3D trykt porøse Cellulose Nanocomposite Hydrogel stilladser

Summary

De tre kritiske trin i denne protokol i) udvikle den rette sammensætning og konsistens af cellulose hydrogel blæk, ii) 3D udskrivning af stilladser i de forskellige pore strukturer med god form troskab og dimensioner og iii) demonstration af den mekaniske egenskaber i simuleret organ betingelser for brusk regenerering.

Abstract

Dette arbejde viser brugen af tre-dimensionelle (3D) udskrivning til at producere porøse cubic stilladser med cellulose nanocomposite hydrogel blæk, med kontrolleret pore struktur og mekaniske egenskaber. Cellulose nanokrystaller (CNC, 69.62 wt %) baseret hydrogel blæk med matrix (natriumalginat og gelatine) blev udviklet og 3D trykt i stilladser med ensartet og gradient pore struktur (110-1.100 µm). Stilladser viste kompression modulus i rækken af 0,20-0,45 MPa når testet i simuleret in vivo betingelser (i destilleret vand ved 37 ° C). Pore størrelser og komprimering modulus af de 3D stilladser matches med de krav, der er nødvendige for brusk regenerering applikationer. Dette arbejde viser, at sammenhængen i blækket kan styres af koncentrationen af prækursorer og porøsitet kan styres af den 3D udskrivning proces og begge disse faktorer til gengæld definerer mekaniske egenskaber af 3D trykt porøse hydrogel stillads. Denne procesmetode kan derfor bruges til at fabrikere strukturelt og kompositorisk tilpassede stilladser ifølge patienternes særlige behov.

Introduction

Cellulose er et polysakkarid bestående af lineære kæder af β (1-4) sammenkædede D-glucose enheder. Det er den mest rigelige naturlige polymer på jorden og er udvundet fra en række kilder, herunder marine dyr (fx, sækdyr), planter (f.eks. træ, bomuld, hvedehalm) og bakteriel kilder, såsom alger (f.eks. Valonia), svampe og endda amøbe (protozoer )^1,2. Cellulose nanofibers (CNF) og cellulose nanokrystaller (CNC) med mindst én dimension på nanoskala er opnået gennem mekanisk behandlinger og sur hydrolyse af cellulose. De ikke kun besidder egenskaber af cellulose, som potentiale for kemiske modifikation, lav toksicitet, biokompatibilitet, biologisk nedbrydeligt og vedvarende, men det har også nanoskala karakteristika som høje specifikke overfladeareal, høje mekaniske egenskaber , rheologiske og optiske egenskaber. Disse attraktive egenskaber har lavet CNFs og CNC velegnet til biomedicinske anvendelser, hovedsagelig i form af 3-dimensionelle (3D) hydrogel scaffolds³. Disse stilladser kræver tilpassede dimensioner med kontrolleret pore struktur og indbyrdes forbundne porøsitet. Vores gruppe og andre har rapporteret 3D porøse cellulose nanocomposites forberedt gennem støbning, electrospinning og frysetørring^4,5,6,7,8. Dog styre pore struktur og fabrikation af komplekse geometri opnås ikke gennem disse traditionelle teknikker.

3D-printning er et tilsætningsstof fremstillingsindustrien teknik, hvor 3D-objekter oprettes lag på lag gennem computer-kontrollerede aflejring af blæk⁹. Fordelene ved 3D udskrivning over traditionelle teknikker omfatter designfrihed, kontrolleret makro og mikro dimensioner, fabrikation af komplekse arkitekturer, tilpasning og reproducerbarhed.  Derudover tilbyder 3D udskrivning af CNFs og CNC også shear-induceret alignments af nanopartikler, foretrak direktionalitet, gradient porøsitet og kan nemt udvides til at omfatte 3D bioprinting^{10,11,12, 13 , 14 , 15}. for nylig, dynamikken i CNC justering under 3D-printning er blevet rapporteret^16,17. Fremskridt inden for bioprinting har aktiverer 3D trykte væv og organer på trods af de involverede udfordring som valg og koncentration af levende celler og vækstfaktorer, sammensætning af carrier blæk, udskrivning af pres og dyse diameter^{18 ,19,20}.

Porøsitet og trykstyrke af brusk regenerativ stilladser er vigtige egenskaber, der dikterer dets effektivitet og ydeevne. Porestørrelse spiller en vigtig rolle for vedhæftning, differentiering og spredning af celler samt med hensyn til udveksling af næringsstoffer og metaboliske affald²¹. Men der er ingen konkret porestørrelse, der kan betragtes som en ideel værdi, nogle undersøgelser viste højere bioactivity med mindre porer, mens andre viste bedre brusk regenerering med større porer. Macropores (< 500 µm) lette væv mineralisering, næringsstof levering og bortskaffelse, mens micropores (150-250 µm) lette celle udlæg og bedre mekaniske egenskaber^22,23. Den indopererede stillads skal have tilstrækkelig mekanisk integritet fra tidspunktet for håndtering, implantation og indtil afslutningen af dens ønskede formål. Den samlede trykstyrke modulus for naturlige ledbrusken er rapporteret til at være i størrelsesordenen 0,1-2 MPa afhængigt af alder, køn og testet placering^{4,24,25,26,27 ,28,29}.

I vores tidligere arbejde¹¹, blev 3D udskrivning brugt til at fabrikere porøse bioscaffolds af en dobbelt crosslinked interpenetrating polymer netværk (IPN) fra en hydrogel blæk indeholdende forstærket CNC i en matrix af natriumalginat og gelatine. Den 3D udskrivning pathway var optimeret for at opnå 3D stilladser med ensartet og gradient pore strukturer (80-2,125 µm) hvor nanokrystaller orientere helst i udskriftsretningen (graden af orientering mellem 61-76%). Her præsenterer vi fortsættelsen af dette arbejde og viser effekten af porøsitet på de mekaniske egenskaber af 3D trykt hydrogel stilladser i simuleret organ betingelser. CNC anvendes her, var tidligere rapporteret af os at være cytocompatible og ikke-giftige (dvs. cellevækst efter 15 dages inkubation var bekræftet³⁰). Derudover stilladser forberedt via frysetørring bruger de samme CNC, natriumalginat og gelatine viste høj porøsitet, høj optagelse af fosfat buffer saltvand og cytocompatibility mod mesenkymale stamceller⁵. Målet med dette arbejde er at vise hydrogel blæk behandling, 3D udskrivning af porøse stilladser og komprimering undersøgelser. Skemaer af behandling rute er vist i figur 1.

Protocol

1. forberedelse af prækursorer Forberedelse af cellulose nanokrystaller suspensionBemærk: Isolering af cellulose nanokrystaller sker efter den procedure, der er rapporteret af Mathew, mfl30. Fortyndet 17 wt % suspension af cellulose nanokrystaller 2 wt % af tilføjelse destilleret vand for at lave en samlet maengde paa 2 L. blandes grundigt ved hjælp af ultra ultralydbehandling og brug mindre batches (250-300 mL) for effektiv blanding. Pass sonified suspension g…

Representative Results

CNC baseret nanocomposite hydrogel blæk viser en stærk ikke-newtonske shear udtynding adfærd (figur 2en). 1.55 × 105 Pa.s på en lav shear rate (0,001 s-1) tilsyneladende viskositet dråber af fem størrelsesordener til en værdi af 22.60 Pa.s på en shear rate af 50 s-1 (≈50 s-1 er et typisk shear rate erfarne under 3D-printning)31 . Hydrogel blæk udstiller en viskoelastiske solid adfærd, som opbeva…

Discussion

3D udskrivning kræver passende rheologiske egenskaber hydrogel blæk. Høj viskositet blæk vil kræve ekstreme pres for sin ekstrudering, mens lav viskositet blæk ikke vil opretholde sin form efter ekstrudering. Viskositet hydrogel blæk kan styres via koncentrationen af ingredienserne. I forhold til vores tidligere arbejde¹¹, er faststofindholdet hydrogel blæk steg fra 5,4 til 9,9 wt % resulterer i koncentreret hydrogel blæk, som hjælper med at forbedre opløsningen af den trykte stillads. …

Materials

60 mL syringe	Structur3D Printing
Alginic acid sodium salt	Sigma-Aldrich	9005-38-3
Anhydrous calcium chloride	Sigma-Aldrich	10043-52-4
Clamps, three pronged, Talon	VWR	241-0404	102 mm, Dual adjustment clamp, large, clamp extension 127 mm
Cura 2.4.0	Ultimaker		Free slicing software
Discov3ry Complete	Structur3D Printing		Ultimaker 2+ 3D printer integrated with Discov3ry paste extruder
Gelatin from bovine skin	Sigma-Aldrich	9000-70-8
Glutaraldehyde solution 50 wt. % in H2O	Sigma-Aldrich	111-30-8
homogenizer	SPX	APV-2000
Instron 5960	Instron		Instron 5960, Biopuls Bath, 100 N load cell, 37 °C,
Physica MCR 301 rheometer	Anton Paar		CP25-2-SN7617, gap height 0.05 mm, 25 °C
Sorvall Lynx 6000 centrifuge	AB Ninolab	s/n 41881692	F12-rotor (6×500 ml)
stainless steel nozzle	Structur3D Printing		800, 600 and 400 µm
thingsinverse	MakerBot's		sharing and downloading 3D printable things in form of stl files
ultra sonication	Qsonica, LLC	Q500
Unbarked wood chips	Norway spruce(Picea abies)		dry matter content of 50–55%