Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

3D trykt porøse Cellulose Nanocomposite Hydrogel stilladser

Published: April 24, 2019 doi: 10.3791/59401
Automatic Translation
1, 1
1Department of Materials and Environmental Chemistry, Stockholm University

Summary

De tre kritiske trin i denne protokol i) udvikle den rette sammensætning og konsistens af cellulose hydrogel blæk, ii) 3D udskrivning af stilladser i de forskellige pore strukturer med god form troskab og dimensioner og iii) demonstration af den mekaniske egenskaber i simuleret organ betingelser for brusk regenerering.

Abstract

Dette arbejde viser brugen af tre-dimensionelle (3D) udskrivning til at producere porøse cubic stilladser med cellulose nanocomposite hydrogel blæk, med kontrolleret pore struktur og mekaniske egenskaber. Cellulose nanokrystaller (CNC, 69.62 wt %) baseret hydrogel blæk med matrix (natriumalginat og gelatine) blev udviklet og 3D trykt i stilladser med ensartet og gradient pore struktur (110-1.100 µm). Stilladser viste kompression modulus i rækken af 0,20-0,45 MPa når testet i simuleret in vivo betingelser (i destilleret vand ved 37 ° C). Pore størrelser og komprimering modulus af de 3D stilladser matches med de krav, der er nødvendige for brusk regenerering applikationer. Dette arbejde viser, at sammenhængen i blækket kan styres af koncentrationen af prækursorer og porøsitet kan styres af den 3D udskrivning proces og begge disse faktorer til gengæld definerer mekaniske egenskaber af 3D trykt porøse hydrogel stillads. Denne procesmetode kan derfor bruges til at fabrikere strukturelt og kompositorisk tilpassede stilladser ifølge patienternes særlige behov.

Introduction

Cellulose er et polysakkarid bestående af lineære kæder af β (1-4) sammenkædede D-glucose enheder. Det er den mest rigelige naturlige polymer på jorden og er udvundet fra en række kilder, herunder marine dyr (fx, sækdyr), planter (f.eks. træ, bomuld, hvedehalm) og bakteriel kilder, såsom alger (f.eks. Valonia), svampe og endda amøbe (protozoer )1,2. Cellulose nanofibers (CNF) og cellulose nanokrystaller (CNC) med mindst én dimension på nanoskala er opnået gennem mekanisk behandlinger og sur hydrolyse af cellulose. De ikke kun besidder egenskaber af cellulose, som potentiale for kemiske modifikation, lav toksicitet, biokompatibilitet, biologisk nedbrydeligt og vedvarende, men det har også nanoskala karakteristika som høje specifikke overfladeareal, høje mekaniske egenskaber , rheologiske og optiske egenskaber. Disse attraktive egenskaber har lavet CNFs og CNC velegnet til biomedicinske anvendelser, hovedsagelig i form af 3-dimensionelle (3D) hydrogel scaffolds3. Disse stilladser kræver tilpassede dimensioner med kontrolleret pore struktur og indbyrdes forbundne porøsitet. Vores gruppe og andre har rapporteret 3D porøse cellulose nanocomposites forberedt gennem støbning, electrospinning og frysetørring4,5,6,7,8. Dog styre pore struktur og fabrikation af komplekse geometri opnås ikke gennem disse traditionelle teknikker.

3D-printning er et tilsætningsstof fremstillingsindustrien teknik, hvor 3D-objekter oprettes lag på lag gennem computer-kontrollerede aflejring af blæk9. Fordelene ved 3D udskrivning over traditionelle teknikker omfatter designfrihed, kontrolleret makro og mikro dimensioner, fabrikation af komplekse arkitekturer, tilpasning og reproducerbarhed.  Derudover tilbyder 3D udskrivning af CNFs og CNC også shear-induceret alignments af nanopartikler, foretrak direktionalitet, gradient porøsitet og kan nemt udvides til at omfatte 3D bioprinting10,11,12, 13 , 14 , 15. for nylig, dynamikken i CNC justering under 3D-printning er blevet rapporteret16,17. Fremskridt inden for bioprinting har aktiverer 3D trykte væv og organer på trods af de involverede udfordring som valg og koncentration af levende celler og vækstfaktorer, sammensætning af carrier blæk, udskrivning af pres og dyse diameter18 ,19,20.

Porøsitet og trykstyrke af brusk regenerativ stilladser er vigtige egenskaber, der dikterer dets effektivitet og ydeevne. Porestørrelse spiller en vigtig rolle for vedhæftning, differentiering og spredning af celler samt med hensyn til udveksling af næringsstoffer og metaboliske affald21. Men der er ingen konkret porestørrelse, der kan betragtes som en ideel værdi, nogle undersøgelser viste højere bioactivity med mindre porer, mens andre viste bedre brusk regenerering med større porer. Macropores (< 500 µm) lette væv mineralisering, næringsstof levering og bortskaffelse, mens micropores (150-250 µm) lette celle udlæg og bedre mekaniske egenskaber22,23. Den indopererede stillads skal have tilstrækkelig mekanisk integritet fra tidspunktet for håndtering, implantation og indtil afslutningen af dens ønskede formål. Den samlede trykstyrke modulus for naturlige ledbrusken er rapporteret til at være i størrelsesordenen 0,1-2 MPa afhængigt af alder, køn og testet placering4,24,25,26,27 ,28,29.

I vores tidligere arbejde11, blev 3D udskrivning brugt til at fabrikere porøse bioscaffolds af en dobbelt crosslinked interpenetrating polymer netværk (IPN) fra en hydrogel blæk indeholdende forstærket CNC i en matrix af natriumalginat og gelatine. Den 3D udskrivning pathway var optimeret for at opnå 3D stilladser med ensartet og gradient pore strukturer (80-2,125 µm) hvor nanokrystaller orientere helst i udskriftsretningen (graden af orientering mellem 61-76%). Her præsenterer vi fortsættelsen af dette arbejde og viser effekten af porøsitet på de mekaniske egenskaber af 3D trykt hydrogel stilladser i simuleret organ betingelser. CNC anvendes her, var tidligere rapporteret af os at være cytocompatible og ikke-giftige (dvs. cellevækst efter 15 dages inkubation var bekræftet30). Derudover stilladser forberedt via frysetørring bruger de samme CNC, natriumalginat og gelatine viste høj porøsitet, høj optagelse af fosfat buffer saltvand og cytocompatibility mod mesenkymale stamceller5. Målet med dette arbejde er at vise hydrogel blæk behandling, 3D udskrivning af porøse stilladser og komprimering undersøgelser. Skemaer af behandling rute er vist i figur 1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. forberedelse af prækursorer

  1. Forberedelse af cellulose nanokrystaller suspension
    Bemærk: Isolering af cellulose nanokrystaller sker efter den procedure, der er rapporteret af Mathew, mfl30.
    1. Fortyndet 17 wt % suspension af cellulose nanokrystaller 2 wt % af tilføjelse destilleret vand for at lave en samlet maengde paa 2 L. blandes grundigt ved hjælp af ultra ultralydbehandling og brug mindre batches (250-300 mL) for effektiv blanding.
    2. Pass sonified suspension gennem homogeniseringsapparat 10 gange ved et tryk på 500-600 bar. På dette tidspunkt, er en tyk gennemsigtige gel af 2 wt % cellulose nanokrystaller opnået.
    3. Koncentrere 2 wt % cellulose nanokrystaller gel til 11 wt % gennem centrifugations på 24,500 x g for 1,5 h. Decant vand ud i mellem hvert 30 min.
      Bemærk: Eksperiment kan pause her.
  2. Forberedelse af matrix faser
    1. Forberede homogen opløsning af 6 wt % natriumalginat (SA) i destilleret vand ved 60 ° C under konstant omrøring.
    2. Forberede homogen opløsning af 12 wt % gelatine (Gel) i destilleret vand ved 60 ° C under konstant omrøring.
      Bemærk: Forberede en diskenhed på 20 mL til matrix løsninger og opbevares i køleskab.
  3. Forberedelse af overfladebehandlingsvæsker
    1. Forberede løsning 3 wt % calcium chlorid i destilleret vand ved stuetemperatur under konstant omrøring.
    2. Forberede en opløsning af 3 wt % glutaraldehyd i destilleret vand ved stuetemperatur under konstant omrøring.
      Bemærk: Forberede crosslinking løsninger et volumen på 50 mL og opbevares i stuetemperatur. Henvises til Tabel af materialer til leverandøroplysninger. Forsøget kan afbrydes midlertidigt her.

2. forberedelse af hydrogel blæk

  1. Forberede 40 mL hydrogel blæk i en polystyren container ved at blande 11 wt % CNC, 6 wt % SA og 12 wt % Gel til at få en våd (wt %) CNC/SA/Gel/vandets sammensætning: 6.87/1.50/1.50/90.12.
  2. Varm blandingen til 40 ° C og bland med en spatel, indtil en glat pasta er opnået.
  3. Overfør blandingen til en 60 mL sprøjte. Passere blandingen gennem en række dyser med forskellige diametre til en anden 60 mL sprøjte, ved hjælp af mekanisk klemme. Gentag processen indtil glat ekstruderet filamenter af hydrogel blæk er opnået. Start med dyse med en største diameter af 800 µm, efterfulgt af 600 µm og 400 µm.
  4. Forsigtigt centrifuge (4.000 x g) sprøjten fyldt med hydrogel blæk til at fjerne fanget luft.
    Bemærk: Eksperiment kan pause her.

3. måling af hydrogel rheologiske egenskaber

NTE: Udføre de rheologiske egenskaber ved hjælp af en glat kegle-on-plade geometri, CP25-2-SN7617, diameter 25 mm, 2 ° nominelle vinkel og gap højde 0,05 mm på 25 ° C.

  1. Tænd rheometer, luftkompressor og temperatur kontrolboks. Initialisere softwaren.
  2. Montere den måling værktøj i rheometer og angive nul-kløften.
  3. Presse ca. 1 mL hydrogel blæk på rheometer platform.
  4. Måle viskositet som en funktion af shear rate. Vælg rækken shear rate fra 0,001 til 1.000.
  5. Når målingen er færdig, ren rheometer platform og måling værktøj. Presse 1 mL frisk hydrogel blæk igen på rheometer-platformen.
  6. Måle opbevaring moduli (G′) og tab moduli (G″) som en funktion af shear stress på en frekvens på 1 Hz. Vælg shear stress intervallet fra 103 til 107.
  7. Når testene er færdige, kopiere data i tekstfil og plot rheologiske kurver i logaritmisk skala.

4. fil forberedelse til 3D udskrivning

Bemærk: Cura 2.4.0 software bruges til at designe 3D stilladser (20 mm3) at have tre typer af porer. 1-uniform porerne i 0,6 mm, 2-uniform porerne i 1.0 mm og 3-gradient porerne i intervallet 0,5-1 mm.

  1. Download stereolithography (stl) fil af en solid terning fra thingsinverse.com og åbne filen i Cura.
  2. Klik på den indlæste model og flytte det til X/Y/Z: 0/0/0 mm. Klik skala, fjerne markeringen i afkrydsningsfeltet for ensartet skalering og angive dimensioner til X/Y/Z: 20/20/20 mm. Klik på Roter og rotere kuben ved 45 ° i flyet XY.
  3. Vælg 0,4 mm i sidepanelet i dysen & materiale, og Indsæt profilen. Vælg Discov3ry komplet som printeren.
  4. I sidepanelet, skal du vælge Brugerdefineret for Udskriftsopsætning. Under kvalitet sektion, skal du indtaste 0,2 mm for alle sub sektioner. Under afsnittet Shell indtaste 0 mm for alle sub sektioner. Under materiale sektion, Indtast 26 ° C for temperatur, 1 mm Diameter og 100% Flow. Angiv 30 mm/s under hastighed sektion, som Print hastighed og 120 mm/s som Rejsehastighed. Under Support afdeling, uncheck boksen nemlig Aktiverer støtte. Under Bygge plade vedhæftning afsnit, Vælg nederdel, Angiv 3 mm som Nederdel afstand og 150 mm som nederdel/randen mindstevarighed.
  5. For stilladser med ensartet porestørrelse, Angiv 0,6 eller 1 mm Infill linje afstand og vælg Gitter Infill mønster.
  6. For gradient porøsitet stilladser, der fletning og gruppering værktøj bruges. Højreklik på den indlæste model, Vælg Flere modeller, Angiv 2 og tryk OK. Skalere hver model som X/Y/Z: 20/20/7 mm. Placer modeller ovenpå hinanden. Angiv Infill linje afstand som 0,3, 0,5 og 0,7 mm til bund, midte og top model, henholdsvis. Vælg alle tre modeller (Ctrl + A), højreklik og klik på Gruppe modeller.
  7. Gem modellerne på sikre Digital (SD) card. Cura automatisk gemme filen som gcode, som læses af printeren.

5. 3D printing porøse stilladser

  1. Indsæt overføringsrøret i dysen holderen og tilsluttes det 400 µm dyse. Niveau opbygge pladen til at få den korrekte afstand mellem bygge plade og dyse.
  2. Indlæse centrifugeret sprøjten i patronen, og Tilslut det til anden siden af overføringsrøret.
  3. Indsæt SD-kortet i printeren, Vælg Purge hurtigt og start udrensning hydrogel blæk, indtil det begynder at presse fra dysen. Fortsæt udrensning i 2-3 min. til at opnå en homogen flow.
  4. SD-kortet, Vælg de gemte filer for ensartet og gradient porøsitet stilladser og starte udskrivningen. Holde øje med ekstrudering sats. Hvis det er nødvendigt, justere hastighed og flow satsen i overensstemmelse hermed. For mindre porestørrelse, brug hurtigere hastighed kombineret med lavt flow (50 mm/s og 70%).
    NOTE: Rør ikke de 3D trykte stilladser.

6. Crosslinking af 3D trykt stilladser

  1. Når 3D-printning er fuldført, forsigtigt tilføje dråber 3 wt % CaCl2 til skafottet, indtil det bliver helt våd. Vente i 5 min.
  2. Meget omhyggeligt overføre skafottet fra printeren til en 50 mL container fyldt med 3 wt % CaCl2. Lad det natten over.
  3. Vask grundigt med destilleret vand og overføre skafottet til en 50 mL container fyldt med 3 wt % glutaraldehyd. Lad det natten over.
  4. Vask grundigt og gemme 3D trykte skafottet i destilleret vand.

7. kompression test

Bemærk: Udfør komprimering test med 100 N vejecelle i vand ved 37 ° C.

  1. Fylde beholderen udstyret med dykkede kompression bundplade med 2 L vand og starte varmeanlægget for at nå frem til 37 ° C.
  2. Initialiser Bluehill Universal software og opsætning af prøvemetoden. Vælg rektangulære modellen geometri og vælge muligheden for at indtaste dimensioner før testning hver prøve.  Indstil stamme hastigheden til 2 mm/min og årets resultat som 80% trykstyrke stamme med 90 N force.
  3. Vælg kraft, fordrivelse, trykstyrke stress og trykstyrke stamme i afsnittet måling . Vælg indstillingen for at eksportere data som tekstfiler til fremtidige plotning.
  4. Angive udvidelse nulpunktet ved hjælp af jog-kontrol til at sænke crosshead plade så tæt som muligt at basere plade.
  5. Måle og Bemærk dimensioner af prøverne skal undersøges.
  6. Når vandtemperaturen når op til 37 ° C, skal prøven anbringes på bundpladen.  Sikre prøven ved flytter crosshead plade, så det begynder at røre ved prøven.
  7. Flytte vandbadet op, således at pladerne med prøve-mellem dem er nedsænket i vand.
  8. Indtast prøve og dimensioner. Start testen.
  9. Når testen er fuldført, først flytte vandbadet og derefter hæve crosshead plade.
  10. Fjerne prøven og sine stykker, hvis nogen, rense begge pladerne og indlæse en ny prøve.
  11. Når alle prøver er testet, eksportere de rå data. Plot trykstyrke stress vs trykstyrke stamme kurver og bestemme den trykstyrke tangent modulus på stamme værdier på 1-5% og 25-30%.
    Bemærk: Placer gradient terningen på en sådan måde, at de større huller ansigt brevpapir bundplade.
    Først sikkert stillads i mellem greb og derefter start/stop måling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

CNC baseret nanocomposite hydrogel blæk viser en stærk ikke-newtonske shear udtynding adfærd (figur 2en). 1.55 × 105 Pa.s på en lav shear rate (0,001 s-1) tilsyneladende viskositet dråber af fem størrelsesordener til en værdi af 22.60 Pa.s på en shear rate af 50 s-1 (≈50 s-1 er et typisk shear rate erfarne under 3D-printning)31 . Hydrogel blæk udstiller en viskoelastiske solid adfærd, som opbevaring modulus G' (4.42 × 107 Pa) er en størrelsesorden større end tabet modulus G'' (8.26 × 106 Pa) på lav shear stress, med en veldefineret dynamisk ydelsesværdi, som stress (G'= G'') af 5,59 × 104 Pa (figur 2b). 3D trykt porøse nanocomposite hydrogel stilladser er vist i figur 3. For alle de trykte stilladser, er form og dimensioner meget godt bevaret efter udskrivning og efter dobbelt crosslinking. Pore størrelser af stilladser, 110-1.100 µm, er i størrelsesordenen 100-400 µm, der betragtes som en benchmark for brusk regenerering32.

De 3D trykte stilladser blev testet i kompression mode. Dette er den foretrukne transportform mekanisk testning for brusk materialer fordi naturlige brusk opgave at bære laster i komprimering. For at efterligne de in vivo betingelser, blev stilladser testet i vand ved 37 ° C. Tabel 1 og figur 4en repræsenterer trykstyrke oplysninger indhentet for forskellige porøse nanocomposite hydrogel stilladser på en stamme på 2 mm/min. Til lav stamme priser (1-5%), den trykstyrke modulus (~ 0,17 MPa) er mere eller mindre ens for alle typer af porøse stilladser. Dette viser, at den elastiske karakter af hydrogel blæk er bevaret selv i tilstedeværelse af macropores. Dog til høj belastning priser (25-30%), den højeste modulus af 0,45 MPa fås for reference stillads med ingen porøsitet. Men så snart porestørrelse øger, modulus nedsætter, på grund af faldet i tæthed med angivelse af det forventede forholdet mellem porøsitet af stilladser og de tilsvarende mekaniske egenskaber. I tilfælde af de gradient porøse stilladser er modulus højere (0,34 MPa) i forhold til ensartet porøse stilladser (0,20 og 0,26 MPa) på grund af tilstedeværelsen af mindre pore størrelser og mere solide vægge. Desuden, den trykstyrke modulus af den 3D hydrogel scaffolds stigninger som kompression sats stigninger (fig. 4b), udstille og efterligne viscoelasticity af naturlige brusk væv, som anses for gunstige for belastning bærende scaffolds33. Den trykstyrke modulus af 0,20 MPa med stamme hastighed på 2 mm/min stiger til 0,35 MPa 5 mm/min. og yderligere øger 0.47 MPA på 120 mm/min og er i størrelsesordenen rapporteret for naturlige brusk (dvs., trykstyrke modulus af 0,1-2 MPa).

Figure 1
Figur 1 . Skemaer af ruten forarbejdning. (en) forberedelse af nanocomposite hydrogel blæk. (b) 3D udskrivning porøse stilladser. (c) dobbelt crosslinking af 3D trykt stilladser. (d) komprimering test af 3D porøse stilladser i vand ved 37 ° C. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 . Log-log parceller af nanocomposite hydrogel blæk. (en) viskositet vs shear rate og (b) G' og G'' vs shear stress. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 . 3D trykt porøse stilladser. Skala: 500 µm. (et) Reference med ingen huller. (b) 1 mm porestørrelse. (c) 0,60 mm porestørrelse. (d) Gradient porøsitet 110-800 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4 . Repræsentative stress-strain kurver for 3D trykt porøse nanocomposite hydrogel stilladser. (en) med konstant belastning hastighed på 2 mm/s. (b) på forskellige stamme satser for 1 mm pore størrelse stillads. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Target porestørrelse (µm) Gennemsnitlige porestørrelse (µm) Trykstyrke modulus på 1-5% stamme (MPa) Trykstyrke modulus på 25-30% belastning (MPa)
Reference 0 0,19 ± 0,04 0,45 ± 0,03
1.000 850-1.100 0,17 ± 0,02 0,2 ± 0,01
600 480-650 0.16 ± 0,01 0,26 ± 0,05
Gradient 110-800 0.16 ± 0,01 0,34 ± 0,04

Tabel 1. Kompression data til 3D trykt nanocomposite hydrogel stilladser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

3D udskrivning kræver passende rheologiske egenskaber hydrogel blæk. Høj viskositet blæk vil kræve ekstreme pres for sin ekstrudering, mens lav viskositet blæk ikke vil opretholde sin form efter ekstrudering. Viskositet hydrogel blæk kan styres via koncentrationen af ingredienserne. I forhold til vores tidligere arbejde11, er faststofindholdet hydrogel blæk steg fra 5,4 til 9,9 wt % resulterer i koncentreret hydrogel blæk, som hjælper med at forbedre opløsningen af den trykte stillads. Det kan bemærkes, at i modsætning til lang, fleksibel CNFs, stive stang som CNC kan producere trykfarver med højere fast indhold på en given viskositet på grund af fravær af fysiske forviklinger14. Et andet vigtigt aspekt, der påvirker trykproces er homogeniteten af blæk. Det skal bemærkes, at opvarmning hydrogel blæk ved en temperatur på 40 ° C fremmer den homogene blanding af CNC med matrix fase. For yderligere at sikre glathed af hydrogel blæk, var det gået gennem en serie af dyser, begyndende med den største diameter 800 µm, så 600 µm og endelig 400 µm. Under disse passerer, kan være tilstoppede dysen, hvilket tyder på tilstedeværelse af store klumper, men efter disse passerer hydrogel blæk ekstruderet ubesværet i form af en kontinuerlig glødetråd. Dyse bevægelse for at få 3D trykte konstruktioner er også af stor betydning, som det fremgår af vores tidligere arbejde11. Dyse pathway bør undgå gentagne bevægelser og overskydende depositioner af hydrogel blæk således at opløsningen af den 3D print er bevaret.

Porøsitet er fremstillet i 3D trykte hydrogel stilladser er i det acceptable område i forhold til den målrettede porøsitet (tabel 1). Et eksakt match ikke kan forventes på grund af hævelse hydrogel blæk.  Sammenhængen i hydrogel blæk er en vigtig faktor, især når ex-situ crosslinking har at blive gennemstegt, dvs crosslinking efter udskrivningen af den 3D konstruktion. Det skal bemærkes, at hydrogel blækket var koncentreret nok (faststofindholdet 9,9 wt %) at bevare sin form, struktur og dimensioner under og efter udskrivningen.

Porestørrelse af skafottet spiller en væsentlig rolle i celle interaktioner, ilt diffusion og bortskaffelse samt dens mekaniske egenskaber til at udføre og understøtter den ønskede funktionalitet. Stilladser med gradient porøsitet har evnen til at bedre at repræsentere de faktiske in vivo forhold hvor celler er udsat for lag af forskellige væv med varierende strukturelle egenskaber22,23,34. Porøsitet og mekaniske egenskaber er omvendt relateret, men sammensætningen af hydrogel stillads kan spille en vigtig rolle. CNC har været valgt som den vigtigste ingrediens i hydrogel blæk på grund af sin velkendte mekaniske egenskaber2,35,36. Hydrogel blæk fremstillet her, besidder sin elasticitet selv i tilstedeværelse af porer, har en optimal porestørrelse (110-1.100 µm) og en passende trykstyrke modulus (0,20-0,45 MPa) kræves til brusk regenerering programmer.

Kompression test blev udført i vand og på kropstemperaturen til at efterligne de in vivo betingelser så meget som muligt. Der var ingen tørring trin involveret mellem 3D-printning og mekaniske test. I naturlige væv, er en porøsitet gradient observeret i stedet for en ensartet porestørrelse. Det samme gælder for komprimering værdier for bærende naturlige væv, som den trykstyrke modulus afhænger af alder, køn og den testede placering.

Fordel med studiet præsenteres her er, at endelige porøsitet og trykstyrke modulus værdier af 3D porøse stillads kan kontrolleret og tilpasset gennem hydrogel blæk sammensætning og 3D print proces. Denne protokol er fleksibel og kan ændres i henhold til specifikke krav. 3D-printning er en kraftfuld teknik og kan udforskes i fremtiden for at udvikle stilladser med komplekse strukturelle og kompositoriske funktioner. Multi materielle udlevering kan indføre revolution ved at kontrollere sammensætningen af stilladser, koncentration af celler eller vækstfaktorer, strukturelle egenskaber såsom direktionalitet eller porøsitet, mekaniske egenskaber og nedbrydning sats i forskellige dele af 3D konstruktioner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Denne undersøgelse er økonomisk støttet af Knut og Alice Wallenberg Foundation (Wallenberg træ Science Center), svenske Forskningsråd, VR (Bioheal, DNR 2016-05709 og DNR 2017-04254).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
60 mL syringe Structur3D Printing
Alginic acid sodium salt Sigma-Aldrich 9005-38-3
Anhydrous calcium chloride Sigma-Aldrich 10043-52-4
Clamps, three pronged, Talon VWR 241-0404 102 mm, Dual adjustment clamp, large, clamp extension 127 mm
Cura 2.4.0 Ultimaker Free slicing software
Discov3ry Complete Structur3D Printing Ultimaker 2+ 3D printer integrated with Discov3ry paste extruder
Gelatin from bovine skin Sigma-Aldrich 9000-70-8
Glutaraldehyde solution 50 wt. % in H2O Sigma-Aldrich 111-30-8
homogenizer SPX APV-2000
Instron 5960 Instron Instron 5960, Biopuls Bath, 100 N load cell, 37 °C,
Physica MCR 301 rheometer Anton Paar CP25-2-SN7617, gap height 0.05 mm, 25 °C
Sorvall Lynx 6000 centrifuge AB Ninolab s/n 41881692 F12-rotor (6x500 ml)
stainless steel nozzle Structur3D Printing 800, 600 and 400 µm
thingsinverse MakerBot's  sharing and downloading 3D printable things in form of stl files
ultra sonication Qsonica, LLC Q500
Unbarked wood chips Norway spruce(Picea abies) dry matter content of 50–55%

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Moon, R. J., Martini, A., Nairn, J., Simonsen, J., Youngblood, J. Cellulose nanomaterials review: structure, properties and nanocomposites. Chemical Society Reviews. 40 (7), 3941-3994 (2011).
  2. Dufresne, A. Nanocellulose: a new ageless bionanomaterial. Materials Today. 16 (6), 220-227 (2013).
  3. Chinga-Carrasco, G. Potential and limitations of nanocelluloses as components in biocomposite inks for three-dimensional bioprinting and for biomedical devices. Biomacromolecules. 19 (3), 701-711 (2018).
  4. Naseri, N., Poirier, J., Girandon, L., Fröhlich, M., Oksman, K., Mathew, A. P. 3-Dimensional porous nanocomposite scaffolds based on cellulose nanofibers for cartilage tissue engineering: tailoring of porosity and mechanical performance. Royal Society of Chemistry Advances. 6 (8), 5999-6007 (2016).
  5. Naseri, N., Deepa, B., Mathew, A. P., Oksman, K., Girandon, L. Nanocellulose-Based Interpenetrating Polymer Network (IPN) Hydrogels for Cartilage Applications. Biomacromolecules. 17 (11), 3714-3723 (2016).
  6. Naseri, N., Mathew, A. P., Girandon, L., Fröhlich, M., Oksman, K. Porous electrospun nanocomposite mats based on chitosan-cellulose nanocrystals for wound dressing: effect of surface characteristics of nanocrystals. Cellulose. 22 (1), 521-534 (2015).
  7. Xing, Q., Zhao, F., Chen, S., McNamara, J., DeCoster, M. A., Lvov, Y. M. Porous biocompatible three-dimensional scaffolds of cellulose microfiber/gelatin composites for cell culture. Acta Biomaterialia. 6 (6), 2132-2139 (2010).
  8. Nandgaonkar, A., Krause, W., Lucia, L. Fabrication of cellulosic composite scaffolds for cartilage tissue engineering. Nanocomposites for musculoskeletal tissue regeneration. , Elsevier. 187-212 (2016).
  9. Gross, B. C., Erkal, J. L., Lockwood, S. Y., Chen, C., Spence, D. M. Evaluation of 3D printing and its potential impact on biotechnology and the chemical sciences. Analytical Chemistry. 86 (7), 3240-3253 (2014).
  10. Markstedt, K., Mantas, A., Tournier, I., Martínez Ávila, H., Hägg, D., Gatenholm, P. 3D bioprinting human chondrocytes with nanocellulose-alginate bioink for cartilage tissue engineering applications. Biomacromolecules. 16 (5), 1489-1496 (2015).
  11. Sultan, S., Mathew, A. P. 3D printed scaffolds with gradient porosity based on a cellulose nanocrystal hydrogel. Nanoscale. 10, 4421-4431 (2018).
  12. Sultan, S., Siqueira, G., Zimmermann, T., Mathew, A. P. 3D printing of nano-cellulosic biomaterials for medical applications. Current Opinion in Biomedical Engineering. 2, 29-34 (2017).
  13. Sultan, S., Abdelhamid, H. N., Zou, X., Mathew, A. P. CelloMOF: Nanocellulose Enabled 3D Printing of Metal-Organic Frameworks. Advanced Functional Materials. , 1805372-1805384 (2018).
  14. Siqueira, G., et al. Cellulose Nanocrystal Inks for 3D Printing of Textured Cellular Architectures. Advanced Functional Materials. 27 (12), 1604619-1604629 (2017).
  15. Wang, J., et al. All-in-One Cellulose Nanocrystals for 3D Printing of Nanocomposite Hydrogels. Angewandte Chemie International Edition. 57 (9), 2353-2356 (2018).
  16. Hausmann, M. K., et al. Dynamics of Cellulose Nanocrystal Alignment during 3D Printing. ACS Nano. 12 (7), 6926-6937 (2018).
  17. Liu, Y., et al. Nanoscale assembly of cellulose nanocrystals during drying and redispersion. ACS Macro Letters. 7 (2), 172-177 (2018).
  18. Murphy, S. V., Atala, A. 3D bioprinting of tissues and organs. Nature Biotechnology. 32 (8), 773-785 (2014).
  19. Pati, F., et al. Printing three-dimensional tissue analogues with decellularized extracellular matrix bioink. Nature communications. 5, 3935 (2014).
  20. Xia, Z., Jin, S., Ye, K. Tissue and organ 3D bioprinting. SLAS TECHNOLOGY: Translating Life Sciences Innovation. 23 (4), 301-314 (2018).
  21. Zhang, Q., Lu, H., Kawazoe, N., Chen, G. Pore size effect of collagen scaffolds on cartilage regeneration. Acta Biomaterialia. 10 (5), 2005-2013 (2014).
  22. Loh, Q. L., Choong, C. Three-dimensional scaffolds for tissue engineering applications: role of porosity and pore size. Tissue Engineering, Part B: Reviews. 19 (6), 485-502 (2013).
  23. Bružauskaitė, I., Bironaitė, D., Bagdonas, E., Bernotienė, E. Scaffolds and cells for tissue regeneration: different scaffold pore sizes-different cell effects. Cytotechnology. 68 (3), 355-369 (2016).
  24. Zhang, L., Hu, J., Athanasiou, K. A. The role of tissue engineering in articular cartilage repair and regeneration. Critical Reviews™ in Biomedical Engineering. 37 (1-2), (2009).
  25. Athanasiou, K., Rosenwasser, M., Buckwalter, J., Malinin, T., Mow, V. Interspecies comparisons of in situ intrinsic mechanical properties of distal femoral cartilage. Journal of Orthopaedic Research. 9 (3), 330-340 (1991).
  26. Schinagl, R. M., Gurskis, D., Chen, A. C., Sah, R. L. Depth-dependent confined compression modulus of full-thickness bovine articular cartilage. Journal of Orthopaedic Research. 15 (4), 499-506 (1997).
  27. Athanasiou, K., Niederauer, G., Schenck, R. Biomechanical topography of human ankle cartilage. Annals Biomedical Engineering. 23 (5), 697-704 (1995).
  28. Athanasiou, K. A., Liu, G. T., Lavery, L. A., Lanctot, D. R., Schenck, R. C. Biomechanical topography of human articular cartilage in the first metatarsophalangeal joint. Clinical Orthopaedics and Related Research. 348, 269-281 (1998).
  29. Guilak, F., Jones, W. R., Ting-Beall, H. P., Lee, G. M. The deformation behavior and mechanical properties of chondrocytes in articular cartilage. Osteoarthritis and Cartilage. 7 (1), 59-70 (1999).
  30. Mathew, A. P., Oksman, K., Karim, Z., Liu, P., Khan, S. A., Naseri, N. Process scale up and characterization of wood cellulose nanocrystals hydrolysed using bioethanol pilot plant. Industrial Crops and Products. 58, 212-219 (2014).
  31. Compton, B. G., Lewis, J. A. 3D-printing of lightweight cellular composites. Advanced Materials. 26 (34), 5930-5935 (2014).
  32. Sarem, M., Moztarzadeh, F., Mozafari, M. How can genipin assist gelatin/carbohydrate chitosan scaffolds to act as replacements of load-bearing soft tissues. Carbohydrate Polymers. 93 (2), 635-643 (2013).
  33. Chia, H. N., Hull, M. Compressive moduli of the human medial meniscus in the axial and radial directions at equilibrium and at a physiological strain rate. Journal of orthopaedic research. 26 (7), 951-956 (2008).
  34. Zhang, K., Fan, Y., Dunne, N., Li, X. Effect of microporosity on scaffolds for bone tissue engineering. Regenerative biomaterials. 5 (2), 115-124 (2018).
  35. Lin, N., Dufresne, A. Nanocellulose in biomedicine: Current status and future prospect. European Polymer Journal. 59, 302-325 (2014).
  36. Domingues, R. M., Gomes, M. E., Reis, R. L. The potential of cellulose nanocrystals in tissue engineering strategies. Biomacromolecules. 15 (7), 2327-2346 (2014).

Tags

Bioteknologi spørgsmålet 146 3D udskrivning cellulose nanokrystaller hydrogel porøse stilladser biomedicinske anvendelser kompression modulus
3D trykt porøse Cellulose Nanocomposite Hydrogel stilladser
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sultan, S., Mathew, A. P. 3D Printed … More

Sultan, S., Mathew, A. P. 3D Printed Porous Cellulose Nanocomposite Hydrogel Scaffolds. J. Vis. Exp. (146), e59401, doi:10.3791/59401 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter