Summary
Hier presenteren we een methode om embryonale spiercontracties in Drosophila embryo's op te nemen op een niet-invasieve en detail georiënteerde manier.
Abstract
Gecoördineerde spiercontracties zijn een vorm van ritmisch gedrag dat vroegtijdig wordt gezien tijdens de ontwikkeling van Drosophila -embryo's. Neuronale sensorische feedback circuits zijn vereist om dit gedrag te beheersen. Het niet produceren van het ritmische patroon van weeën kan een indicatie zijn van neurologische afwijkingen. We ontdekten eerder dat defecten in eiwit-O-mannosylatie, een posttranslationele eiwit modificatie, de axon morfologie van sensorische neuronen aantasten en resulteren in abnormale gecoördineerde spiercontracties in embryo's. Hier presenteren we een relatief eenvoudige methode voor het opnemen en analyseren van het patroon van peristaltische spiercontracties door Live beeldvorming van laat stadium embryo's tot het punt van broedeieren, die we gebruikten om de spiercontractie fenotype van eiwit te karakteriseren O-mannosyltransferase mutanten. Gegevens verkregen uit deze opnames kunnen worden gebruikt om spiercontractie golven te analyseren, inclusief frequentie, richting van vermeerdering en relatieve amplitude van spiercontracties op verschillende lichaams segmenten. We hebben ook de lichaamshouding onderzocht en gebruik gemaakt van een fluorescerende marker die specifiek in spieren is uitgedrukt om de positie van de embryo-middenlijn nauwkeurig te bepalen. Een soortgelijke aanpak kan ook worden gebruikt om verschillende andere gedragingen tijdens de ontwikkeling te bestuderen, zoals het rollen van embryo's en broedeieren.
Introduction
Peristaltische spiercontractie is een ritmisch motorische gedrag vergelijkbaar met wandelen en zwemmen bij mensen1,2,3. Embryonale spiercontracties gezien in Drosophila late stadium embryo's vormen een voorbeeld van een dergelijk gedrag. Drosophila is een uitstekend modelorganisme om verschillende ontwikkelingsprocessen te bestuderen, omdat de embryonale ontwikkeling in Drosophila goed gekarakteriseerd, relatief kort en gemakkelijk te monitoren is. Het algemene doel van onze methode is om het wavelike patroon van contractie en ontspanning van embryonale spieren zorgvuldig op te nemen en te analyseren. We gebruikten een eenvoudige, niet-invasieve aanpak die een gedetailleerde visualisatie, opname en analyse van spiercontracties biedt. Deze methode kan ook worden gebruikt om andere in vivo processen te bestuderen, zoals embryonaal rollen gezien in laat stadium embryo's net voor het uitkomen. In eerdere studies werden embryonale spiercontracties voornamelijk geanalyseerd in termen van frequentie en richting1,2. Om de relatieve omvang van de weeën te schatten als ze langs de hoofdas in de voorste of achterste richting gaan, hebben we embryo's gebruikt om GFP specifiek in spieren uit te drukken. Deze analyse biedt een meer kwantitatieve manier om te analyseren spiercontracties en om te onthullen hoe de lichaamshouding in embryo's wordt gehandhaafd tijdens de reeks van peristaltische golven van spiercontracties.
Peristaltische spiercontracties worden bestuurd door centrale patroon Generator (CPG) circuits en communicatie tussen neuronen van het perifere zenuwstelsel (PNS), het centrale zenuwstelsel (CNS), en de spieren4,5. Het niet produceren van normale peristaltische spiercontracties kan leiden tot defecten zoals het niet uitkomen van2 en abnormale larvale motoriek6 en kan indicatief zijn voor neurologische afwijkingen. Live beeldvorming van peristaltische golven van spiercontractie en gedetailleerde analyse van contractie fenotypes kunnen helpen bij het ontdekken van pathogene mechanismen in verband met genetische defecten die invloed hebben op de spieren en neurale circuits die betrokken zijn bij de motoriek. Onlangs gebruikten we die benadering om mechanismen te onderzoeken die resulteren in een lichaamshouding torsie fenotype van protein O-mannosyltransferase (pomt) mutanten7.
Proteïne O-mannosylation (POM) is een speciaal type posttranslationele modificatie, waarbij een mannose-suiker wordt toegevoegd aan serine-of Threonine-residuen van secretoire pathway-eiwitten8,9. Genetische defecten in POM veroorzaken aangeboren spier dystrofieën (CMD) bij de mens10,11,12. We onderzochten de causatieve mechanismen van deze ziekten met behulp van Drosophila als een modelsysteem. We constateerden dat embryo's met mutaties in Drosophila proteïne O-mannosyltransferase -genen POMT1 en POMT2 (a.k.a. geroteerde buik (RT) en twisted (tw)) een verplaatsing ("rotatie") van lichaams segmenten, wat resulteert in een abnormale lichaamshouding7. Belangwekkend, dit defect viel samen met de ontwikkelingsfase wanneer peristaltische spiercontracties worden prominent7.
Aangezien abnormale lichaamshouding bij POM Mutant embryo's ontstaat wanneer spieren en epidermis al worden gevormd en peristaltische golven van gecoördineerde spiercontracties zijn begonnen, veronderstellen we dat abnormale lichaamshouding een gevolg kan zijn van abnormale spier samentrekkingen in plaats van een defect in spier of/en epidermis morfologie7. Cmd's kunnen worden geassocieerd met abnormale spiercontracties en houdings defecten13, en dus kan de analyse van de houdings fenotype in Drosophila pomt mutanten de pathologische mechanismen van spier dystrofieën verheldeert . Om de relatie tussen de lichaamshouding fenotype van Drosophila pomt mutanten en mogelijke afwijkingen in peristaltische golven van spiercontracties te onderzoeken, hebben we besloten om spiercontracties in detail te analyseren met behulp van een live Imaging-benadering.
Onze analyse van peristaltische contractie golven in Drosophila embryo's onthulde twee verschillende contractie modi, aangeduid als type 1 en type 2-golven. Type 1 golven zijn eenvoudige golven die van voorste naar posterieure of omgekeerd. Type 2 golven zijn bifasische golven die beginnen aan het voorste uiteinde, de helft in de achterste richting voortplanten, kortstondig stoppen, een temporele statische contractie vormen, en vervolgens, tijdens de tweede fase, worden geveegd door een peristaltische contractie die voortgaat naar voren vanaf het achterste uiteinde. Wild-type embryo's genereren normaalgesproken een reeks contracties die bestaat uit ongeveer 75% type 1 en 25% type 2 golven. In tegenstelling, genereren Pomt Mutant embryo's type 1 en type 2 golven op ongeveer gelijke relatieve frequenties.
Onze aanpak kan gedetailleerde informatie bieden voor kwantitatieve analyse van spiercontracties en embryo Rolling7. Deze aanpak kan ook worden aangepast voor analyses van andere gedragingen waarbij spiercontracties, zoals uitbroeden en kruipen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. voorbereiding
- Maak een vlieg kooi door ongeveer 50 gaten te maken in een 100 mL capaciteit Tri-hoek plastic bekerglas met een hete 25 G naald (Zie tabel met materialen).
- Bereid 60 mm x 15 mm Petri schaaltjes met appelsap-agar (3% agar en 30% appelsap).
- Bereid verse gist pasta door droge gist korrels en water te mengen. Verdeel de gist pasta op de Apple agar platen om het leggen van eieren te verhogen.
- Anesthetiseer ongeveer 50-60 vliegen (gebruik ongeveer gelijke aantallen mannetjes en vrouwtjes) op CO2 en zet ze in de vlieg kooi.
Opmerking: Met behulp van een toegenomen aandeel van vrouwtjes (tot ~ 2:1 verhouding van vrouwtjes: mannetjes) kan helpen verhogen de hoeveelheid gelegde eieren voor sommige genotypes. - Bevestig een appelsap-agar Petri schaal met gist pasta aan de Fly Cage strak en verzegel het met modelleer klei. Zorg ervoor dat deze in alle hoeken is verzegeld.
- Wacht tot de vliegen wakker worden van anesthesie en keer vervolgens de kooi om, zodat de Petri schaal nu aan de onderkant is. Plaats de kooi in een incubator met een gecontroleerde temperatuur (25 °C) en een luchtvochtigheid (60%).
- Laat vliegen om eieren te leggen voor 2-3 h, vervang de appel plaat met een nieuwe, en laat de plaat met eieren leeftijd voor 19-20 h in een incubator.
Opmerking: Vóór de bovenstaande stap moeten vliegen worden gesynchroniseerd om de inzameling van 17e-f (19-21 h AEL) embryo's te vergemakkelijken. Dit kan worden bereikt door het overbrengen van vliegen naar een kooi met een verse gist-appelsap-agar plaat 3-4 keer voor 12 h (eenmaal per 3-4 h). Het houden van vliegen op gecontroleerde circadiane lichte omgeving (LD-cyclus) kan ook helpen bij het verzamelen van een gesynchroniseerde populatie van embryo's, maar dit was niet essentieel in onze experimenten.
2. inzameling van embryo's
- Kies zorgvuldig embryo's met een natte kwast en plaats ze in een verzamelglas schotel gevuld met 1x PBS.
- Selecteer de embryo's met een tracheae gevuld met lucht. Met lucht gevulde tracheae blijkt dat de embryo's stadium 17 hebben bereikt, en hun peristaltische spiercontracties moeten zijn begonnen. Tracheae worden duidelijk zichtbaar als ze gevuld zijn met lucht, wat kan dienen als een marker voor stage 17.
- Plaats een appelsap agar-plaat op een glazen glijbaan en breng embryo's van PBS naar de plaat. Lijn de embryo's uit met hun ventrale kant omhoog.
Opmerking: Dorsale en ventrale zijden van embryo's kunnen worden onderscheiden door de positie van dorsale aanhangsels op de eierschaal. - Maak een rechthoekige Wax grens op een andere glazen dia met behulp van een wax-pen (Zie tabel met materialen).
- Plaats een dubbelzijdige plakband binnen die grens en pak de embryo's voorzichtig op door deze op de agar-plaat te verlagen. Breng zachte druk aan om ervoor te zorgen dat embryo's goed aan de tape kleven, met hun rugzijde naar boven. Indien nodig kunnen embryo's op de tape worden gerold om hun oriëntatie te corrigeren. Doe alle manipulaties tijdens het monitoren van embryo's onder een dissectie Microscoop.
- Bedek embryo's met 1x PBS voor Live beeldvorming van spiercontracties.
Opmerking: Sommige procedures die hierboven zijn beschreven, zijn gerelateerd aan elementaire Drosophila-technieken die in veel studies worden gebruikt. Meer gedetailleerde beschrijvingen van de gewone Drosophila technieken zijn elders te vinden14.
3. registratie van embryo's
- Voer Live beeldvorming van gemonteerde embryo's uit op een epiflourescence Microscoop met een time-lapse-functie en een digitale camera met geschikte emissie filters (Zie tabel met materialen) met behulp van een 10x water onderdompeling objectief lens.
Opmerking: Hier gebruikten we embryo's die GFP in spieren uitdrukken. Andere fluorescerende markers met geschikte excitatie licht en emissie filter sets kunnen ook worden gebruikt (bv. voor tdTomato detectie kan men een chroma ET-561 Filterset gebruiken voor excitatie en emissie rond respectievelijk 554 nm en 581 nm). - Voer live video-opnames van embryo's uit met behulp van geschikte software (Zie tabel met materialen) voor ongeveer 1-2 uur met een acquisitie ratio van 4 frames/s.
Opmerking: Om het rollen van het zich ontwikkelende embryo binnen de schil te analyseren, kunnen embryo's zonder expressie van fluorescerende markers worden gebruikt. Hiertoe wordt regelmatig uitgezonden licht verlichting zonder spectrale filters toegepast om de embryo beweging in de schaal te visualiseren (Zie film 2).
4. analyse van de opnames
- Exporteer de opgenomen video rechtstreeks naar afbeelding J voor verdere analyses (bijv. als AVI-bestanden).
- Snijd in ImageJ de video-opnames af op de grootte van individuele embryo's door een vak rond elk embryo te tekenen en vervolgens op afbeelding > bijsnijdente klikken. Dit vermindert de grootte van videobestanden aanzienlijk zonder de resolutie te beïnvloeden en vergemakkelijkt hun analyse.
- Roteer bijgesneden afbeeldingen om de verticale positie van de middellijn van het embryo te bereiken ten opzichte van het scherm, door te klikken op afbeelding > Transformeren > roteren.
Opmerking: Als u voor vertoning selecteert tijdens dit proces, worden er richtlijnen voor rotatie weergegeven, zodat de verticale positie van de middenlijn wordt gegarandeerd. - Kwantitatieve analyse van de embryonale Rolling :
Opmerking: voor afstands analyses bevestig je eerst dat je afbeeldingen schaal informatie bevatten. Afbeeldings schaal kan worden toegevoegd door analyseren ≫ ingestelde schaalte selecteren en vervolgens een conversie van pixels naar afstanden in te voeren, bijvoorbeeld micrometers- Markeer de positie van een of beide tracheae in het eerste frame van de video op een punt halverwege de achterste en voorste uiteinden. Klik op analyseer > tools > ROI Manager en noteer deze positie als Segmentnummer-y coördinaat-x coördinaat door een doos van ongeveer 7 μm met 7 μm eromheen te tekenen en t op het toetsenbord te typen. Zorg ervoor dat bij het typen van t, een regio van belang is geselecteerd op de video. U ook het tabblad toevoegen (t) op de ROI Manager selecteren om de positie van de luchtpijp op te nemen in plaats van de opdracht te typen.
Opmerking: De regio van belang kan variëren in vorm of grootte, afhankelijk van de embryonale regio of het ontwikkelings evenement wordt bestudeerd. - Markeer de positie van hetzelfde gebied van de luchtpijp na elke peristaltische contractie. Meet de afstand van de voor contractie positie tot de post-contractie positie door een lijn te tekenen die de centra van elke doos verbindt en m op het toetsenbord typt. Converteer de afstand naar μm met behulp van een bekende schaal van afbeeldingen. U ook de afstand in μm in één stap meten door te klikken op analyseren ≫ schaal instellen en voer de bekende conversiefactor voor pixel-naar-micron in om een rapport in microns te leveren.
Opmerking: Een afstand in pixels kan samen met de corresponderende afstand in μm worden ingevoerd. - Correleren de afstand en richting van elk voortschrijdend voorval met de richting van de spiercontractie propagatie in ten minste 8 embryo's voor statistisch significante verschillen.
- Markeer de positie van een of beide tracheae in het eerste frame van de video op een punt halverwege de achterste en voorste uiteinden. Klik op analyseer > tools > ROI Manager en noteer deze positie als Segmentnummer-y coördinaat-x coördinaat door een doos van ongeveer 7 μm met 7 μm eromheen te tekenen en t op het toetsenbord te typen. Zorg ervoor dat bij het typen van t, een regio van belang is geselecteerd op de video. U ook het tabblad toevoegen (t) op de ROI Manager selecteren om de positie van de luchtpijp op te nemen in plaats van de opdracht te typen.
- Kwantitatieve analyse van de contracties van embryonale spieren:
- Gebruik embryo's die fluorescerende markers in spieren uitdrukken (we gebruikten bijvoorbeeld transgene vliegjes die een fusie-constructie van MYosin HEavy CHain promoter en GFP genoemd MHC-GFP5) om de spiercontractie parameters te analyseren, zoals de amplitude van de contractie.
- Gebruik de opname van fluorescerende uitlezen en teken een regio van belang (bijv. een doos van 15 μm tot 45 μm [HXB]) gecentreerd op de spieren (die duidelijk zichtbaar zijn vanwege de aanwezigheid van fluorescerende marker) van een bepaald lichaams segment, en selecteer het tabblad toevoegen (t) op th e ROI Manager om de positie van de ROI te registreren. Klik op ROI manager ≫ maatregel om de gemiddelde fluorescentie intensiteit van elke regio van interesse die voor elk frame van de video is geselecteerd, op te nemen.
- Verplaats het vak naar de centra van andere lichaams segmenten van belang en klik op toevoegen (t) in de ROI Manager om hun posities op te nemen. Dit geeft regio's van belang van identieke grootte in alle lichaams segmenten te analyseren. Selecteer ten minste één posterior, één mediaal en één anterieure segment, bijvoorbeeld A7, A4 en T2.
- Selecteer in de ROI Manager alle regio's van de rente die is geregistreerd als Segmentnummer-y coördinaat-x coördinaat (bijvoorbeeld door te selecteren terwijl u CTRLingedrukt houdt) en klik op meer > multi maat om de gemiddelde fluorescentie te meten intensiteit van elke interesse regio voor alle frames van de video en elke meting in een tabel rapporteren. Elke interesse regio is een kolom van de tabel en elk frame is een rij. Zet de tabel over naar een spreadsheetprogramma voor verdere analyses.
- Plot een grafiek met het framenummer op de x-as en de gemiddelde fluorescentie intensiteit op de y-as. Framenummer kan worden geconverteerd naar tijd met behulp van de framesnelheid (4 frames/s) van de video (afbeelding 1A).
- Bepaal de amplitude van de spiercontractie door de toename van de intensiteit van de GFP-fluorescentie ten opzichte van de baseline te schatten. Spiercontracties verhogen de GFP-intensiteit naarmate ze meer GFP in de nabijheid van het brand gebied brengen naarmate er meer spieren worden binnengetrokken tijdens deze weeën (film 1)7. Stel een baseline fluorescentie in als de gemiddelde intensiteit tussen contractie golven. Normaliseer de intensiteit van de GFP naar de baseline door elke ROI-intensiteitswaarde te delen door de intensiteit van de basislijn.
Opmerking: Elk profiel heeft een andere Baseline fluorescentie, omdat er verschillende uitdrukkings niveaus in verschillende spier segmenten kunnen zijn.
Opmerking: Een mogelijke complicatie is dat de GFP-fluorescentie na verloop van tijd kan veranderen als gevolg van het bleken van foto's. Dit kan worden opgelost door het monitoren van veranderingen in de fluorescentie baseline en het gebruik van een voldoende samplegrootte voor Golf analyses (we gebruiken normaliter sets van 10 fluorescerende golven en bevestigen dat de baseline ongeveer constant is door gemiddeld alleen die piek minima als baseline die in fluorescentie zijn gedaald met 10% of minder ten opzichte van de initiële minima piek). Een puls-LED-verlichting kan ook worden toegepast om dat probleem16te verzachten. - Vergelijk spiercontracties aan de linker-en rechterkant van het embryo door de piek intensiteiten aan beide zijden van het embryo te analyseren voor dezelfde segmenten. Gebruik contractie amplitude en tijd van piek intensiteiten om te onderzoeken verschillen in omvang en timing van peristaltische spiercontractie golven propageren langs beide zijden van het embryo.
- Vergelijk genormaliseerde intensiteit van GFP bij verschillende segmenten (bijv. in anterieure, mediale en posterieure gebieden) tijdens spiercontractie Golf propagatie om veranderingen in de contractie te onderzoeken naarmate de Golf voortgaat. Deze analyse bepaalt ook de richting van de Golf (d.w.z. of deze in de voorste of achterste gebieden van het embryo voortduurt).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Normale peristaltische spiercontracties worden weergegeven in een WT (wild-type, Canton-S) embryo in film 1. De gemiddelde frequentie van peristaltische golven van spiercontracties in onze analyse was 47 contracties per uur en de gemiddelde amplitude was 60% boven Baseline voor WT-embryo's. De embryonale rollen worden weergegeven voor een WT -embryo in film 2, met de witte pijl die de beginpositie van een luchtpijp markeert en een zwarte pijl die de positie van een dorsale aanhangsel weergeeft. Het dorsale aanhangsel (exterieur) beweegt niet, terwijl de tracheae (interieur) doet, wat aangeeft dat het embryo in zijn schil is gerold
In onze analyse van het patroon van spiercontracties, hebben we een peristaltische contractie aangewezen als een type 1-Golf als zijn profiel een piek heeft die zich eerst in het achterste gebied voordoet, gevolgd door pieken in de Midden-en anterieure gebieden (voorwaartse Golf) of een profiel waarin de piek eerst ontstaat in anterieure segmenten en vervolgens doorgegeven naar posterieure gebieden (achteruit Golf) (Figuur 2A en film 1). We hebben ook een ander soort golven waargenomen die we als type 2 hebben aangewezen. Type 2 golven beginnen aan het ene uiteinde van het embryo (meestal anterior), gaan naar de middelste gebieden en keren vervolgens terug naar hun oorsprong als een weidse golf die opnieuw wordt geïnitieerd aan het tegenovergestelde uiteinde (Figuur 2a en film 1, Wave 4). Pomt Mutant embryo's vertonen abnormale relatieve frequentie van type 1/type 2 Golf generatie (Figuur 3), wat resulteert in een afwijking in de lichaamshouding, de lichaams torsie (of "rotatie") fenotype (Figuur 4).
Figuur 1 A toont spiercontractie amplitude bewaakt na verloop van tijd als genormaliseerde GFP-intensiteit bij verschillende embryo segmenten (anterior, Middle en posterior). Pieken gedurende 165-178 s tijdperiode vertegenwoordigen een eenvoudige voorwaartse Golf (type 1). Figuur 1 B toont aan dat er geen verschil is in de amplitude (afgebeeld als GFP-intensiteit) en tijd van spiercontracties aan de linker-en rechterzijde van het embryo.
Figuur 2 toont type 1 en type 2 spiercontractie profielen gegenereerd met behulp van GFP intensiteit als een maat voor contractie amplitude. Een type 1-Golf is een enkele golf die wordt gegenereerd aan het voorste of achterste uiteinde van het embryo dat voortduurt naar het tegenovergestelde uiteinde. Type 2 is een bifasische Golf waarbij de Golf zich tijdens de eerste fase naar het midden van het embryo voortplanten en vervolgens terugkeert naar de oorsprong als een peristaltische contractie die aan het tegenovergestelde uiteinde opnieuw wordt geïnitieerd. Elke golf lijn vertegenwoordigt genormaliseerde GFP-intensiteit die is gedetecteerd in opeenvolgende lichaams segmenten van een embryo, en pieken corresponderen met spiercontractie. Schuin uiterlijk van de pieken illustreert dat spiercontracties propageren langs opeenvolgende segmenten, van voorste naar posterior, of omgekeerd, en dus pieken optreden op een opeenvolgende manier in opeenvolgende lichaams segmenten.
Figuur 3 bevat grafieken van de contractie Golf Series in WT en pomt Mutant embryo's. De grafieken illustreren dat type 2 contractie golven worden gegenereerd bij verhoogde relatieve frequentie in Pomt mutanten, in vergelijking met WT embryo. De serie golven in WT embryo (bovenste grafiek) toont de weeën weergegeven in film 1.
Figuur 4 toont vaste WT en pomt Mutant embryo's met spieren gekleurd met fluorescein-geconjugeerde phalloidin om de lichaamshouding van het embryo te benadrukken. De gebogen stippellijn illustreert de lichaamshouding van fenotype van een gemuteerde POMT.
Film 1: voorbeeld van peristaltische spiercontracties van een GEW embryo. Spiercontracties worden getoond in een pseudokleur formaat om de toename van de GFP-intensiteit te illustreren wanneer contractie optreedt (de meeste heldere pixels zijn rood). De video werd verworven op 4 frames/s (fps) en wordt weergegeven bij 20 fps. Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
Film 2: een wild-type embryo dat binnen zijn schil rolt. Witte pijl geeft de beginpositie van een luchtpijp aan en de zwarte pijl geeft de positie van een dorsale aanhangsel aan. Merk op dat naarmate de embryo rollen, de tracheale positie verandert, maar het dorsale aanhangsel niet beweegt, wat illustreert dat het embryo in zijn eierschaal rolt. Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
Figuur 1 : Spiercontractie amplitude. A) de GFP-intensiteit wordt uitgezet tegen (Y-as) tijd (X-as) voor verschillende lichaams segmenten van het embryo. B) de GFP-intensiteit (Y-as) die tegen de tijd wordt uitgezet voor de linker-en rechterzijde van hetzelfde segment van een verdragsluitende embryo. De frame snelheid is 4 frames/s voor beide grafieken. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2 : Type 1 en type 2 peristaltische spiercontractie Golf profielen. A) type 1-Wave profiel waarin individuele lijnen genormaliseerde GFP-intensiteiten van bepaalde lichaams segmenten in de loop van de tijd vertegenwoordigen, terwijl de pieken contractie gebeurtenissen aanduiden. (B) type 2 Wave profiel dat een voorbeeld toont van een bifasische contractie Golf, getekend op dezelfde manier als in a. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3 : Reeks contractie golven gegenereerd door wild-type en pomt Mutant embryo's. Blauwe en Rode staven geven respectievelijk type 1 en type 2-golven weer. Merk op dat de Mutant Pomt een verhoogd aandeel van type 2 golven genereert, vergeleken met WT. De WT-grafiek vertegenwoordigt de weeën die worden weergegeven in film 1. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4 : Vaste en gebeitste pomt Mutant (RT–) en WT embryo's. Let op de rotatie in carrosserie segmenten van het Pomt Mutant embryo, gemarkeerd door een onderbroken lijn die de positie van de middenlijn overspoeld. De spieren worden gevisualiseerd met behulp van vlekken met fluorescein-geconjugeerde phalloidine. Anterior is aan de linkerkant, rugvin is omhoog. Schaalbalk = 100 mm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Onze methode biedt een kwantitatieve manier om belangrijk embryo gedrag tijdens de ontwikkeling te analyseren, zoals peristaltische spiercontractie golven, waaronder golf periodetijd, amplitude en patroon, evenals golfeffect op het rollen en de houding van het embryo. Dit kan nuttig zijn bij analyses van verschillende mutanten om de rol van specifieke genen bij het reguleren van deze en andere gedragingen tijdens de embryonale ontwikkeling te bestuderen. We hebben veranderingen in de spier-specifieke GFP-marker intensiteit gebruikt om de amplitude van de spiercontractie te analyseren, frequentie en richting van contractie Golf propagatie in embryo's. Deze veranderingen in het GFP-signaal weerspiegelen de omvang van de contracties, aangezien contractsegmenten meer GFP in een ROI en de nabijheid van het brand gebied brengen. Deze aanpak vereenvoudigt de analyse aanzienlijk en geeft een betere visuele weergave van het patroon van peristaltische contractie golven.
In onze experimenten gebruikten we genotypen met spier-specifieke transgene expressie van GFP om te visualiseren en bestuderen in detail spiercontracties tijdens de ontwikkeling van het embryonale. Andere studies gebruikten een soortgelijke aanpak om larvale beweging te analyseren, zoals kruipen en buigen van5,15. Een vergelijkbare techniek om gecoördineerde spiercontracties te bestuderen werd eerder toegepast voor sandwich bereiding van embryo's, wat een meer invasieve benadering is die invloed kan hebben op het embryo gedrag en ontwikkeling3. Onze methode is daarentegen volledig niet-invasief en de embryo's zijn onperturbed tijdens de assays. Ons protocol vereist niet dat de embryo's worden gedechorioneerd of gedevitellineerd, en levende embryo's van belang kunnen worden teruggewonnen na assays en vermeerderd voor verdere analyses.
Onze methode kan mogelijk verder worden ontwikkeld voor een high content Analysis (HCA)-gebaseerde screening om mutaties te isoleren en te analyseren die invloed hebben op embryonale spiercontracties en andere gedragingen en ontwikkelingsprocessen. Deze strategie kan bijvoorbeeld worden gebruikt om gelijktijdig spiercontracties van veel embryo's op te nemen en om hun reactie op verschillende stimuli, drugs of veranderingen in het milieu te beoordelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Het project werd deels gesteund door National Institutes of Health Grants RO1 NS099409, NS075534, en CONACYT 2012-037 (S) naar VP.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Digital camera | Hamamatsu CMOS ORCA-Flash 4.0 | C13440-20CU | With different emission filters |
| Forceps | FST Dumont | 11254-20 | Tip Dimensions 0.05 mm x 0.01 mm |
| LED | X-cite BDX (Excelitas) | XLED1 | |
| Microscope | Carl Ziess Examiner D1 | 491405-0005-000 | Epiflourescence with time lapse |
| Needle | BD | 305767 | 25 G x 1-1/2 inch |
| Paintbrush | Contemporary crafts | Any paintbrush will work | |
| Petri dishes | VWR | 25384-164 | 60 mm x 15 mm |
| Software | HCImage Live | ||
| Thread Zap Wax pen | Thread Zap II (by BeadSmith)(Amazon) | TZ1300 | Burner Tool |
| Tricorner plastic beaker | VWR | 25384-152 | 100 mL |
References
- Pereanu, W., Spindler, S., Im, E., Buu, N., Hartenstein, V. The emergence of patterned movement during late embryogenesis of Drosophila. Developmental Neurobiology. 67, 1669-1685 (2007).
- Suster, M. L., Bate, M. Embryonic assembly of a central pattern generator without sensory input. Nature. 416, 174-178 (2002).
- Crisp, S., Evers, J. F., Fiala, A., Bate, M. The development of motor coordination in Drosophila embryos. Development. 135, 3707-3717 (2008).
- Song, W., Onishi, M., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Peripheral multidendritic sensory neurons are necessary for rhythmic locomotion behavior in Drosophila larvae. Proceedings of National Academy of Science of the United States of America. 104, 5199-5204 (2007).
- Hughes, C. L., Thomas, J. B. A sensory feedback circuit coordinates muscle activity in Drosophila. Molecular and Cellular Neuroscience. 35, 383-396 (2007).
- Gorczyca, D. A., et al. Identification of Ppk26, a DEG/ENaC channel functioning with Ppk1 in a mutually dependent manner to guide locomotion behavior in Drosophila. Cell Reports. 9, 1446-1458 (2014).
- Baker, R., Nakamura, N., Chandel, I., et al. Protein O-Mannosyltransferases affect sensory axon wiring and dynamic chirality of body posture in the Drosophila embryo. Journal of Neuroscience. 38 (7), 1850-1865 (2018).
- Nakamura, N., Lyalin, D., Panin, V. M. Protein O-mannosylation in animal development and physiology: From human Disorders to Drosophila phenotypes. Seminars in Cell & Developmental Biology. 21, 622-630 (2010).
- Lyalin, D., et al. The twisted gene encodes Drosophila protein O-mannosyltransferase 2 and genetically interacts with the rotated abdomen gene encoding Drosophila protein O-mannosyltransferase 1. Genetics. 172, 343-353 (2006).
- Beltrán-Valero de Bernabe, D., et al. Mutations in the O-Mannosyltransferase gene POMT1 give rise to the severe neuronal migration disorder Walker-Warburg Syndrome. American Journal of Human Genetics. 71, 1033-1043 (2002).
- Reeuwijk, J., et al. POMT2 mutations cause alpha-dystroglycan hypoglycosylation and Walker-Warburg syndrome. Journal of Medical Genetics. 42, 907-912 (2005).
- Jaeken, J., Matthijs, G. Congenital disorders of glycosylation: A rapidly expanding disease family. Annual Reviews of Genomics and Human Genetics. 8, 261-278 (2007).
- Leyten, Q. H., Gabreels, F. J., Renier, W. O., ter Laak, H. J. Congenital muscular dystrophy: a review of the literature. Clinical and Neurological Neurosurgery. 98 (4), 267-280 (1996).
- Roberts, D. B. Drosophila: A Practical Approach. 2nd ed. The Practical Approach Series. Hames, B. D. , Oxford University Press. New York. 389 (1998).
- Heckscher, E. S., et al. Even-Skipped+ interneurons are core components of a sensorimotor circuit that maintains left-right symmetric muscle contraction amplitude. Neuron. 88, 314-329 (2015).
- Penjweini, R., et al. Long-term monitoring of live cell proliferation in presence of PVP-Hypericin: a new strategy using ms pulses of LED and the fluorescent dye CFSE. J. Microscopy. 245, 100-108 (2011).
