Summary
הנה הציג פרוטוקול של לשעבר vivo אימהי-העוברי וסקולזיה העובר כדי לאפשר את הניהול של מאמר מבחן לתוך ואסילטורה אימהית וכלה להעריך העברה שלמה של חלקיקים xenoביוטיים או סוכני תרופתי בנוסף שינויים ב פיזיולוגיה של הסביבה
Abstract
השליה היא איבר מפתח במהלך ההריון, המשמש כמכשול לחשיפה העוברית xenoביוטית ומדיטים חילופי חומרים מזינים לפסולת. התשובה מתוארת כאן כדי לבשם השליה עכברוש מבודדים ולהעריך את הטרנסלוקציה אימהי-אל-עוברי של לשעבר xenobiotics vivo. בנוסף, ניתן לנהל את האבחון של תהליכים פיזיולוגיים כגון זרימת נוזלים לעובר ולחילוף חומרים מטבוליזם עם מתודולוגיה זו. טכניקה זו מתאימה להערכת קינטיקה אימהית-אל-עוברי של מועמדים פרמצבטיים או מזהמים סביבתיים. בניגוד לגישות חלופיות הנוכחי, מתודולוגיה זו מאפשרת הערכה של הומבודד אימהי העוברי-העובר, עם עצביים מערכתית או מעורבות חיסונית הוסרו, המאפשר כל שינוי נצפה בתפקוד הפיזיולוגי כדי להיות המיוחס לגורמים המקומיים בתוך הרקמה המבודדת.
Introduction
על-ידי שמירה על מבנה מורפולוגית ותגובתיות פיזיולוגית, המערכת הייתה מקובלת על מערכת-או רקמת הגישה לניתוח תפקוד חילוף החומרים. אלה טכניקות זלוף לאפשר את הבדיקה vivo ex של תגובות רקמות שלמות למגוון גירויים תרופתי ומכני. Perfusion של השליה האנושית תוארה בתחילה ב 1958 כדי לזהות את ההשפעות ההורמונלית על פעילות מטבולית של מחזור חומצת לימון; לאחר שזוהו בעבר רקמת הומוטים, Troen וגורדון זיהה את הצורך להבהיר את הפעילות האנדוקרינית באמצעות גישה פיזיולוגית הרומן1. באותה תקופה, אסטרטגיות חד-פרזיה (אימהית-אל-עוברי או עוברי-אל-אימהית) תוארו ב-2,3 ו-4 מודלים בעלי חיים להבין את העברת האזור של סוכרים, מלחים, ותרופות אנטי-פירין. ב vivo ו ex vivo כפול perfusion (מתואמת אימהית העובר perfusion) טכניקות תוארו עוד לאפיין את העברת הטכניקה באמצעות vivo5 ו ex vivo6,7,8 מתודולוגיות. הפיתוחים הטכנולוגיים בשידור וסריקת המיקרוסקופיה האלקטרונים אפשרו לחוקרים לאמת את השלמות הקונסטרוקטיבית והפונקציונלית של רקמות הגוף האנושי לאחר הפרזיה9.
בעוד שהפיוז של רקמות הסביבה האנושית והcotyledon האישיים הוא הרלוונטי ביותר, ההתפתחות המהירה של סוכני פרמקולוגית ומזהמים סביבתיים מחייבת את השימוש במודל של בעלי חיים להקרנה המוקדמת של הקרנת הסרט מעבר למכשול החיץ. שיטה זו זלוף השיטה מאפשרת הערכה של העברה על פני המכשול מכשול באמצעות יותר בקלות השגה ומבחינה פיזיולוגית השליה החולדה. בנוסף, זרימת הנוזלים מעבר למכשול ההפרדה על פני תקופה של זמן, לאחר החשיפה ניתן להעריך על ידי מדידת נפח החומר המגיע מעורק הטבור. על ידי המוסריות של התרת המשך הפרזיה משני התנודות האימהי והעוברי, הגישה הזאת כפולה זרימה שלמה יכול להיות יתרון לעומת הנוכחי בתוך מבחנה ובגישות vivo. שיטה זו מאפשרת לניהול של xenobiotic יוטי דרך ההיבט האימהי להיות נמדד מתוך מבשם העולה על פני השליה דרך וריד הטבור, או להיפך. הפרוטוקול המוצג כאן יהיה לתאר את העברת 20 פוליסטירן ננומטר (nanoplastic נפוץ משמש מזון ומוצרים רפואיים) מן העורק הרחם אימהי אל התא העוברי ואת ירידה משויכת זרימת הנוזלים על פני השליה כדי להמחיש השימוש בשיטה זו בהגדרות פיזיולוגיות, פרמקולוגיות ורעילות מרובות כדי להעריך את העברת הגדרות, חילוף החומרים ושינויים פיזיולוגיים המשפיעים על זרימה אימהית ו/או עוברי.
Protocol
כל ההליכים הניסיוניים אושרו על ידי שימוש בבעלי חיים מוסדיים וועדת השימוש של אוניברסיטת רטגרס.
1. הכנה לפני הניסוי
הערה: ניתן לבצע שלבים אלה בתוך ימים או שבועות לפני הניסוי.
- . שינוי תא כלי הקיבול
הערה: איור 1A, B מציג את תא כלי הקיבול שהשתנה.- הזז את החיישן תרמיסטור מתחת לסרטון וכופף אותו כך שיהיה תלוי בחופשיות באמבט הפרפיוז (איור 1b).
- התקן שני 4-inch בוטה-טיפ נירוסטה מחטים עם מרכזי חיבור מצח רגיל, 1 25 g ו 1 23 g מאובטח מתחת לקליפ תרמיסטור ולהוסיף הפסקות 3-way כדי לאפשר צינורית של הטבור (איור 1b).
הערה: חיבורי ה-מצח של גדלים שונים מסומנים בצבע. זה מסייע לזיהוי קל של כלי שיט במהלך ואחרי הניסוי.
- התקן 2 70-100 יקרומטר זכוכית מיקרופיפטות. לקבלת מידע נוסף אודות הליכים אלה, עיין בהפניות הבאות10,11.
הערה: קוטר העצה הנפוץ בניסויים אלה הוא בטווח של 70-100 יקרומטר. עצה קוטר גדול יותר מהטווח זה עשוי להוסיף קושי לתהליך הצינורית בעוד הקצה קוטר קטן מ 60 יקרומטר עשוי לנקב את הקיר כלי הדם במהלך הצינורית. - הכנת קשרים מתפר ניילון סטרילי (עבור הצדדים האבוסיים והמרוחק של עורק הרחם) וממשי קלועה שחור תפר לא סטרילי (עבור כלי הטבור). בצע קשרים בודדים על-ידי לולאה תפר ליזום קשר מרובע או לקשור נעל, כפי שמתואר בעבר11.
הערה: קשרים בודדים נעשים בדרך כלל ונשמרים בצלחת פטרי מלאה בשכבה קטנה של גומי סיליקון כדי לעזור לעבוד על רקע דביק. - להכין 2 L של תמיסת מלח פיזיולוגי (PSS) המכיל, ב mmol/L, 129.8 הנאל, 5.4 KCl, 0.5 נה2PO4, 0.83 mgso4, 19 נחקו3, 1.8 cacl2, ו 5.5 גלוקוז. להתאים את ה-pH ל 7.40 ± 0.02 על ידי הוספה איטית של כמה טיפות חומצה (1 M הידרוכלורית) או בסיס (1 N הידרוקסיד הנתרן) לפתרון ולחכות לפחות 20 s לפני קריאת מדידה pH מנוכי. חנות PSS עד מוכן לשימוש במקרר כדי להפחית את הזיהום אבל לא לאחסן יותר 2 שבועות.
- תוויות מיקרוצנטריפוגה תווית עבור איסוף "אימהית" ו "עוברי" קולחים בכל נקודה, כלומר, "MBaseline M10, M20,..." עד לנקודת הזמן של 180 דקות. להכין את אותו דבר עבור הקולחים העוברי (FBaseline, M10, M20,...).
- כיול כל הציוד המשמש במערכת, כולל טמפרטורת האמבטיה מחזורי ומסכי לחץ דם הקשורים לשמירה על הרחם (80 mmHg) ו הטבור (50 mmHg) לחצים מעשה.
- הכן תא לנתיחה (4 "קוטר x 1" עמוק) או צלחת חימום במחזור על ידי מילוי שכבה (< 0.25 ") של גומי סיליקון. יש לבצע שינוי זה מראש ומכיוון שהוא ייקח 12 עד 24 שעות על מנת לייבש את הגומי.
הערה: השימוש בכלי חימום מחודש/מצנן מומלץ עבור מנתחים מתחילים, כמו המנה לא יזוז והרקמה תשמור על טמפרטורה עקבית.
2. הכנת התחנה הכירורגית ושימיית הציוד
- הפעל את כל הציוד התומך במערכת זלוף כדי לבדוק את הפונקציה הנכונה. הסירו את ה-PSS מהקירור והחום עד החדר. ה-PSS ישמש גם כמכונה וגם סופרפופוסט.
- מניחים אבן מבעבעים קטנה כדי לספק תערובת גז לתוך מאגר הסופרפופוסט. תערובות שימוש נפוצות כוללות 21% O2, 8% o2, 3% o2, ו 0% o2. הדלק את הגז כדי לספק בועות קטנות לפתרון הסופרפופוסט. להתאים את אספקת הגז כדי להימנע מתיז.
- מסדרים את תחנת הניתוח של בעלי החיים על ידי בדיקת הרדמה, הסדרת ציוד כירורגי, והכנת עניבות תפר. הכינו את חדר הניתוח באמצעות איסוף סיכות, הפעלת הקרירות (או אחזור הקרח), ומילוי חדר הניתוח (מרופד בסיליקון גומי) עם PSS קר.
- ממלאים בעדינות את כל התאים, מחטים, מיקרופיפטות זכוכית, אבובים, ומאגרים עם PSS מחומם, לצפות בזהירות עבור וסילוק בועות אוויר על ידי הסרת אותם עם הצינור העברת טיפ דק. להפוך את כל העצירות 3-כיוון עם "off" מול כיוון הפיפטה כדי לאבטח את הנוזל בתוך הפיפטה.
- הניחו עניבה אחת על כל אחת משתי מיקרופיפטות הזכוכית המוכנות לצינורית הרחם ועל שתי מחטי הקצה הקהה המיועדים לצינורית הטבור. הקשרים מאובטחים למחטים ולמחט הקהה כדי למנוע אובדן במהלך תנועות החדר (איור 1C).
3. הקציר הפלפתי
- ביום הריונית 20 עם 5% איזוofלבנה במשך כ -4 דקות או עד שהחיה מציגה נשימה מאומצת. הזיזו את בעל החיים לחרוט האף והמרו על 2.5%-3% בכדי לשמור על ההרדמה. תאשר חוסר הכרה על ידי. העדר רפלקס של הבוהן
הערה: השימוש בחולדה ביום הריונית 20 מוצג בפרוטוקול זה. עם זאת, הפרוטוקול נשאר זהה אם התנאים הניסיוניים דורשים הערכה מוקדמת להתרחש מוקדם יותר בהריון. - לזהות ולבודד את קרן הרחם (ימין או שמאל) של בחירה על ידי הסרת והפצת דרכים ארוכות מחוץ לגווייה חולדה. באמצעות תפר ממשי קלוע, לקשור את עורק הרחם בקצה השחלה ואת קצה הנרתיק של הצופר. כלול את השחלה בתוך התפר עם קרן הרחם.
- באמצעות מספריים כירורגי, בלו את קרן הרחם על ידי ביצוע חתכים על הצד הטוב ביותר של עניבת השחלה ואת הצד המרוחק של העניבה הנרתיק, עוזב את קרן הרחם קשור עם התפרים בשני הקצוות. העבר את קרן הרחם לתוך מיכל הניתוח מרופד בגומי סיליקון ומלא קר (4 ° c) PSS. ללא קשר לשאלה אם נבחרה הקרן הימנית או השמאלית, שמור על אותו צד לבחירה בכל ניסוי לצורך עקביות.
הערה: עבור הרדמה עוברית, גורים נשמרים PSS קר קרח. לכן, טמפרטורת PSS בתוך החדר הניתוח מתוחזק על ידי אמבטיה במחזור מקורר או חדר מבתר צריך להישמר על קרח.
הערה: בשלב זה ניתן לקבל את הסכר העלול להיות מורדמים לכל אישור פרוטוקול IACUC מעבדה. במקרה זה, המתת חסד מתרחשת באמצעות חזה אוויר (על ידי גזירת הסרעפת) והסרת הלב האימהי. - לדחוף בעדינות את הסיכה באמצעות קרן הרחם לתוך גומי הסיליקון, עם הצד השחלות בצד שמאל והנרתיק לזכות לדמיין את הרחם והרחלטורה. זה יהיה לייצב את הרחם ולמנוע תנועה של הרקמה במהלך הניתוח של התא העובר. בחר את האישה האימהית-השליה-העובר המרכז לקרן לסדר את עורק הרחם ואת הווריד עם מספריים כירורגי. חותכים את שריר הרחם האבובי והמרוחק כדי השליה והעובר נבחר. שריר הרחם ניתן לשוב על ידי משיכת אותו לצד; חשוב להשאיר אותו שלם אך למשוך אותו הרחק כיסוי הכלבלב העובר.
הערה: מבחר של היחידה אימהית-השליה-עוברית צריך להיות מבוסס על אורך קטע עורק הרחם משני צדי העורק קושת. מקטעים ארוכים יותר יאפשרו צינורית מוצלחת יותר. - באמצעות מלקחיים ומספריים עדינים, להסיר את קרום השפיר מן המשטח העוברי של השליה, לטפל כדי למנוע את חבל הטבור.
- לפענח ולסדר את חבל הטבור כדי להפריד את הכלבלב העובר.
- זהה את עורק הטבור (כלי עבה יותר) ו וריד (כלי דק יותר). באמצעות חיתוך קצר יותר. מעורק הטבור
- הפרידו בעדינות את עורק הטבור. והווריד אחד מהשני
- כל היחידה המלאה הכוללת את הרחם, שריר הרחם, השליה, וחבל הטבור, ניתן לגזור ולהסיר.
4. הפלטל פרזיה
- לשמור על זרימת הדם האנטומית שמירה על האוריינטציה הנכונה של עורק הרחם, למקם את היחידה השלבית (מורכב של הרחם והשרירים, שריר הרחם, השליה, וחבל הטבור) לתוך תא כלי מבודד שונה מלא עם. מחמם חום וחמצן
- תוך שימוש בזוג מלקחיים עדינים בכל יד, באמצעות צינורית החלק השני והמרוחק של עורק הרחם על מיקרופיפטות הזכוכית.
- מאובטח היטב את עורק הרחם באמצעות עניבת תפירה ניילון סטרילי בעבר מאובטח על המיקרופיפטה.
הערה: לולאות של שתי עניבה (קשר) עשויות להיות הכרחיות; עם זאת, לולאת עניבה אחת מאפשרת התאמה גדולה יותר. - צינורית עורק הטבור (זרימת דם עוברית-אל-אימהית) אל המחט 23 G (גדול יותר) ולאבטח אותו עם תפר שחור קלועה משי.
- צינורית הטבור (זרימת דם אימהית-אל-עוברי) אל 25 G (קטן יותר) מחט קהה ולאבטח אותו עם תפר שחור קלוע משי.
- מעבר לתחנת הרכבת הפרפיוז וממלאים את כל הסטוגים והאבובים כדי למנוע בועות אוויר. חברו את כל הטאבגים בהתאם לאיור 2.
- מניחים סירות שקילה קטנה תחת הצינורית הקצרה של עורק הרחם האימהי ואת צינורית המחט של וריד הטבור העוברי לתפוס את הקולחים שיופיע במהלך ההליך.
- הפעל את המשאבה הפריסטטית, בקר הלחץ, ופקח הלחץ ופתח את הסטופל כדי לאפשר זרימת נוזלים דרך אבובים לכיוון מתמר הלחץ, אך עדיין לא לשליה. להגביר לאט את הלחץ. ל80 מ"מ כספית
- לאט להפוך את הרזלים תרנגול כדי השליה לפתוח ולצפות דליפות בתוך החדר וסביב העניבות.
הערה: אם המשאבה הפריסטטית פועלת במהירות גבוהה, יש להעריך מחדש את צינורית הרחם האבותית והקשרים לדליפות נוזלים. אם מזוהים, יש לתקן דליפות. גם לשים לב, בעוד הלחץ הממוצע עורק הרחם יישאר קבוע (מוגדר ל 80 mmHg), שיעור זרימת הנוזלים עשוי להיות משתנה בהתאם התגובות הפיסיולוגיים וסקולרית. ניתן לזהות את הקוונפיקציה של זרימת הנוזלים כמשתנה ניסיוני בתגובה לחשיפה ל-xenoביוטית. - להפעיל את הסטופל כדי לאפשר. זרימת נוזלים לעורק הטבור הגדר את הלחץ על כ 50 mmHg, אשר ניתן ליישם עם משאבה פריסטלטית (איור 3) או טור הידרוסטטי.
- למלא את כל המאגרים (הרחם, הטבור, ו superfusate ו סופר) כדי לשמור על נפח הנוזלים במהלך הניסוי.
הערה: ברגע שהפרזיה הופעלה והניסוי מתנהל, הגורים המוכחים שנותרו בצלחת הניתוח עשויים להיות מוערך בשל הכדאיות על ידי נגיעה בגורים עם מלקחיים כדי להפיק תגובה נוירולוגית. דימום של הגורים יתרחש באמצעות כריתת רחם של קרן הרחם; המתת חסד נוספת ניתן להשלים באמצעות פרוטוקולים IACUC מאושר. במקרה זה, לפתוח את שק השפיר ב-PSS קר וליצור חזה אוויר על ידי חיתוך הצלעות.
5. ניסוי מבוים
- לאחר הצינורית והחניכה של PSS perfusion, לאפשר לרקמות במינימום עבור 30 דקות כדי לאפשר את הvasקולטורה כדי להתאים את זרימת הנוזל החדש. שאיבה את הקולחים על ידי פיפטה ולשמור אותו בתוך שפופרת מיקרוצנטריפוגה בהתאמה התווית.
- לאחר שיווי משקל, לבסס את הפרזיה הבסיסית על ידי איסוף קולחים עבור 10 דקות משתי סירות שקילה בצינורות מיקרוצנטריפוגה ומדידת נפח של נוזל שעולה דרך עורק הרחם הטבור וריד.
- התחל את איסוף הדגימות במרווחי זמן של 10 דקות על-ידי איסוף הקולחים מעורק הרחם המרוחק ועורק הטבור. לדוגמה, לנהל מינון 900 μL בכמות של 20 מנות קלקר המסומנות בתווית (8 x 10) חלקיקים/mL המושהים ב-0.01% מהתיל אל קו הכיוון של עורק הרחם כדי לזהות את המעבר של מסלול הזמן של קסביוטיקה חלקיקי חלקיקים ברחבי המכשול.
הערה: דגימות קולחים אלה יאפשרו מדידת מזהמים בתוך הנוזל (או הפרמקולוגית, פרמקוקולוגי, או מטבוליזם) ולספק את שיעור זרימת הנוזלים דרך עורק הרחם או על פני השליה אל התא העוברי ( איור 4). - לאחר בולוס אינפוזיה, לאסוף דגימות מעורק הרחם המרוחק ואת עוברי וריד הטבור כל 10 דקות עבור סך של 180 דקות לאחר העירוי.
6. ניקוי הציוד
- לאחר כל ניסוי, הסר את היחידה מהפיפטות. ניתן לשמור את כל התפרים כדי לעשות שימוש חוזר בניסויים עתידיים. הרקמה השלקתית עשויה להישמר למחקרים היסטלוגיים או מכניסטיים נוספים.
- נקו את כל הטאבוליגים והצינורית של מערכת זלוף עם 70% אתנול ואחריו מים מזוקקים ויבש ואקום.
הערה: אם הטאבגים או הפיפטות מתחילים לטשטש או להיראות פגומים, החליפו לפני הניסוי הבא. יתרה מזאת, לאחר השלמת המחזור הנסיוני (למשל, כל המחקרים הנוגעים לזיהום אחד), החליפו את כל הטאבגים בתוך התא כדי למנוע זיהום צולב.
Representative Results
איור 5 מראה את הניסויים הוכחת העיקרון באמצעות הצבע הכחול של אוון, המאפשר לנו לבדוק את המערכת ולהמחיש את התפקוד המתאים של נוזל ומכשול ההפרדה כדי למנוע העברת הבלימה לתא העובר. הצבע הכחול של האוון הגיע והניח את רקמת השליה בתוך מערכת זו (איור 5A). עם חקירה נוספת, ברור כי הצבע הכחול של האוון לא נכנס לווריד הטבור העובר (איור 5B), אשר צפוי הצבע הכחול של אוון מחויב אלבומין.
איור 6 מציג נתונים עבור הניסוי המזויף המתואר בפרוטוקול זה. דגימות קולחים מהקצה המרוחק של עורק הרחם ועורק הטבור העוברי נמדדו בכל קטע של 10 דקות כדי להעריך את זרימת הנוזלים לאורך זמן לאחר שמינון ההזנה היה מנוהל לעורק הרחם האימהי (איור 6). מופחתת העברת נוזלים לתא העובר בתוך 10 דקות לאחר פוליסטירן מוקצף זוהה. כדי לכמת את העברת הפוליסטירן מהתא העוברי במהלך הזמן כאשר הוא מתרחש, 25 μL של נוזל החומר מכל נקודת זמן הוצב ב 96 צלחת היטב בשכפול כדי למדוד את ה-פלואורסצנט לדוגמה. הקרינה הפלואורסצנטית נקבע על ידי קריאה ספקטרוסקופית ב 546/575 nm (לשעבר/em) באמצעות קורא מיקרופלייט פלורסנט. העברת פוליסטירן אל העובר העוברי אירעה בתוך 10 דקות והגיעה לשיאו ב -20 דקות ונמשכה 90 דקות (איור 6B).
מערכת משנה של רקמות הסביבה נשמרו עבור היפואתולוגיה והערכות מורפולוגיות. הרקמות היו פורמאלין קבוע המטאוקסילין ו אאוזין וביקורת על ידי לוח מוסמך הפתולוג וטרינרי. מומחים אלה לא זיהו מומים מבניים בעלי כמות של PSS בלבד, או PSS עם מינון ההזנה של פוליסטירן בעלי תווית של הרומדן.
איור 1: תא כלי בודד שהשתנה. (א) מבט כולל על התא שהשתנה. (ב) תמונת תקריב של מחטי הקצה הקהה המאובטחת בתוך תא הקיבול. החץ האדום מציין את הקליפ התרמי שהשתנה כדי להחזיק את המחטים במקום לצינורית הטבור. (ג) דמות מייצגת של ארבעת הצינורית המוכנה לצינורית רקמות. חיצים אדומים מצביעים. על כל אחת מארבע הצינורית אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: מבט קרוב יותר על החדר הפרזיזיאני המנטל. (א) הדבר מייצג את האבובים המחוברים ללחץ מתמר ומקאננולה את עורק הרחם האימהי הראשי, או "הזרימה הנכנס". הלחץ מוגדר לקבוע 80 mmHg כפי שהוגדר על ידי הספרות. (ב) מייצג את יציאת הניקוז הקאמרית של הסופרפופוסט המקיף את הרקמה השלקתית במהלך הפרזיה. (ג) זה מייצג את הזרימה הקאמרית של הסופרפופוסט לרחוץ את השליה עם pss מחומם במהלך perfusion. (ד) זה מייצג את נמל הרחם המרוחק, שבו הקולחים מפרזיה הרחם עשויה להיאסף. (ה) מייצג את יציאת הטמפרטורה, בה ניתן לחבר את תא הכלי למדחום ולחימום כדי לשמור על טמפרטורה עקבית במהלך הניסוי. (ו) זה מייצג את הצינורית עורק הטבור. עורק הטבור מווסת ל-50 mmHg כדי לאפשר זרימה של זרם נגדי ברמה של השליה. (ז) זה מייצג את אוסף השפכים בעורק הטבור. נוזל זורם לעבר התא העוברי במהלך זלוף ייאספו כאן. (ח) זהו המרכז של מערכת זלוף, שם השליה היא canנולה ונשמר במהלך זלוף. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: השקפה של מערכת הפלזיה המפעמה. (A ו- B) מערכת בקרת הלחץ המשמשת לניטור ולתחזוקה של 80 mhg של מבשם באמצעות עורק הרחם. (ג) זה מייצג את התרמית של חדר הפרפיוז. (ד) מיקרוסקופ. (ה) פרפיוז. (ו) הפרזיה של עורק הטבור מוזן ב 50 מ מ. (G) משאבה פריסטלטית המשמשת למילוי וניקוז של הפלדפוסט pss. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: סכימטי של מערכת הפרזיה הפלזינה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: תמונות מייצגות של ניסויים בהוכחת העיקרון באמצעות הצבע הכחול של אוון. (A ו- B) הוכחת העיקרון כי כחול של אוון יהיה לעשות את הרחם ובקרה, שריר הרחם, ואת השליה אבל לא לחצות את המכשול הנטל בשל הכריכה אלבומין. החץ הירוק מציין את ניקוז הורידים הכחולים מן השליה חזרה למחזור הדם האימהי. החץ האדום מציין את וריד הטבור. הקולחים לעבר התא העוברי . שים לב לחוסר הצבע הכחול (ג) דמות ייצוגית של איסוף קולחים מווריד הטבור. החץ האדום מצביע על היווצרות ירידה לפני הגבייה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: נתונים הנגזרים מהניסוי המזויף. מדידות הקרינה הפלואורסצנטית של הרומדורין הנקראת פוליסטירן מוקצף, מנורמל לפלואורסצנטית בסיסי, דרך האוסף של עורק הרחם (א) ו-(ב) עוברי וריד הטבור. ממוצע מנורמל ל-זריחה בסיסית ± שגיאה סטנדרטית (SE). *: p < 0.05 ו-T: p < 0.1 באמצעות ניתוח של שונות (ANOVA). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Discussion
שיטת הפרזיה זו מאפשרת הערכה מהירה של מכשול הסביבה ותפקוד פיזיולוגי של הרחם ושכבת הטרופוטסט. הצינורית והפרזיה של האבופה לקצות עורק הרחם האימהי מדמה את הפיזיולוגיה של זרימת הדם האימהית דרך כלי מרכזי זה אחראי על שליחת הדם לעובר המתפתח. מתודולוגיה זו מאפשרת הערכה פיזיולוגית של האמה המבודדת, הפלקתית והטבור, ולכן שינויים בפיזיולוגיה עשויים להיות מזוהים כפתולוגיה של כלי דם; innervations החיסונית ועצביים יוסרו בהליך לשעבר vivo. על מנת להבטיח הערכה נכונה, יש לפיכך קריטית לצינורית כלי זה בזהירות כדי לא ליצור דמעות או דקירות בקירות כלי הקיבול, ולהסיר בועות אוויר. אמבולי גז עלולים לגרום נזק לשכבת האנדותל של היום או לחסום את כלי הדם. על-ידי שמירה על הקשרים בין כלי הדם בין הרחם, השליה והעובר במהלך הניתוח, ניתן לצפות בהערכת הנוזלים והטרנסלוקציה לעובר. עם הממשל של xenobiotic יוטי, במקרה זה 20 פוליסטירן ננומטר, קינטיקה לקצה המרוחק של עורק הרחם ודרך השליה אל התא העוברי ניתן להעריך על ידי ניתוח של קולחים במהלך זמן של 180 דקות.
בעוד מודל כפול perfusion תוארה והעברת חלקיקים ונוזלים מן האימהית אל התא העוברי היה מפוקח במאמר זה, הערכות יכול גם להתבצע בהיפוך מן העובר אל התא האימהי. מגבלה אחת של השיטה המתוארת כאן היא שווריד הרחם המרוחק לא הגיע לידי כך או שנדגם. במחקרים עתידיים, במיוחד אלה המתמקדים בהעברה עוברית-אל-אימהית, יהיה חשוב להגיע לצינורית ולדגום את כלי הרחם המרוחק. הקולחים שנלקחו מניסוי מבוים זה שימשו להערכת העברה ביוביוטית; עם זאת, ניתן לבצע מגוון רחב של הערכות הנוגעות לפונקציות הפלריות האנדוקריניות והמולקולרית או לתזונה עוברית.
היתרונות של פרוטוקול זה עולים בהרבה על המגבלות המשניות. ההכנה שומרת על המבנה הפיזיולוגי ועל השלמות של איבר שלם כדי להעריך את התנאים הניסיוניים. הvivo לשעבר זלוף הפלנטל היא התקדמות מדעית מתוך מבוסס מחוץ לעולם כדי חשיפה מלאה בעלי חיים כדי לקבוע כראוי הערכת סיכונים הרבייה. הדבר עשוי להיחשב לטכניקה רבת ערך למחקרים המעריכים את מערכת התרופות הפרמקולוגית, הפרמקוקינטיקה, הטוקסיקולוגיה, הפיזיולוגיה והרפואה העוברית האימהית.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
עבודה זו הייתה נתמכת על ידי המכון הלאומי למדעי הסביבה (R00-ES024783), מרכז רטגרס לחשיפות ומחלות סביבתיות (P30-ES005022), ותוכנית בוגרת ורטגרס משותפת בטוקסיקולוגיה (T32-ES007148). בנוסף, אנו רוצים להודות לד"ר מיכאל גוז'קן, מריאן פוליונס ופדרו לאורו על המומחיות הטכנית שלהם וד ר אדם רצון טוב על עזרתו בעיצוב שרטוט שלנו (איור 5).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Black braided silk non-absorbable surgical suture non-sterile | Surgical Specialties Look | AACO805 | |
| Fine forceps | FST by Dumont Switzerland | 11252-20 | |
| Fine scissors | FST by Dumont Switzerland | 14060-10 | |
| Glass cannula pack | Living Systems Instrumentation (LSI) | GCP-75-100 | |
| Microcentrifuge Tubes 2.0mL polypropylene graduated tube with locking lid MIXED | Fisherbrand | 02-681-299 | |
| Non-serrated fine curved micro serrefine clamps | InterFocus | 18052-03 | |
| Perfusate pump | ISMATEC | ISM795C | |
| Pressure monitor | Living Systems Instrumentation (LSI) | Mode PM-4 | |
| Self-heating single vessel chamber | Living Systems Instrumentation (LSI) | CH-1 | |
| Servo Pump | Living Systems Instrumentation (LSI) | ModelPS-200-P | |
| Stainless steel blunt needle 23 gauge | Component Supply Co. | 04651-01 | |
| Stainless steel blunt needle 25 gauge | Component Supply Co. | 07116-01 | |
| STERILE Nylon Suture | AROSurgical Instruments Corporation | T04A00N07-13 | |
| Stopcock | Sedation Resource | 6-205-04 | |
| Temperature Controller | Living Systems Instrumentation (LSI) | Model TC-09S |
References
- Troen, P., Gordon, E. E. Perfusion studies of the human placenta. I. Effect of estradiol and human chorionic gonadotropin on citric acid metabolism. Journal of Clinical Investigation. 37, 1516-1523 (1958).
- Alexander, D. P., Huggett, A. S., Nixon, D. A., Widdas, W. F. The placental transfer of sugars in the sheep: the influence of concentration gradient upon the rates of hexose formation as shown in umbilical perfusion of the placenta. Journal of Physiology. 129, 367-383 (1955).
- Alexander, D. P., Andrews, R. D., Huggett, A. S., Nixon, D. A., Widdas, W. F. The placental transfer of sugars in the sheep: studies with radioactive sugar. Journal of Physiology. 129, 352-366 (1955).
- Dancis, J., Money, W. L. Transfer of sodium and iodo-antipyrine across guinea pig placenta with an in situ perfusion technique. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 80, 215-220 (1960).
- London, W. T., Money, W. L., Rawson, R. W. Placental Transport of I-131-Labeled Thyroxine and Triiodothyronine in the Guinea Pig. Endocrinology. 73, 205-209 (1963).
- Stulc, J., Stulcova, B., Svihovec, J. Transport of calcium across the dually perfused placenta of the rat. Journal of Physiology. 420, 295-311 (1990).
- Goeden, N., Bonnin, A. Ex vivo perfusion of mid-to-late-gestation mouse placenta for maternal-fetal interaction studies during pregnancy. Nature Protocols. 8, 66-74 (2013).
- Bond, H., et al. Artificial perfusion of the fetal circulation of the in situ mouse placenta: methodology and validation. Placenta. 27, Suppl A, S69-75 (2006).
- Illsley, N. P., Fox, H., Van der Veen, F., Chawner, L., Penfold, P. Human placental ultrastructure after in vitro dual perfusion. Placenta. 6, 23-32 (1985).
- Davis, M. J., Kuo, L., Chilian, W. M., Muller, J. M. Isolated, Perfused Microvessels. Clinically Applied Microcirculation Research. Barker, J. H., Anderson, G. L., Menger, M. D. , 1 ed, CRC Press. Boca Raton. 435-456 (1995).
- Butcher, J. T., Goodwill, A. G., Frisbee, J. C. The ex vivo isolated skeletal microvessel preparation for investigation of vascular reactivity. Journal of Visualized Experiments. (62), 3674 (2012).
