग क्षेत्र चुंबक (10 एमटी) इमेजिंग चुंबक या relaxometer के लिए hyperpolarized समाधान स्थानांतरित करने के लिए विकसित किया गया था; हालांकि, इसका उपयोग संक्षिप्त हस्तांतरण समय को देखते हुए इस प्रयोग में सार्थक नहीं था, लेकिन कम चुंबकीय क्षेत्र में अधिक से अधिक टी1-विक्षेपण के साथ अन्य hyperpolarized तरल पदार्थ के लिए उपयोगी हो सकता है. 0.01 टी के एक होल्डिंग क्षेत्र परिवहन के दौरान लगभग 18% द्वारा pyruvate समाधान के टी1 में वृद्धि होगी; हालांकि, हमारे अपेक्षाकृत कम हस्तांतरण समय के साथ 8 s, इन माप सुझाव है कि केवल एक 2.3% संकेत में वृद्धि मनाया जाएगा.

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Disclosures

लेखकों कोई खुलासे नहीं है.

Acknowledgments

लेखकों को कैंसर अनुसंधान के लिए ओंटारियो संस्थान, इमेजिंग अनुवाद कार्यक्रम और इस अनुसंधान के वित्तपोषण के लिए कनाडा के प्राकृतिक विज्ञान और इंजीनियरिंग अनुसंधान परिषद का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं. हम भी अल्बर्ट चेन, जीई हेल्थकेयर, टोरंटो, कनाडा, Gianni Ferrante, Stelar s.r.l., इटली, और विलियम मैंडर, ऑक्सफोर्ड इंस्ट्रूमेंट्स, ब्रिटेन के साथ उपयोगी विचार विमर्श स्वीकार करना पसंद है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
[1-13C]Pyruvic Acid Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA 677175
10mm NMR Tube Norell, Inc., Morganton NC, USA 1001-8
De-ionized water
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA E5134
HyperSense Dynamic Nuclear Polarizer Oxford Instruments, Abingdon, UK Includes the following: "DNP-NMR Polarizer" software used to control and monitor the whole DNP polarizer; "RINMR" used to monitor the solid state polarization levels; "HyperTerminal" used to communicate the DNP software with the RINMR software that monitors the solid state polarization level. Also includes the MQC bench top spectrometer to monitor the liquid state polarization in conjunction with it own RINMR software
MATLAB R2017b MathWorks, Natick, MA Include scripts for non-linear fitting of magnetization decay over time and T1 NMRD analysis of hyperpolarized pyruvic acid.
OX063 Triarylmethyl radical Oxford Instruments, Abingdon, UK
pH meter - SympHony VWR International, Mississauga, ON., Canada SB70P
ProHance Bracco Diagnostics Inc. Gadoteridol, Gd-HP-DO3A
Pure Ethanol (100% pure) Commercial Alcohols, Toronto, ON, Canada P016EAAN
Shim Coil Developed in-house
Sodium Chloride Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA S7653
Sodium Hydroxide Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA S8045 
SpinMaster FFC2000 1T C/DC Stelar s.r.l., Mede (PV) Italy Includes the software "AcqNMR" that is used to set experimental parameters, monitor the tuning and matching of the RF coil, loading different pulse sequences, calibrate flip angle, data acquisition and curve fitting, among other functions. Also includes a depth gauge, some weights and a depth stopper.
Trizma Pre-Set Crystals (pH 7.6) Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA T7943

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References

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बायोइंजीनियरिंग अंक 151 पाइरुटेट स्पिन-लेटिस छूट गतिशील परमाणु ध्रुवीकरण क्षेत्र-साइकिलरिय रिलैक्लोमिट्री परमाणु चुंबकीय छूट फैलाव (एनएमआरडी) हाइपरपोलोराइजेशन
Hyperpolarized के स्पिन-लेटिस विश्राम चुंबकीय क्षेत्र निर्भरता को मापने [1-<sup>13</sup>C$pyruvate
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Kim, S., Martinez-Santiesteban, F.,… More

Kim, S., Martinez-Santiesteban, F., Scholl, T. J. Measuring the Spin-Lattice Relaxation Magnetic Field Dependence of Hyperpolarized [1-13C]pyruvate. J. Vis. Exp. (151), e59399, doi:10.3791/59399 (2019).

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