Summary
Her presenterer vi en metode for å spille inn embryonale muskelsammentrekninger i Drosophila embryo i en ikke-invasiv og detalj-orientert måte.
Abstract
Koordinert muskelsammentrekninger er en form for rytmisk atferd sett tidlig under utviklingen i Drosophila embryo. Neuronal sensorisk feedback kretser er pålagt å kontrollere denne oppførselen. Unnlatelse av å produsere rytmisk mønster av sammentrekninger kan være tegn på nevrologiske misdannelser. Vi har tidligere funnet at defekter i protein O-mannosylation, en posttranslational protein modifikasjon, påvirker axon morfologi av sensoriske neurons og resultere i unormal koordinert muskelsammentrekninger i embryo. Her presenterer vi en relativt enkel metode for innspilling og analyse av mønsteret av peristaltisk muskelsammentrekninger ved Live Imaging av sent stadium embryo opp til det punktet av klekking, som vi brukte til å karakterisere muskel sammentrekning fenotype av protein O-mannosyltransferase mutanter. Data innhentet fra disse opptakene kan brukes til å analysere muskel sammentrekning bølger, inkludert frekvens, retning av forplantning og relativ amplitude av muskelsammentrekninger på ulike kroppens segmenter. Vi har også undersøkt kroppens holdning og utnyttet en fluorescerende markør uttrykt spesielt i musklene for å nøyaktig bestemme plasseringen av embryo midtlinjen. En lignende tilnærming kan også utnyttes til å studere ulike andre atferd under utvikling, for eksempel embryo rullende og klekking.
Introduction
Peristaltisk muskel sammentrekning er en rytmisk motor atferd som ligner på gåing og bading i mennesker1,2,3. Embryonale muskelsammentrekninger sett i Drosophila sent stadium embryo representerer et eksempel på en slik oppførsel. Drosophila er en utmerket modell organisme til å studere ulike utviklingsmessige prosesser fordi embryonale utviklingen i Drosophila er godt preget, relativt kort, og lett å overvåke. Det overordnede målet med vår metode er å nøye registrere og analysere bølgelignende mønster av sammentrekning og avslapping av embryonale muskler. Vi brukte en enkel, ikke-invasiv tilnærming som gir en detaljert visualisering, innspilling og analyse av muskelsammentrekninger. Denne metoden kan også være potensielt brukes til å studere andre in vivo prosesser, slik som embryonale rullende sett i sent stadium embryo like før klekking. I tidligere studier, embryonale muskelsammentrekninger var for det meste analysert i form av frekvens og retning1,2. For å anslå den relative omfanget av sammentrekninger som de fremgang langs kroppen aksen i fremre eller bakre retning, har vi brukt embryo uttrykke GFP spesielt i musklene. Denne analysen gir en mer kvantitativ måte å analysere muskelsammentrekninger og å avdekke hvordan kroppens holdning i embryo opprettholdes under serie peristaltisk bølger av muskelsammentrekninger.
Peristaltisk muskelsammentrekninger styres av sentrale mønster generator (CPG) kretser og kommunikasjon mellom neurons av det perifere nervesystemet (PNS), det sentrale nervesystemet (CNS), og musklene4,5. Unnlatelse av å produsere normal peristaltisk muskelsammentrekninger kan føre til defekter som unnlatelse av å klekkes2 og unormal larvestadiet bevegelse6 og kan være en indikasjon på nevrologiske misdannelser. Live Imaging av peristaltisk bølger av muskel sammentrekning og detaljert analyse av sammentrekning fenotyper kan bidra til å avdekke patogene mekanismer knyttet til genetiske defekter som påvirker muskler og nevrale kretser involvert i bevegelse. Vi har nylig brukt denne tilnærmingen til å undersøke mekanismer som resulterer i en kropp holdning vridning fenotype av protein O-mannosyltransferase (POMT) mutanter7.
Protein O-mannosylation (pom) er en spesiell type posttranslational modifikasjon, der en mannose sukker tilsettes til Serine eller threonin rester av sekretoriske Pathway proteiner8,9. Genetiske defekter i POM forårsake medfødt muskel dystrofi (CMD) hos mennesker10,11,12. Vi undersøkte den utløsende mekanismer for disse sykdommene bruker Drosophila som modell system. Vi fant at embryo med mutasjoner i Drosophila protein O-mannosyltransferase gener POMT1 og POMT2 (aka roterte magen (RT) og vridd (tw)) viser en forskyvning ("rotasjon") av kroppens segmenter, noe som resulterer i en unormal kroppsholdning7. Interessant, falt denne feilen med den utviklingsmessige scenen når peristaltisk muskelsammentrekninger blir fremtredende7.
Siden unormal kroppsholdning i POM mutant embryo oppstår når muskulaturen og epidermis er allerede dannet og peristaltisk bølger av koordinert muskelsammentrekninger har startet, hypotetisk gjennomsnitt vi at unormal kroppsholdning kan være et resultat av unormal muskel sammentrekninger i stedet for en defekt i muskel eller/og epidermis morfologi7. CMDs kan være assosiert med unormal muskelsammentrekninger og holdning defekter13, og dermed analysen av holdningen fenotype i Drosophila POMT mutanter mai belyse patologiske mekanismer forbundet med muskel dystrofi . For å undersøke forholdet mellom kroppens holdning fenotype av Drosophila POMT mutanter og mulige unormalt i peristaltisk bølger av muskelsammentrekninger, bestemte vi oss for å analysere muskelsammentrekninger i detalj ved hjelp av en live tilnærming til bildebehandling.
Vår analyse av peristaltisk sammentrekning bølger i Drosophila embryo avdekket to distinkte sammentrekning moduser, utpekt som type 1 og type 2 bølger. Type 1 bølger er enkle bølger overføres fra fremre til bakre eller vice versa. Type 2 bølger er bifasisk bølger som starter på den fremre enden, spredd halvveis i bakre retning, øyeblikk stoppe, danner en timelig statisk sammentrekning, og deretter under den andre fasen, er feid av en peristaltisk sammentrekning som sprer forover fra den bakre enden. Wild-type embryo normalt generere en rekke sammentrekninger som består av ca 75% type 1 og 25% type 2 bølger. I kontrast, POMT mutant embryo generere type 1 og type 2 bølger på omtrent like relative frekvenser.
Vår tilnærming kan gi detaljert informasjon for kvantitativ analyse av muskelsammentrekninger og embryo rullende7. Denne tilnærmingen kan også tilpasses for analyser av andre atferd som involverer muskelsammentrekninger, som klekking og krypende.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. forberedelse
- Forbered en flue bur ved å gjøre ca 50 hull i en 100 mL kapasitet Tri-hjørne plast beger med en varm 25 G nål (se tabell over materialer).
- Forbered 60 mm x 15 mm Petri retter med eple juice-agar (3% agar og 30% eple juice).
- Forbered fersk gjær lime ved å blande tørr gjær granulat og vann. Spre gjær lime på Eple agar platene for å øke egglegging.
- Dop om 50-60 fluer (bruk omtrent like mange menn og kvinner) på CO2 og sette dem i fly buret.
Merk: Ved hjelp av en økt andel av kvinner (opp til ~ 2:1 ratio av kvinner: menn) kan bidra til å øke mengden av lagt egg for noen genotyper. - Fest en eple juice-agar Petri parabolen med gjær lim til flue bur tett og forsegle den med modellering leire. Pass på at den er forseglet i alle hjørner.
- Vent til fluene våkner opp fra anestesi og deretter invertere buret slik at Petri parabolen er nå på bunnen. Sett buret i en inkubator med kontrollert temperatur (25 ° c) og fuktighet (60%).
- Tillat fluer å legge egg for 2-3 h, erstatte Eple plate med en frisk en, og la platen med egg alder for 19-20 h i en inkubator.
Merk: Før trinnet ovenfor, må fluene synkroniseres for å lette samlingen av scenen 17e-f (19-21 h AEL) embryo. Dette kan oppnås ved å overføre fluer til et bur med en fersk gjær-eple juice-agar plate 3-4 ganger for 12 h (en gang hver 3-4 h). Å holde fluer ved kontrollerte døgn lette omgivelser (LD-syklus) kan også hjelpe til med å samle inn en synkronisert befolkning på embryo, men dette var ikke avgjørende i eksperimentene våre.
2. innsamling av embryo
- Nøye plukke embryo med en våt pensel og legg dem i en samle glass rett fylt med 1x PBS.
- Velg embryo som har sine tracheae fylt med luft. Air-fylte tracheae tyder på at embryo har nådd Stage 17, og deres peristaltisk muskelsammentrekninger skulle ha begynt. Tracheae blir klart synlig når de er fylt med luft, som kan tjene som en markør for Stage 17.
- Plasser en eple juice agar skive på et glass lysbilde og nøye overføre embryo fra PBS til skive. Line opp embryo med sine ventrale side opp.
Merk: Rygg og ventrale sider av embryo kan skilles fra posisjonen til rygg vedheng på eggeskall. - Lag en rektangulær voks grense på et annet glass lysbilde ved hjelp av en voks penn (se tabell over materialer).
- Plasser en dobbeltsidig klebrig tape innenfor den grensen og forsiktig plukke opp embryo ved å senke dette lysbildet på agar skive. Påfør forsiktig press for å sikre at embryo holde seg til tape godt, med sin rygg side opp. Om nødvendig, kan embryo rulles på båndet for å korrigere sin orientering. Gjør alle manipulasjoner mens overvåking embryo under et disseksjon mikroskop.
- Dekk embryo med 1x PBS for Live Imaging av muskelsammentrekninger.
Merk: Noen prosedyrer som er beskrevet ovenfor er knyttet til grunnleggende Drosophila teknikker som brukes i mange studier. Mer detaljerte beskrivelser av vanlige Drosophila teknikker finnes andre steder14.
3. innspilling av embryo
- Utfør Live Imaging av monterte embryo på et epiflourescence mikroskop med en time-lapse funksjon og et digitalt kamera med egnede utslipps filtre (se tabell over materialer) ved hjelp av en 10x vann nedsenking objektiv linse.
Merk: Her har vi brukt embryo uttrykker GFP i musklene. Andre fluorescerende markører med egnet eksitasjon lys og utslipps filter sett kan også brukes (for eksempel for tdTomato deteksjon, kan man bruke et Chroma ET-561 filter sett for eksitasjon og utslipp rundt optimal 554 NM og 581 NM, henholdsvis). - Utfør Live videoopptak av embryo ved hjelp av egnet programvare (se tabell over materialer) for ca 1-2 h med en anskaffelses hastighet på 4 bilder/s.
Merk: Å analysere rullende av utviklingsland embryo i skallet sitt, embryo uten uttrykk for fluorescerende markører kan brukes. For dette formål brukes regelmessig overført lys belysning uten Spectral filtre for å visualisere embryo bevegelse i skallet (se film 2).
4. analyse av opptakene
- Eksporter innspilt video direkte til image J for videre analyser (for eksempel AVI-filer).
- I ImageJ, beskjære videoopptak til størrelsen på individuelle embryo ved å tegne en boks rundt hvert embryo og deretter klikke på bildet > beskjære. Dette reduserer størrelsen på videofiler i stor grad uten at det påvirker oppløsningen og forenkler analysen.
- Roter beskjæres bilder for å oppnå Vertikal plassering av embryo midtlinjen forhold til skjermen, ved å klikke på bilde > Transform > Roter.
Merk: Hvis du velger Forhåndsvisning under denne prosessen, får du veiledning for rotering, som viser rutenett for å sikre loddrett plassering av midtlinjen. - Kvantitativ analyse av embryo rullende :
Merk: for avstands analyser må du først bekrefte at bildene inneholder skaleringsinformasjon. Bildeskalering kan legges til ved å velge analyser ≫ angi skalering, og deretter angi en konvertering av piksler til avstander, for eksempel mikrometer- Merk plasseringen av en eller begge tracheae i den første rammen i videoen på et punkt midt mellom bakre og fremre ender. Klikk på analyser > verktøy > ROI Manager og registrere denne posisjonen som Slice Number-y koordinat-x koordinat ved å tegne en boks på ca 7 μm med 7 μm rundt den og skrive t på tastaturet. Kontroller at når du skriver t, er et område av interesse valgt på videoen. Du kan også velge kategorien Legg til (t) i avkastnings behandleren for å registrere posisjonen til luftrøret i stedet for å skrive inn kommandoen.
Merk: Regionen av interesse kan variere i form eller størrelse avhengig av embryonale regionen eller utviklingsmessige hendelsen blir studert. - Merk posisjonen til det samme området av luftrøret etter hver peristaltisk sammentrekning. Mål avstanden fra pre-sammentrekning posisjon til post-sammentrekning posisjon ved å tegne en linje som forbinder sentrene i hver boks og skrive m på tastaturet. Konverter avstanden til μm ved hjelp av en kjent skala av bilder. Alternativt, mål avstanden i μm i et enkelt trinn ved å klikke på analyser ≫ Sett skala og skriv den kjente pixel-til-mikron konverteringsfaktoren å gi en rapport i mikron.
Merk: En avstand i piksler kan legges inn sammen med tilsvarende avstand i μm. - Relatere avstand og retning av hver rullende hendelse med retning av muskel sammentrekning forplantning i minst 8 embryo for statistisk signifikante forskjeller.
- Merk plasseringen av en eller begge tracheae i den første rammen i videoen på et punkt midt mellom bakre og fremre ender. Klikk på analyser > verktøy > ROI Manager og registrere denne posisjonen som Slice Number-y koordinat-x koordinat ved å tegne en boks på ca 7 μm med 7 μm rundt den og skrive t på tastaturet. Kontroller at når du skriver t, er et område av interesse valgt på videoen. Du kan også velge kategorien Legg til (t) i avkastnings behandleren for å registrere posisjonen til luftrøret i stedet for å skrive inn kommandoen.
- Kvantitativ analyse av embryonale muskelsammentrekninger:
- Bruk embryo uttrykker fluorescerende markører i musklene (f. eks vi brukte transgene fluer uttrykker en fusjon konstruere av Myosin Heavy CHain PROMOTER og GFP kalt MHC-GFP5) til å analysere muskel sammentrekning parametre som sammentrekning amplitude.
- Bruk innspillingen av fluorescerende avlesning og tegne en region av interesse (f. eks en boks på 15 μm til 45 μm [HXW]) sentrert på musklene (som er godt synlig på grunn av tilstedeværelsen av fluorescerende markør) av en bestemt kropp segmentet, og velg Legg (t) tab på th e ROI Manager for å registrere posisjonen til AVKASTNINGEN. Klikk på ROI manager > mål å registrere gjennomsnittlig lysrør intensiteten i hver region av interesse valgt for hver ramme i videoen.
- Flytt boksen til sentrene i andre kroppsdeler av interesse og klikk på Legg til (t) i ROI Manager for å registrere sine posisjoner. Dette vil gi interesseområder av identisk størrelse i alle kropps segmenter som skal analyseres. Merk minst én av de bakre, én midtre og ett fremre segmentet, for eksempel A7, A4 og T2.
- I ROI Manager, Velg alle regioner av interesse registrert som Slice nummer-y koordinat-x koordinat (for eksempel ved å velge mens du holder CTRL) og klikk på mer > multi mål å måle gjennomsnittlig fluorescerende intensiteten i hvert område av interesse for alle bildene i videoen, og rapporter hver måling i en tabell. Hver region av interesse er en kolonne i tabellen, og hvert delbilde er en rad. Overfør tabellen til et regnearkprogram for videre analyse.
- Plot en graf med ramme nummer på x-aksen og bety fluorescerende intensitet på y-aksen. Bilde nummer kan konverteres til tid ved hjelp av bildefrekvens (4 bilder/r) av videoen (figur 1A).
- Bestem muskel sammentrekning amplitude ved å estimere økningen i GFP fluorescens intensitet i forhold til Baseline. Muskelsammentrekninger øke GFP intensitet som de bringe mer GFP i nærheten av fokal området som mer muskler blir dratt inn i løpet av disse sammentrekninger (film 1)7. Etablere en Baseline fluorescens som gjennomsnittlig intensitet mellom sammentrekning bølger. Normalisere GFP intensitet til grunnlinjen ved å dele hver AVKASTNINGS intensitet verdi med den opprinnelige intensiteten.
Merk: Hver profil har en annen grunnlinje fluorescens, da det kan være forskjellige uttrykks nivåer i forskjellige muskel segmenter.
Merk: En potensiell komplikasjon er at GFP-fluorescens kan endres over tid på grunn av bilde bleking. Dette kan løses ved å overvåke endringer i fluorescens Baseline og bruke en tilstrekkelig utvalgsstørrelse for bølge analyser (vi vanligvis bruker sett med 10 fluorescerende bølger og bekrefter at Baseline er omtrent konstant ved å ta et gjennomsnitt av bare de peak Minima som har minsket i fluorescens med 10% eller mindre i forhold til den opprinnelige Minima peak). En puls-LED-belysning kan også brukes for å redusere det problemet16. - Sammenlign muskelsammentrekninger på venstre og høyre side av fosteret ved å analysere peak intensitet på begge sider av fosteret for samme segmenter. Bruk sammentrekning amplitude og tid av peak intensitet for å undersøke forskjeller i omfang og timing av peristaltisk muskel sammentrekning bølger spre langs begge sider av fosteret.
- Sammenlign normalisert intensitet GFP på ulike segmenter (f. eks på fremre, midtre og bakre regioner) under muskel sammentrekning bølge forplantning å undersøke endringer i sammentrekning som bølgen sprer. Denne analysen bestemmer også retningen av bølgen (dvs. om den sprer seg mot fremre eller bakre deler av fosteret).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Normale peristaltisk muskelsammentrekninger vises i en WT (Wild-type, Canton-S) embryo i film 1. Den gjennomsnittlige hyppigheten av peristaltisk bølger av muskelsammentrekninger i vår analyse var 47 sammentrekninger per time, og den gjennomsnittlige amplituden var 60% over Baseline for WT embryo. Det er vist embryo for et WT embryo i film 2, med den hvite pilen som markerer startposisjonen til et luftrør og en svart pil som viser posisjonen til en rygg vedheng. Rygg vedheng (utvendig) beveger seg ikke mens tracheae (indre) gjør, som indikerer at fosteret har rullet i skallet sitt
I vår analyse av mønster av muskelsammentrekninger, utpekte vi en peristaltisk sammentrekning som en type 1 bølge Hvis profilen har en topp som oppstår på bakre regionen først, etterfulgt av topper på midten og fremre regioner (Forward Wave) eller en profil der peak første oppstår ved fremre segmenter og deretter sprer mot bakre regioner (bakover Wave) (figur 2A og film 1). Vi observerte også en annen type bølger som vi utpekte som type 2. Type 2 bølger starter i den ene enden av fosteret (vanligvis fremre), går mot de midterste regionene, og deretter tilbake til sin opprinnelse som en feiende bølge re-initiert i motsatt ende (figur 2a og film 1, Wave 4). POMT mutant embryo viser unormal relativ frekvens av type 1/type 2 bølge generasjon (Figur 3), som resulterer i kroppsholdning unormalt, kroppen vridning (eller "rotasjon") fenotype (Figur 4).
Figur 1 A viser muskel sammentrekning amplitude overvåkes over tid som normalisert GFP intensitet på ulike embryo segmenter (fremre, midtre og bakre). Topper i løpet av 165-178-tiden representerer en enkel Forward Wave (type 1). Figur 1 B viser at det ikke er noen forskjell i amplitude (AVBILDET som GFP intensitet) og tid for muskelsammentrekninger på høyre og venstre side av fosteret.
Figur 2 viser type 1 og type 2 muskel sammentrekning profiler generert ved hjelp GFP intensitet som et mål på sammentrekning amplitude. En type 1 bølgen er en enkelt bølge generert ved fremre eller bakre enden av fosteret som fortsetter forplantning mot den motsatte enden. Type 2 er en bifasisk bølge der bølgen sprer til midten av fosteret i den første fasen, og deretter tilbake til opprinnelsen som en peristaltisk sammentrekning gjenopptas i motsatt ende. Hver bølge linje representerer normalisert GFP intensitet oppdages i suksessive kroppens segmenter av et embryo, og topper tilsvarer muskel sammentrekning. Skrå utseende av toppene illustrerer at muskelsammentrekninger overføres langs suksessive segmenter, fra fremre til bakre, eller vice versa, og dermed topper oppstå i en sammenhengende måte i påfølgende kroppen segmenter.
Figur 3 inkluderer grafer av sammentrekning Wave-serien i WT og POMT mutant embryo. Grafene illustrerer at type 2 sammentrekning bølger er generert ved økt relativ frekvens i POMT mutanter, SAMMENLIGNET med WT embryo. Serien av bølger i WT embryo (Top graf) viser sammentrekninger vist i film 1.
Figur 4 viser fast WT og POMT mutant embryo med muskler beiset med fluorescein-bøyd phalloidin for å fremheve embryo kroppsholdning. Den buede stiplede linjen illustrerer kroppens holdning fenotype av en POMT mutant.
Film 1: eksempel på peristaltisk muskelsammentrekninger av et WT embryo. Muskelsammentrekninger vises i et pseudofarger format for å illustrere økningen i GFP intensitet når sammentrekning oppstår (de fleste lyse piksler er røde). Videoen ble kjøpt på 4 bilder/s (FPS) og er vist på 20 fps. Vennligst klikk her for å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)
Film 2: en vill-type embryo rullende innenfor skallet sitt. Hvit pil angir startposisjonen til et luftrør, og den svarte pilen indikerer posisjonen til en rygg vedheng. Legg merke til at etter hvert som fosteret ruller, endres tracheal posisjon, men rygg vedheng beveger seg ikke, noe som illustrerer at fosteret ruller inn i dens eggeskall. Vennligst klikk her for å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)
Figur 1 : Muskel sammentrekning amplitude. (A) GFP intensitet er plottet mot (Y-aksen) tid (X-aksen) for ulike kroppens segmenter av fosteret. (B) GFP intensitet (Y-aksen) plottet mot tid for venstre og høyre side av samme segment av en kontraktørselskaper embryo. Frame Rate er 4 rammer/s for begge grafer. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Type 1 og type 2 peristaltisk muskel sammentrekning bølge profiler. (A) Type 1 Wave profil der enkelte linjer representerer normalisert GFP intensitet av bestemte kropps segmenter over tid, mens toppene indikerer sammentrekning hendelser. (B) type 2 Wave profil som viser et eksempel på en bifasisk sammentrekning bølge, plottet på samme måte som i a. please Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Serie sammentrekning bølger generert av vill-type og POMT mutant embryo. Blå og røde striper viser henholdsvis type 1 og type 2-bølger. Merk at POMT mutant genererer en økt andel av type 2 bølger, SAMMENLIGNET med WT. WT-grafen representerer sammentrekninger som vises i film 1. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : Fast og beiset POMT mutant (RT-) og WT embryo. Legg merke til rotasjonen i kroppens segmenter av POMT mutant embryo, fremhevet av en stiplet linje tracing plasseringen av midtlinjen. Musklene er visualisere ved hjelp av farging med fluorescein-bøyd phalloidin. Fremre er til venstre, rygg er opp. Scale bar = 100 mm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vår metode gir en kvantitativ måte å analysere viktige embryo atferd under utvikling, for eksempel peristaltisk muskel sammentrekning bølger, inkludert bølge periodisitet, amplitude og mønster, samt bølge effekt på embryo rullende og holdning. Dette kan være nyttig i analyser av ulike mutanter å studere rollen som spesifikke gener i å regulere disse og andre atferd under embryonale utviklingen. Vi har brukt endringer i muskel-spesifikke GFP markør intensitet for å analysere muskel sammentrekning amplitude, frekvens og retning av sammentrekning bølge forplantning i embryo. Disse endringene i GFP signal reflekterer omfanget av sammentrekninger, som kontraktørselskaper kroppen segmenter bringe mer GFP til en avkastning og nærhet av fokal området. Denne tilnærmingen forenkler analyser og gir en bedre visuell representasjon av mønsteret av peristaltisk sammentrekning bølger.
I våre eksperimenter, brukte vi genotyper med muskel-spesifikke transgene uttrykk for GFP å visualisere og studere i detalj muskelsammentrekninger under embryonale utviklingen. Andre studier brukte en lignende tilnærming til å analysere larvestadiet bevegelse som gjennomgang og bøying5,15. En lignende teknikk for å studere koordinert muskelsammentrekninger ble tidligere brukt for sandwich utarbeidelse av embryo, som er en mer invasiv tilnærming som kan påvirke embryo atferd og utvikling3. I kontrast er vår metode fullstendig ikke-invasiv og embryo er Uaffisert under analysene. Vår protokoll krever ikke at embryo skal dechorionated eller devitellinated, og lever embryo av interesse kan utvinnes etter analyser og spredte for videre analyser.
Vår metode kan potensielt utvikles videre for et høyt innhold analyse (HCA)-basert screening for å isolere og analysere mutasjoner som påvirker embryonale muskelsammentrekninger og annen atferd og utviklingsmessige prosesser. Denne strategien, for eksempel, kan brukes til å samtidig registrere muskelsammentrekninger av mange embryo og for å vurdere deres svar på ulike stimuli, narkotika, eller miljømessige endringer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Prosjektet ble støttet delvis av National Institutes of Health Grants RO1 NS099409, NS075534 og CONACYT 2012-037 (S) til VP.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Digital camera | Hamamatsu CMOS ORCA-Flash 4.0 | C13440-20CU | With different emission filters |
| Forceps | FST Dumont | 11254-20 | Tip Dimensions 0.05 mm x 0.01 mm |
| LED | X-cite BDX (Excelitas) | XLED1 | |
| Microscope | Carl Ziess Examiner D1 | 491405-0005-000 | Epiflourescence with time lapse |
| Needle | BD | 305767 | 25 G x 1-1/2 inch |
| Paintbrush | Contemporary crafts | Any paintbrush will work | |
| Petri dishes | VWR | 25384-164 | 60 mm x 15 mm |
| Software | HCImage Live | ||
| Thread Zap Wax pen | Thread Zap II (by BeadSmith)(Amazon) | TZ1300 | Burner Tool |
| Tricorner plastic beaker | VWR | 25384-152 | 100 mL |
References
- Pereanu, W., Spindler, S., Im, E., Buu, N., Hartenstein, V. The emergence of patterned movement during late embryogenesis of Drosophila. Developmental Neurobiology. 67, 1669-1685 (2007).
- Suster, M. L., Bate, M. Embryonic assembly of a central pattern generator without sensory input. Nature. 416, 174-178 (2002).
- Crisp, S., Evers, J. F., Fiala, A., Bate, M. The development of motor coordination in Drosophila embryos. Development. 135, 3707-3717 (2008).
- Song, W., Onishi, M., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Peripheral multidendritic sensory neurons are necessary for rhythmic locomotion behavior in Drosophila larvae. Proceedings of National Academy of Science of the United States of America. 104, 5199-5204 (2007).
- Hughes, C. L., Thomas, J. B. A sensory feedback circuit coordinates muscle activity in Drosophila. Molecular and Cellular Neuroscience. 35, 383-396 (2007).
- Gorczyca, D. A., et al. Identification of Ppk26, a DEG/ENaC channel functioning with Ppk1 in a mutually dependent manner to guide locomotion behavior in Drosophila. Cell Reports. 9, 1446-1458 (2014).
- Baker, R., Nakamura, N., Chandel, I., et al. Protein O-Mannosyltransferases affect sensory axon wiring and dynamic chirality of body posture in the Drosophila embryo. Journal of Neuroscience. 38 (7), 1850-1865 (2018).
- Nakamura, N., Lyalin, D., Panin, V. M. Protein O-mannosylation in animal development and physiology: From human Disorders to Drosophila phenotypes. Seminars in Cell & Developmental Biology. 21, 622-630 (2010).
- Lyalin, D., et al. The twisted gene encodes Drosophila protein O-mannosyltransferase 2 and genetically interacts with the rotated abdomen gene encoding Drosophila protein O-mannosyltransferase 1. Genetics. 172, 343-353 (2006).
- Beltrán-Valero de Bernabe, D., et al. Mutations in the O-Mannosyltransferase gene POMT1 give rise to the severe neuronal migration disorder Walker-Warburg Syndrome. American Journal of Human Genetics. 71, 1033-1043 (2002).
- Reeuwijk, J., et al. POMT2 mutations cause alpha-dystroglycan hypoglycosylation and Walker-Warburg syndrome. Journal of Medical Genetics. 42, 907-912 (2005).
- Jaeken, J., Matthijs, G. Congenital disorders of glycosylation: A rapidly expanding disease family. Annual Reviews of Genomics and Human Genetics. 8, 261-278 (2007).
- Leyten, Q. H., Gabreels, F. J., Renier, W. O., ter Laak, H. J. Congenital muscular dystrophy: a review of the literature. Clinical and Neurological Neurosurgery. 98 (4), 267-280 (1996).
- Roberts, D. B. Drosophila: A Practical Approach. 2nd ed. The Practical Approach Series. Hames, B. D. , Oxford University Press. New York. 389 (1998).
- Heckscher, E. S., et al. Even-Skipped+ interneurons are core components of a sensorimotor circuit that maintains left-right symmetric muscle contraction amplitude. Neuron. 88, 314-329 (2015).
- Penjweini, R., et al. Long-term monitoring of live cell proliferation in presence of PVP-Hypericin: a new strategy using ms pulses of LED and the fluorescent dye CFSE. J. Microscopy. 245, 100-108 (2011).
