Summary
Här presenterar vi en metod för att registrera embryonala muskelsammandragningar i Drosophila embryon i en icke-invasiv och detalj-orienterad sätt.
Abstract
Koordinerade muskelsammandragningar är en form av rytmisk beteende som setts tidigt under utvecklingen i Drosophila embryon. Neuronala sensoriska återkoppling kretsar krävs för att kontrollera detta beteende. Underlåtenhet att producera det rytmiska mönstret av sammandragningar kan tyda på neurologiska avvikelser. Vi fann tidigare att defekter i protein O-mannosylation, en posttranslationell proteinmodifiering, påverkar axonmorfologin hos sensoriska neuroner och resultera i onormala koordinerade muskelsammandragningar hos embryon. Här presenterar vi en relativt enkel metod för att registrera och analysera mönstret av peristaltiska muskelsammandragningar genom levande avbildning av sena stadier embryon fram till den punkt av kläckning, som vi brukade karakterisera muskelkontraktion fenotyp av protein O-mannosyltransferas mutanter. Data som erhålls från dessa inspelningar kan användas för att analysera muskelkontraktion vågor, inklusive frekvens, spridnings riktning och relativ amplitud av muskelsammandragningar på olika kropps segment. Vi har också undersökt kroppshållning och utnyttjat en fluorescerande markör som uttrycks specifikt i muskler för att exakt bestämma positionen för embryot mittlinjen. Ett liknande tillvägagångssätt kan också utnyttjas för att studera olika andra beteenden under utveckling, såsom embryo rullande och kläckning.
Introduction
Peristaltisk muskelkontraktion är en rytmisk motorisk beteende som liknar promenader och simning i människor1,2,3. Embryonala muskelsammandragningar ses i Drosophila sena stadiet embryon utgör ett exempel på ett sådant beteende. Drosophila är en utmärkt modellorganism för att studera olika utvecklingsprocesser eftersom embryonal utveckling i Drosophila är väl karaktäriserad, relativt kort, och lätt att övervaka. Det övergripande målet med vår metod är att noggrant registrera och analysera vågliknande mönster av kontraktion och avslappning av embryonala muskler. Vi använde en enkel, icke-invasiv metod som erbjuder en detaljerad visualisering, registrering och analys av muskelsammandragningar. Denna metod kan också potentiellt användas för att studera andra in vivo-processer, såsom embryonal rullande ses i sena stadiet embryon strax före kläckningen. I tidigare studier, embryonala muskelsammandragningar analyserades mestadels i termer av frekvens och riktning1,2. För att uppskatta den relativa omfattningen av sammandragningar som de framsteg längs kroppen axeln i främre eller bakre riktning, vi har använt embryon som uttrycker GFP specifikt i muskler. Denna analys ger ett mer kvantitativt sätt att analysera muskelsammandragningar och att avslöja hur kroppshållning i embryon upprätthålls under serie av peristaltiska vågor av muskelsammandragningar.
Peristaltiska muskelsammandragningar styrs av centrala mönster Generator (CPG) kretsar och kommunikation mellan nervceller i det perifera nervsystemet (PNS), det centralanervsystemet (CNS), och muskler4,5. Underlåtenhet att producera normala peristaltiska muskelsammandragningar kan leda till defekter såsom underlåtenhet att kläcka2 och onormal larv förflyttning6 och kan tyda på neurologiska avvikelser. Levande avbildning av peristaltiska vågor av muskelkontraktion och detaljerad analys av kontraktion fenotyper kan hjälpa avslöja patogena mekanismer i samband med genetiska defekter som påverkar muskler och neurala kretsar inblandade i förflyttning. Vi använde nyligen denna metod för att undersöka mekanismer som resulterar i en kroppshållning vridning fenotyp av pprotein O-mannosyltransferase (pomt) mutanter7.
Protein O-mannosylation (POM) är en speciell typ av posttranslationell modifiering, där ett mannos-socker tillsätts till serin-eller treoninrester av sekretoriska väg proteiner8,9. Genetiska defekter i POM orsaka medfödda muskeldystrophies (CMD) hos människor10,11,12. Vi undersökte de orsakande mekanismerna hos dessa sjukdomar med hjälp av Drosophila som modellsystem. Vi fann att embryon med mutationer i Drosophila protein O-mannosyltransferase gener POMT1 och POMT2 (alias roterad buk (RT) och twisted (TW)) visar en förskjutning ("rotation") av kropps segment, vilket resulterar i en onormal kroppshållning7. Intressant, detta fel sammanföll med utvecklingsstadiet när peristaltiska muskelsammandragningar blir framträdande7.
Eftersom onormal kroppshållning i POM muterade embryon uppstår när muskulatur och epidermis redan bildas och peristaltiska vågor av samordnade muskelsammandragningar har börjat, vi hypotesen att onormal kroppshållning kan vara ett resultat av onormal muskel sammandragningar snarare än en defekt i muskler eller/och epidermis morfologi7. CMDs kan associeras med onormala muskelsammandragningar och kroppshållning defekter13, och därmed analysen av hållning fenotyp i Drosophila pomt mutanter kan belysa patologiska mekanismer i samband med muskeldystrofi . För att undersöka sambandet mellan kroppshållning fenotyp av Drosophila pomt mutanter och eventuella avvikelser i peristaltiska vågor av muskelsammandragningar, bestämde vi oss för att analysera muskelsammandragningar i detalj med hjälp av en levande Imaging-metoden.
Vår analys av peristaltiska kontraktion vågor i Drosophila embryon avslöjade två distinkta kontraktion lägen, betecknas som typ 1 och typ 2 vågor. Typ 1 vågor är enkla vågor förökningsmaterial från Anterior till posteriort eller vice versa. Typ 2 vågor är BiPhasic vågor som initierar vid den främre änden, propagera halvvägs i den bakre riktningen, tillfälligt stanna, bildar en temporal statisk kontraktion, och sedan, under den andra fasen, sveps av en peristaltisk kontraktion som propagerar framåt från den bakre änden. Vildtyp embryon genererar normalt en serie av sammandragningar som består av cirka 75% typ 1 och 25% typ 2 vågor. Pomt Mutant embryon genererar däremot typ 1-och typ 2-vågor vid ungefär lika relativa frekvenser.
Vårt tillvägagångssätt kan ge detaljerad information för kvantitativ analys av muskelsammandragningar och embryo rullande7. Detta tillvägagångssätt kan också anpassas för analyser av andra beteenden som involverar muskelsammandragningar, såsom kläckning och genomsökning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. förberedelser
- Förbered en fluga bur genom att göra cirka 50 hål i en 100 mL kapacitet Tri-Corner Plastbägare med en varm 25 G nål (se tabell över material).
- Förbered 60 mm x 15 mm petriskålar med äppeljuice-agar (3% agar och 30% äppeljuice).
- Förbered färsk jästpasta genom att blanda torra jästgranulat och vatten. Sprid jästpasta på äppel agar plattor för att öka äggläggning.
- Anaesthetize om 50-60 flugor (Använd ungefär lika många män och kvinnor) på CO2 och Lägg dem i fluga buren.
Anmärkning: Med hjälp av en ökad andel kvinnor (upp till ~ 2:1 förhållandet mellan kvinnor: män) kan bidra till att öka mängden lade ägg för vissa genotyper. - Bifoga en äppeljuice-agar petriskål med jästpasta till fluga buren tätt och täta den med modellering lera. Se till att den är förseglad i alla hörn.
- Vänta tills flugor vaknar från anestesi och sedan Invertera buren så att petriskål är nu i botten. Placera buren i en inkubator med kontrollerad temperatur (25 ° c) och luftfuktighet (60%).
- Låt flugor att lägga ägg för 2-3 h, ersätta äpplet plattan med en ny, och låt plattan med ägg ålder för 19-20 h i en inkubator.
Anmärkning: Före ovanstående steg, flugor måste synkroniseras för att underlätta insamling av steg 17e-f (19-21 h AEL) embryon. Detta kan åstadkommas genom att överföra flugor till en bur med en färsk jäst-äppeljuice-agar tallrik 3-4 gånger för 12 h (en gång varje 3-4 h). Att hålla flugor i kontrollerad dygns ljus miljö (LD Cycle) kan också hjälpa till med att samla in en synkroniserad population av embryon, men detta var inte nödvändigt i våra experiment.
2. insamling av embryon
- Noggrant plocka embryon med en våt pensel och placera dem i en samlande glas maträtt fylld med 1x PBS.
- Välj de embryon som har sina trakeae fyllda med luft. Luftfyllda luftstrupar indikerar att embryon har nått etapp 17 och att deras peristaltiska muskelsammandragningar borde ha påbörjats. Tracheae blir tydligt synligt när de fylls med luft, vilket kan fungera som en markör för etapp 17.
- Placera en äppeljuice agar platta på en glasskiva och noggrant överföra embryon från PBS till plattan. Rada upp embryona med sin ventrala sida upp.
Anmärkning: Dorsala och ventrala sidor av embryon kan särskiljas genom placeringen av dorsala bihang på äggskal. - Gör en rektangulär vax gräns på en annan glas bild med hjälp av en vax penna (se tabell över material).
- Placera en dubbelsidig tejp inom den gränsen och försiktigt plocka upp embryon genom att sänka denna bild på agarplattan. Applicera skonsamt tryck för att se till att embryon fastnar på tejpen väl, med sin rygg sida upp. Om det behövs kan embryon rullas på tejpen för att korrigera deras orientering. Gör alla manipulationer medan övervakning av embryon under en dissektion Mikroskop.
- Täck embryon med 1x PBS för levande avbildning av muskelsammandragningar.
Anmärkning: Vissa procedurer som beskrivs ovan är relaterade till grundläggande Drosophila tekniker som används i många studier. Mer detaljerade beskrivningar av de vanligaste Drosophila teknikerna finns på andra ställen14.
3. registrering av embryon
- Utföra Live-avbildning av monterade embryon på en epiflourescence Mikroskop med en time-lapse funktion och en digitalkamera med lämpliga utsläpp filter (se tabell över material) med hjälp av en 10X vatten fördjupning objektiv.
Anmärkning: Här har vi använt embryon som uttrycker GFP i muskler. Andra fluorescerande markörer med lämplig excitation ljus och utsläpp filteruppsättningar kan också användas (t. ex. för tdTomato upptäckt, kan man använda en Chroma ET-561 Filter Set för excitation och utsläpp runt optimala 554 nm och 581 nm, respektive). - Utför livevideoinspelning av embryon med hjälp av lämplig programvara (se tabell över material) för ca 1-2 h med en förvärvsfrekvens på 4 frames/s.
Anmärkning: För att analysera rullande utveckling av embryot i sitt skal, kan embryon utan uttryck av fluorescerande markörer användas. I detta syfte används regelbunden genomlysnings belysning utan spektrala filter för att visualisera embryorörelser i skalet (se film 2).
4. analys av inspelningarna
- Exportera den inspelade videon direkt till bild J för ytterligare analyser (t. ex. som AVI-filer).
- I ImageJ, beskära videoinspelningar till storleken på enskilda embryon genom att dra en ruta runt varje embryo och sedan klicka på bilden > gröda. Detta minskar kraftigt storleken på videofiler utan att påverka dess upplösning och underlättar deras analys.
- Rotera beskurna bilder för att uppnå vertikal placering av embryo mittlinjen i förhållande till skärmen, genom att klicka på bilden > omvandla > Rotera.
Anmärkning: Att välja Förhandsgranska under den här processen ger vägledning för rotation och visar stödlinjer för att säkerställa vertikal placering av mittlinjen. - Kvantitativ analys av embryorullande :
För avstånds analyser ska du först bekräfta att bilderna innehåller skalnings information. Bild skala kan läggas till genom att välja analysera ≫ ange skala, och sedan ange en konvertering av pixlar till avstånd, t. ex mikrometer- Markera positionen för en eller båda trakeae i den första bildrutan i videon på en punkt halvvägs mellan posteriort och främre ändar. Klicka på analysera > verktyg > ROI Manager och spela in denna position som slice Number-y koordinat-x samordna genom att dra en låda på cirka 7 μm med 7 μm runt den och skriva t på tangentbordet. Se till att en region av intresse väljs i videon när du skriver t. Du kan också välja fliken Lägg till (t) i Roi-hanteraren för att registrera luftstrupen-positionen istället för att skriva kommandot.
Anmärkning: Regionen av intresse kan variera i form eller storlek beroende på den embryonala regionen eller utvecklings händelse som studeras. - Markera positionen för samma område av luftstrupen efter varje peristaltisk kontraktion. Mät avståndet från före sammandragning position till efter sammandragning position genom att dra en linje som förbinder centra i varje ruta och skriva m på tangentbordet. Konvertera avståndet till μm med hjälp av en känd bild skala. Alternativt kan du mäta avståndet i μm i ett enda steg genom att klicka på analysera ≫ Ange skala och ange den kända pixel-till-micron konverteringsfaktorn för att ge en rapport i mikrometer.
Anmärkning: Ett avstånd i pixlar kan matas in tillsammans med motsvarande avstånd i μm. - Korrelera avståndet och riktningen för varje rullande händelse med riktningen av muskelsammandragning förökning i minst 8 embryon för statistiskt signifikanta skillnader.
- Markera positionen för en eller båda trakeae i den första bildrutan i videon på en punkt halvvägs mellan posteriort och främre ändar. Klicka på analysera > verktyg > ROI Manager och spela in denna position som slice Number-y koordinat-x samordna genom att dra en låda på cirka 7 μm med 7 μm runt den och skriva t på tangentbordet. Se till att en region av intresse väljs i videon när du skriver t. Du kan också välja fliken Lägg till (t) i Roi-hanteraren för att registrera luftstrupen-positionen istället för att skriva kommandot.
- Kvantitativ analys av embryonala muskelsammandragningar:
- Använda embryon som uttrycker fluorescerande markörer i muskler (t. ex., vi använde transgena flugor som uttrycker en fusion konstruktion av MYosin Heavy CHain promotor och GFP kallas MHC-GFP5) för att analysera muskelkontraktion parametrar såsom kontraktion amplitud.
- Använd inspelningen av fluorescerande avläsning och rita en region av intresse (t. ex. en låda på 15 μm till 45 μm [HXW]) centrerad på musklerna (som är tydligt synlig på grund av närvaron av fluorescerande markör) av ett visst kropps segment, och välj Lägg till (t) fliken på th e ROI Manager för att registrera positionen för ROI. Klicka på ROI manager > åtgärd för att registrera den genomsnittliga fluorescerande intensiteten för varje intresse region som valts för varje bildruta i videoklippet.
- Flytta rutan till centra för andra organ segment av intresse och klicka på Lägg till (t) i Roi Manager att registrera sina positioner. Detta kommer att ge regioner av intresse av identisk storlek i alla kropps segment som ska analyseras. Välj minst en posteriort, en mediala och ett främre segment, till exempel A7, A4 respektive t2.
- I ROI-hanteraren väljer du alla intresseområden som registrerats som segmentnummer-y koordinat-x-koordinat (t. ex. genom att markera medan du håller ned CTRL) och klicka på fler > multimått för att mäta medelvärdet för fluorescerande intensitet för varje region av intresse för alla bildrutor i videon och rapportera varje mätning i en tabell. Varje region av intresse är en kolumn i tabellen och varje bildruta är en rad. Överför tabellen till ett kalkylbladsprogram för ytterligare analyser.
- Rita ett diagram med bildrutenummer på x-axeln och genomsnittlig fluorescerande intensitet på y-axeln. Bildrutenummer kan konverteras till tid med hjälp av bildrutefrekvensen (4 bilder/s) på videon (bild 1a).
- Bestäm muskelkontraktion amplitud genom att uppskatta ökningen av GFP fluorescens intensitet i förhållande till baslinjen. Muskelsammandragningar öka GFP intensitet som de ger mer GFP i närheten av fokusområdet som mer muskler få dras in under dessa sammandragningar (film 1)7. Upprätta en baslinjefluorescens som den genomsnittliga intensiteten mellan kontraktion vågor. Normalisera GFP-intensiteten till baslinjen genom att dividera alla ROI-intensitetsvärden med baslinjens intensitet.
Anmärkning: Varje profil har en annan baslinje fluorescens, eftersom det kan finnas olika uttrycks nivåer i olika muskel segment.
Anmärkning: En potentiell komplikation är att GFP-fluorescensen kan förändras med tiden på grund av foto blekning. Detta kan lösas genom att övervaka förändringar i fluorescensbas linjen och använda en tillräcklig provstorlek för våg analyser (vi använder normalt uppsättningar av 10 fluorescerande vågor och bekräftar att baslinjen är ungefär konstant genom att ta ett genomsnitt av endast de topp som baslinje som har minskat i fluorescens med 10% eller mindre i förhållande till den initiala minima-toppen). En pulsled-belysning kan också användas för att lindra problemet16. - Jämför muskelsammandragningar på vänster och höger sida av embryot genom att analysera toppintensiteter på båda sidor av embryot för samma segment. Använd kontraktion amplitud och tid för Peak intensiteter att undersöka skillnader i omfattning och timing av peristaltiska muskelkontraktion vågor förökningsmaterial längs båda sidor av embryot.
- Jämför normaliserad intensitet av GFP på olika segment (t. ex., vid anterior, mediala och posteriora regioner) under muskelsammandragning våg förökning att undersöka förändringar i sammandragning som vågen propar. Denna analys bestämmer också riktningen av vågen (dvs, om det sprider sig mot främre eller bakre regioner av embryot).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Normala peristaltiska muskelsammandragningar visas i en WT (Wild-Type, Canton-S) embryo i film 1. Den genomsnittliga frekvensen av peristaltiska vågor av muskelsammandragningar i vår analys var 47 sammandragningar per timme och den genomsnittliga amplituden var 60% över baslinjen för WT-embryon. Embryorullande visas för ett WT -embryo i film 2, med den vita pilen som markerar den ursprungliga positionen för ett luftstrupe och en svart pil som visar positionen för en dorsala bihang. Den dorsala bihang (exteriör) inte rör sig medan trakeae (inre) gör, vilket tyder på att embryot har rullat i skalet
I vår analys av mönster av muskelsammandragningar, vi utsett en peristaltisk kontraktion som en typ 1 våg om dess profil har en topp som uppstår vid den bakre regionen först, följt av toppar i mellersta och främre regioner (framåt våg) eller en profil där toppen först uppstår på främre segment och sedan sprider mot bakre regioner (bakåt våg) (figur 2A och film 1). Vi observerade också en annan typ av vågor som vi betecknas som typ 2. Typ 2 vågor börjar i ena änden av embryot (vanligtvis anterior), Fortsätt mot mitten regioner, och sedan återvända till sitt ursprung som en svepande våg åter initieras i motsatt ände (figur 2a och film 1, våg 4). Pomt Mutant embryon uppvisar onormal relativ frekvens av våg generationen typ 1/typ 2 (figur 3), vilket resulterar i onormala kroppsställningar, kroppsvridning (eller "rotation") fenotyp (figur 4).
Figur 1 A visar muskelkontraktion amplitud övervakas över tiden som NORMALISERADE GFP intensitet vid olika embryo segment (Anterior, mellersta och bakre). Toppar under 165-178 s tidsperiod representerar en enkel framåtvåg (typ 1). Figur 1 B visar att det inte finns någon skillnad i amplituden (avbildad som GFP-intensitet) och tid för muskelsammandragningar på höger och vänster sida av embryot.
Figur 2 visar typ 1 och typ 2 muskelkontraktion profiler som genereras med hjälp av GFP intensitet som ett mått på kontraktion amplitud. En typ 1 våg är en enda våg som genereras vid den främre eller bakre änden av embryot som fortsätter förökning mot den motsatta änden. Typ 2 är en BiPhasic våg där vågen sprider sig till mitten av embryot under den första fasen och sedan återvänder till ursprunget som en peristaltisk kontraktion återupptas i motsatt ände. Varje våg linje representerar normaliserad GFP intensitet upptäcks i successiva kropps segment av ett embryo, och toppar motsvarar muskelkontraktion. Lutande utseendet på topparna illustrerar att muskelsammandragningar propagera längs på varandra följande segment, från Anterior till posteriort, eller vice versa, och därmed toppar inträffar i ett sammanhängande sätt i successiva kropps segment.
Figur 3 innehåller grafer av kontraktion Wave serie i WT och pomt Mutant embryon. Diagrammen illustrerar att typ 2 kontraktion vågor genereras vid ökad relativ frekvens i Pomt mutanter, jämfört med WT embryo. Serien av vågor i WT embryo (Top Graph) skildrar de sammandragningar som visas i film 1.
Figur 4 visar fasta och pomt -muterade embryon med muskler färgade med fluorescein-konjugerat phalloidin för att belysa embryots kroppshållning. Den böjda streckad linje illustrerar kroppen hållning fenotyp av en POMT Mutant.
Film 1: exempel på peristaltiska muskelsammandragningar av ett WT-embryo. Muskelsammandragningar visas i en bitars format för att illustrera ökning av GFP intensitet när kontraktion sker (de flesta ljusa pixlar är röda). Videon förvärvades vid 4 frames/s (FPS) och visas på 20 fps. Vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ned.)
Film 2: en vild-typ embryo rullande inom sitt skal. Vit pil indikerar den ursprungliga positionen för en luftstrupe, och svart pil indikerar positionen för en dorsala bihang. Observera att när embryot rullar, luftrör position förändringar men dorsala bihang inte flytta, vilket illustrerar att embryot rullar inuti dess äggskal. Vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ned.)
Figur 1 : Muskelkontraktion amplitud. (A) GFP-intensitet ritas mot (Y-axelns) tid (X-axel) för olika kropps segment av embryot. B) GFP-intensitet (Y-axel) som ritas mot tiden för vänster och höger sida av samma segment av ett avtalsslutande embryo. Bildrutehastigheten är 4 bildrutor/s för båda diagrammen. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Typ 1 och typ 2 peristaltiska muskelkontraktion våg profiler. (A) typ 1 våg profil där enskilda linjer representerar NORMALISERADE GFP-intensiteter av vissa kropps segment över tiden, medan topparna indikerar kontraktion händelser. (B) typ 2 våg profil som visar ett exempel på en BiPhasic kontraktion våg, ritas på samma sätt som i a. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Serie av kontraktion vinkar genererat av Wild-Type och pomt Mutant embryon. Blå och röda staplar visar typ 1-respektive typ 2-vågor. Observera att Pomt Mutant genererar en ökad andel av typ 2-vågor, jämfört med WT. WT-grafen representerar sammandragningar som visas i film 1. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : Fasta och färgade pomt Mutant (RT–) och WT embryon. Observera rotationen i kropps segmenten av det Pomt -muterade embryot, som markeras med en streckad linje som spårar mitt linjens position. Musklerna visualiseras med hjälp av färgning med fluorescein-konjugerat phalloidin. Anterior är till vänster, är dorsala upp. Scale bar = 100 mm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vår metod ger ett kvantitativt sätt att analysera viktiga embryobeteenden under utveckling, såsom peristaltiska muskelkontraktion vågor, inklusive vågperiodicitet, amplitud och mönster, samt våg effekt på embryots rullande och kroppshållning. Detta kan vara användbart i analyser av olika mutanter för att studera betydelsen av specifika gener i regleringen av dessa och andra beteenden under embryonal utveckling. Vi har använt förändringar i muskelspecifika GFP markör intensitet för att analysera muskelkontraktion amplitud, frekvens och riktning av kontraktion vågutbredning hos embryon. Dessa förändringar i GFP signal återspeglar omfattningen av sammandragningar, som upphandlande organ segment föra mer GFP i en ROI och närheten av fokusområdet. Denna metod förenklar betydligt analyser och ger en bättre visuell representation av mönstret av peristaltiska kontraktion vågor.
I våra experiment använde vi genotyper med muskelspecifikt transgena uttryck av GFP för att visualisera och studera i detalj muskelsammandragningar under embryonal utveckling. Andra studier använde en liknande metod för att analysera larv rörelse såsom genomsökning och böjning5,15. En liknande teknik för att studera samordnade muskelsammandragningar tillämpades tidigare för Sandwich beredning av embryon, vilket är en mer invasiv metod som kan påverka embryots beteende och utveckling3. Däremot är vår metod helt icke-invasiv och embryona är ogenomträngade under analyser. Vårt protokoll kräver inte att embryona ska dekorioneras eller devitellinated, och levande embryon av intresse kan återvinnas efter analyser och sprids för ytterligare analyser.
Vår metod kan potentiellt utvecklas ytterligare för en hög innehållsanalys (HCA)-baserad screening för att isolera och analysera mutationer som påverkar embryonala muskelsammandragningar och andra beteenden och utvecklingsprocesser. Denna strategi, till exempel, kan användas för att samtidigt registrera muskelsammandragningar av många embryon och för att bedöma deras svar på olika stimuli, droger, eller miljöförändringar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Projektet stöddes delvis av National Institutes of Health Grants RO1 NS099409, NS075534, och CONACYT 2012-037 (S) till VP.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Digital camera | Hamamatsu CMOS ORCA-Flash 4.0 | C13440-20CU | With different emission filters |
| Forceps | FST Dumont | 11254-20 | Tip Dimensions 0.05 mm x 0.01 mm |
| LED | X-cite BDX (Excelitas) | XLED1 | |
| Microscope | Carl Ziess Examiner D1 | 491405-0005-000 | Epiflourescence with time lapse |
| Needle | BD | 305767 | 25 G x 1-1/2 inch |
| Paintbrush | Contemporary crafts | Any paintbrush will work | |
| Petri dishes | VWR | 25384-164 | 60 mm x 15 mm |
| Software | HCImage Live | ||
| Thread Zap Wax pen | Thread Zap II (by BeadSmith)(Amazon) | TZ1300 | Burner Tool |
| Tricorner plastic beaker | VWR | 25384-152 | 100 mL |
References
- Pereanu, W., Spindler, S., Im, E., Buu, N., Hartenstein, V. The emergence of patterned movement during late embryogenesis of Drosophila. Developmental Neurobiology. 67, 1669-1685 (2007).
- Suster, M. L., Bate, M. Embryonic assembly of a central pattern generator without sensory input. Nature. 416, 174-178 (2002).
- Crisp, S., Evers, J. F., Fiala, A., Bate, M. The development of motor coordination in Drosophila embryos. Development. 135, 3707-3717 (2008).
- Song, W., Onishi, M., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Peripheral multidendritic sensory neurons are necessary for rhythmic locomotion behavior in Drosophila larvae. Proceedings of National Academy of Science of the United States of America. 104, 5199-5204 (2007).
- Hughes, C. L., Thomas, J. B. A sensory feedback circuit coordinates muscle activity in Drosophila. Molecular and Cellular Neuroscience. 35, 383-396 (2007).
- Gorczyca, D. A., et al. Identification of Ppk26, a DEG/ENaC channel functioning with Ppk1 in a mutually dependent manner to guide locomotion behavior in Drosophila. Cell Reports. 9, 1446-1458 (2014).
- Baker, R., Nakamura, N., Chandel, I., et al. Protein O-Mannosyltransferases affect sensory axon wiring and dynamic chirality of body posture in the Drosophila embryo. Journal of Neuroscience. 38 (7), 1850-1865 (2018).
- Nakamura, N., Lyalin, D., Panin, V. M. Protein O-mannosylation in animal development and physiology: From human Disorders to Drosophila phenotypes. Seminars in Cell & Developmental Biology. 21, 622-630 (2010).
- Lyalin, D., et al. The twisted gene encodes Drosophila protein O-mannosyltransferase 2 and genetically interacts with the rotated abdomen gene encoding Drosophila protein O-mannosyltransferase 1. Genetics. 172, 343-353 (2006).
- Beltrán-Valero de Bernabe, D., et al. Mutations in the O-Mannosyltransferase gene POMT1 give rise to the severe neuronal migration disorder Walker-Warburg Syndrome. American Journal of Human Genetics. 71, 1033-1043 (2002).
- Reeuwijk, J., et al. POMT2 mutations cause alpha-dystroglycan hypoglycosylation and Walker-Warburg syndrome. Journal of Medical Genetics. 42, 907-912 (2005).
- Jaeken, J., Matthijs, G. Congenital disorders of glycosylation: A rapidly expanding disease family. Annual Reviews of Genomics and Human Genetics. 8, 261-278 (2007).
- Leyten, Q. H., Gabreels, F. J., Renier, W. O., ter Laak, H. J. Congenital muscular dystrophy: a review of the literature. Clinical and Neurological Neurosurgery. 98 (4), 267-280 (1996).
- Roberts, D. B. Drosophila: A Practical Approach. 2nd ed. The Practical Approach Series. Hames, B. D. , Oxford University Press. New York. 389 (1998).
- Heckscher, E. S., et al. Even-Skipped+ interneurons are core components of a sensorimotor circuit that maintains left-right symmetric muscle contraction amplitude. Neuron. 88, 314-329 (2015).
- Penjweini, R., et al. Long-term monitoring of live cell proliferation in presence of PVP-Hypericin: a new strategy using ms pulses of LED and the fluorescent dye CFSE. J. Microscopy. 245, 100-108 (2011).
