Summary
هنا يتم تقديم بروتوكول من الجسم الغريب السابق الام الجنين الاوعيه الدموية الوعائية لتمكين أداره ماده اختبار في الوعائية الاموميه وتقييم نقل المشيمة من الجزيئات البيولوجية أو العوامل الدوائية بالاضافه إلى التعديلات في فسيولوجيا المشيمة.
Abstract
المشيمة هي الجهاز الرئيسي خلال فتره الحمل التي تعمل كحاجز للتعرض الجنينية اكسيبيوبيوتيك ويتوسط تبادل المواد الغذائية للنفايات. يتم وصف الفحص هنا لأداء المشيمة المعزولة الفئران وتقييم الانتقال من الام إلى الجنين من xenobiotics السابق الجسم الحيوي. الاضافه إلى ذلك ، يمكن اجراء تقييم العمليات الفسيولوجية مثل تدفق السوائل إلى الجنين واستقلاب المشيمة مع هذه المنهجية. هذه التقنية هي مناسبه لتقييم حركيه الام إلى الجنين من المرشحين الصيدلانية أو الملوثات البيئية. وعلي النقيض من النهج البديلة الحالية ، تسمح هذه المنهجية بتقييم الاوعيه الدموية الاموميه الجنينية المعزولة ، مع أزاله المشاركة العصبية أو المناعية الجهازية ، مما يسمح بان تكون اي تغييرات ملحوظة في الوظيفة الفسيولوجية تعزي إلى العوامل المحلية داخل الانسجه المعزولة.
Introduction
من خلال الحفاظ علي البنية المورفولوجية والاستجابة الفسيولوجية ، كان الجهاز ترويه نهجا معتمدا علي النظام أو الانسجه لتحليل وظيفة التمثيل الأيضي. هذه التقنيات ترويه تسمح لفحص الجسم السابق من الاستجابات الانسجه السليمة لمجموعه متنوعة من المحفزات الدوائية والميكانيكية. وصفت perfusion من المشيمة البشرية في البداية في 1958 لتحديد الآثار الهرمونية علي النشاط الأيضي لدوره حمض الستريك. بعد ان تم التعرف عليها سابقا في المتجانسات الانسجه ، واعترف Troen غوردون الحاجة إلى توضيح النشاط الغدد الصماء باستخدام نهج الفسيولوجية الجديدة1. في نفس الحقبة ، تم وصف استراتيجيات أحاديه الانصهار (من الام إلى الجنين أو الجنين إلى الام) في نماذج كبيره2و3 و4 الحيوانية الصغيرة لفهم نقل المشيمة من السكريات ، والأملاح ، والادويه المضادة للبيرالين. في فيفو والسابقين فيفو ثنائي الانصهار (الام والجنين perfusion) تم وصف تقنيات لمزيد من توصيف نقل المشيمة باستخدام في فيفو5 و ex فيفو6,7,8 منهجيات. سمحت التطورات التكنولوجية في نقل ومسح المجهر الكترون الباحثين للتحقق من سلامه الهيكلية والوظيفية للانسجه المشيمة البشرية بعد ترويه9.
في حين ان ترويه من انسجه المشيمة البشرية و كوتيليدون الفردية هي الأكثر صله بالموضوع ، والتطور السريع للعوامل الدوائية والملوثات البيئية يتطلب استخدام نموذج ترويه الحيوانية للفحص المبكر من غريب حيوي نقل عبر حاجز المشيمة. هذا الأسلوب ترويه المشيمة يسمح لتقييم نقل عبر حاجز المشيمة باستخدام أكثر سهوله يمكن الوصول اليها والمشيمة الفئران ذات الصلة الفسيولوجية. الاضافه إلى ذلك ، تدفق السوائل عبر حاجز المشيمة علي مدي فتره من الزمن بعد التعرض يمكن تقييمها من خلال قياس حجم perfusate القادمة من الشريان السري. بفضل السماح بالتلقيح المشيمة من كل من الام والجنين التعميمات ، وهذا النهج المزدوج التدفق الجهاز كله يمكن ان تكون مفيده بالمقارنة مع الحالي في المختبر والنهج المجرية. يسمح هذا الأسلوب باداره الجانب الأمومي من خلال الجوانب النفاسية التي تقاس من perfusate الذي يظهر عبر المشيمة عبر الوريد السري ، أو العكس. البروتوكول المعروض هنا سوف يصف نقل 20 نانومتر البوليسترين (نانوبلاستيك المشتركة المستخدمة في المواد الغذائية والمنتجات الطبية) من الشريان الرحمي الامومه إلى المقصورة الجنينية وانخفاض المرتبطة في تدفق السوائل عبر المشيمة لتوضيح استخدام هذه الطريقة في العديد من الإعدادات الفسيولوجية ، والدوائية ، والسمية لتقييم انتقال المشيمة ، والأيض ، والتعديلات الفسيولوجية التي تؤثر علي تدفق الأمهات و/أو الاجنه.
Protocol
وقد تمت الموافقة علي جميع الإجراءات التجريبية من قبل لجنه الرعاية الحيوانية والاستخدام المؤسسي لجامعه روتجرز.
1. التحضير قبل التجربة
ملاحظه: قد يتم تنفيذ هذه الخطوات خلال أيام/أسابيع قبل التجربة.
- تعديل غرفه السفينة.
ملاحظه: يبين الشكل 1 الف، باء غرفه السفينة الواحدة المعدلة.- نقل جهاز استشعار الثرمستور من تحت القصاصة وثني عليه بحيث يعلق بحريه في حمام ترويه (الشكل 1b).
- تثبيت اثنين 4 بوصه غير القابل للصدا الابر الفولاذ المقاوم للاستانلس مع محاور اتصال تركيبه القياسية ، 1 25 g و 1 23 g المضمونة تحت المشبك الثرمستور وأضافه محبس 3-الطريقة للسماح لتعليب الاوعيه الدموية السرية (الشكل 1b).
ملاحظه: الاتصالات تركيبه من احجام قياس مختلفه اللون مرمزه. وهذا يسهل التعرف بسهوله علي السفن اثناء التجربة وبعدها.
- تثبيت اثنين من الأنابيب الزجاجية الصغيرة 70 − 100 μm. وللحصول علي مزيد من المعلومات عن هذه الإجراءات ، يرجى مراجعه المراجع التالية:10و11.
ملاحظه: قطر الطرف الذي يشيع استخدامه في هذه التجارب هو في نطاق 70 − 100 μm. تلميح أقطار أكبر من هذا النطاق قد تضيف صعوبة علي عمليه التعليب في حين ان أقطار غيض أصغر من 60 μm قد ثقب جدار الاوعيه الدموية اثناء التعليب. - اعداد الروابط من خياطه النايلون المعقمة (لغايات القريبة والبعيدة من الشريان الرحمي) ومن الحرير مضفر الأسود غير معقمه خياطه (للسفن السرية). جعل العلاقات واحده عن طريق حلقات خياطه كما لبدء عقده مربعه أو ربط الحذاء ، كما هو موضح سابقا11.
ملاحظه: وعاده ما يتم اجراء العلاقات واحده والاحتفاظ بها في طبق بيتري مليئه طبقه صغيره من المطاط سيليكون للمساعدة في العمل علي خلفيه لزجه. - اعداد 2 لتر من محلول الملح الفسيولوجي (PSS) التي تحتوي علي ، في ملليمول/لتر ، 129.8 NaCl ، 5.4 KCl ، 0.5 الجناح2PO4، 0.83 mgso4، 19 ناهكو3، 1.8 cacl2، و 5.5 الجلوكوز. ضبط درجه الحموضة إلى 7.40 ± 0.02 عن طريق أضافه ببطء بضع قطرات من حمض (1 م حمض الهيدروكلوريك) أو قاعده (1 N هيدروكسيد الصوديوم) إلى الحل والانتظار علي الأقل 20 ق قبل قراءه قياس الحموضة المعدلة. تخزين PSS حتى تصبح جاهزه للاستخدام في الثلاجة للحد من التلوث ولكن لا تخزن لأكثر من 2 أسابيع.
- تسميه أنابيب الطرد المركزي لجمع "الأمهات" و "الجنينية" النفايات السائلة في كل نقطه زمنيه ، اي "MBaseline ، M10 ، M20 ،..." تصل إلى نقطه زمنيه 180 دقيقه. اعداد نفسه لفضلات الجنين (FBaseline ، M10 ، M20 ،....).
- معايره جميع المعدات المستخدمة داخل النظام ، بما في ذلك درجه حرارة الحمام المتداولة وشاشات ضغط الدم المرتبطة بالحفاظ علي الرحم (80 مم زئبق) والسرة (50 مم زئبق) الضغوط perfusate.
- اعداد غرفه تشريح (4 "قطر × 1" عميق) أو طبق سخان تعميم عن طريق ملء طبقه (< 0.25 ") من مطاط السيليكون. يجب ان يتم هذا التعديل مقدما وكما انه سيستغرق 12 − 24 ساعة ليجف المطاط.
ملاحظه: ينصح باستخدام سخان/تقشعر لها الأبدان طبق لجراحي المبتدئين ، والطبق لن تتحرك والانسجه سوف تحافظ علي درجه حرارة ثابته.
2-اعداد المحطة الجراحية وتاخيرمن المعدات
- تشغيل جميع المعدات التي تدعم نظام ترويه للتحقق من الوظيفة المناسبة. أزاله PSS من التبريد ودافئه إلى درجه حرارة الغرفة. سيتم استخدام PSS ك perfusate و superfusate.
- وضع الحجر فقاعات صغيره لتسليم خليط الغاز في خزان superfusate. وتشمل الخلائط المستخدمة عاده 21 ٪ س2، 8 ٪ س2، 3 ٪ س2، و 0 ٪ س2. قم بتشغيل الغاز لتوفير فقاعات صغيره للحل superfusate. ضبط تسليم الغاز لتجنب الرش.
- ترتيب محطه تشريح الحيوانية عن طريق التحقق من التخدير ، وترتيب المعدات الجراحية ، واعداد العلاقات خياطه. اعداد غرفه تشريح عن طريق جمع دبابيس تشريح ، وتحول علي المبرد (أو استرداد الجليد) ، وملء غرفه تشريح (تصطف مع المطاط سيليكون) مع PSS الباردة.
- ملء بلطف جميع الغرف ، والابر ، والأنابيب الدقيقة الزجاجية ، والمواسير ، والخزانات مع PSS تحسنت ، ويراقب بعناية لأزاله فقاعات الهواء عن طريق الشفط لهم مع ماصه غرامه نقل غيض. قم بتحويل جميع التوقفات ثلاثية الاتجاات مع "إيقاف" التي تواجه اتجاه الماصة لتامين السائل داخل الماصة.
- ضع ربطه عنق واحده علي كل من الأنبوبين الصغيرين الزجاجيين المعدين لتعليب الرحم وعلي ابره الطرفين الحادتين المخصصتين لتعليب الحبل السري. تامين الروابط مع الأنابيب والابر الحاده من أجل منع الخسارة اثناء تحركات الغرفة (الشكل 1 ج).
3. حصاد المشيمة
- تخدير انثي حامل الفئران في اليوم الحملي 20 مع 5 ٪ ايزوفلوان لمده 4 دقائق أو حتى المعروضات الحيوانية التنفس. نقل الحيوانية إلى مخروط الأنف وأداره 2.5 ٪ − 3 ٪ ايزوفلوراني للحفاظ علي التخدير. تاكيد فقدان الوعي بسبب عدم وجود منعكس قرصه اصبع القدم.
ملاحظه: يتم عرض استخدام الفئران في اليوم الحملي 20 في هذا البروتوكول. ومع ذلك ، يظل البروتوكول كما هو إذا اقتضت الظروف التجريبية اجراء تقييم المشيمة في وقت مبكر من الحمل. - تحديد وعزل قرن الرحم (اليمين أو اليسار) من الاختيار عن طريق رفع وانتشار الطرق الطويلة خارج الذبيحة الفئران. باستخدام خياطه الحرير مضفر ، التعادل قباله الشريان الرحمي في نهاية المبيض ونهاية المهبل من القرن. وتشمل المبيض داخل الخياطة مع قرن الرحم.
- باستخدام مقص جراحي ، والمكوس بعيدا القرن الرحم عن طريق اجراء تخفيضات علي الجانب القريب من العنق المبيض والجانب البعيد من التعادل المهبلي ، وترك القرن الرحمي مربوطه قباله مع الغرز علي كلا الطرفين. نقل قرن الرحم في صحن تشريح اصطف مع مطاط السيليكون ومليئه الباردة (4 °C) PSS. بغض النظر عن ما إذا كان يتم اختيار القرن الأيمن أو الأيسر ، والحفاظ علي هذا الجانب نفسه للاختيار في كل تجربه للاتساق.
ملاحظه: لتخدير الجنين ، يتم الاحتفاظ الجراء في الجليد الباردة PSS. لذلك ، يتم الحفاظ علي درجه الحرارة PSS داخل غرفه تشريح بواسطة حمام تعميم المبردة أو غرفه تشريح ينبغي ان تبقي علي الجليد.
ملاحظه: في هذه المرحلة قد يكون السد التخدير رحيم لكل مختبر موافقه بروتوكول IACUC. في هذه الحالة ، يحدث القتل الرحيم عن طريق استرواح الصدر (عن طريق قطع الحجاب الحاجز) وأزاله القلب الأمومي. - دفع بلطف دبوس تشريح من خلال قرن الرحم في المطاط سيليكون ، مع الجانب المبيض إلى الجانب الأيسر والمهبلي إلى اليمين لتصور الاوعيه الدموية في الرحم. وهذا سوف استقرار الرحم ومنع حركه الانسجه اثناء تشريح المقصورة الجنينية. حدد وحده الام-المشيمة-الجنين المركزية إلى القرن وربط الشريان الرحمي والوريد مع مقص الجراحية. قطع عضله الرحم القريبة والبعيدة إلى المشيمة المختارة والجنين. يمكن سحب عضلات الرحم عن طريق سحبه إلى الجانب. من المهم ان تترك الأمر سليما ولكن تسحبه بعيدا عن تغطيه الجرو الجنيني.
ملاحظه: ينبغي ان يستند اختيار وحده الام-المشيمة-الجنين علي طول الجزء الشريان الرحمي علي جانبي الشريان مقوس. سيسمح قطاعات طويلة أكثر ناجحه تعليب. - باستخدام ملقط دقيق ومقص ، وأزاله الغشاء السلوى من سطح الجنين من المشيمة ، مع الحرص علي تجنب الحبل السري.
- كشف وربط الحبل السري لفصل الجرو الجنين.
- تحديد الشريان السري (الاوعيه الأكثر سمكا) والوريد (الوعاء الأنحف). وضع علامة علي الوريد السري لسهوله التعرف عليه عن طريق تقطيعه أقصر قليلا من الشريان السري.
- افصل الشريان السري والوريد عن بعضهما البعض برفق.
- قد يتم قطع وأزاله وحده المشيمة بأكملها بما في ذلك الاوعيه الدموية في الرحم ، وعضله الرحم ، والمشيمة ، والحبل السري.
4. المشيمة التروية
- الحفاظ علي تدفق الدم التشريحي الاحتفاظ بالاتجاه الصحيح البعيد إلى القريب من الشريان الرحمي ، ووضع وحده المشيمة (تتالف من الاوعيه الدموية في الرحم ، وعضله الرحم ، والمشيمة ، والحبل السري) في غرفه السفينة المعزولة المعدلة شغل مع الدافئة ، PSS الأوكسيجين.
- باستخدام زوج من الملقط الناعم في كل يد ، وتعليب الأطراف القريبة والبعيدة من الشريان الرحمي علي الماصات الزجاجية الصغيرة.
- أمن الشريان الرحمي باحكام باستخدام ربطه النايلون المعقمة التي تم تامينها مسبقا علي الماصة المجهرية.
ملاحظه: قد يكون من الضروري الحلقات التعادل اثنين (عقده); ومع ذلك ، حلقه واحده التعادل يسمح لمزيد من التكيف. - تعليب الشريان السري (تدفق الدم من الجنين إلى الام) علي 23 غرام (أكبر) ابره وتامينه مع الأسود مضفر خياطه الحرير.
- الوريد السري (تدفق الدم من الام إلى الجنين) علي 25 غ (أصغر) ابره حاده وتامينه مع الأسود مضفر خياطه الحرير.
- الانتقال إلى محطه ترويه المشيمة والردم جميع صنابيربلاستيك والأنابيب لمنع فقاعات الهواء. ربط جميع الأنابيب وفقا لشكل 2.
- وضع قوارب صغيره وزنها تحت التعليب البعيدة من الشريان الرحمي الأمومي والابره الوريد السري الجنيني للقبض علي النفايات السائلة التي سوف تظهر اثناء العملية.
- قم بتشغيل المضخة التمعجيه ، ووحده تحكم الضغط ، وجهاز مراقبه الضغط وافتح محبس للسماح بتدفق السوائل من خلال الأنابيب نحو محول الضغط ، ولكن ليس بعد إلى المشيمة. زيادة الضغط ببطء إلى 80 مم زئبق.
- ببطء بدوره محبس إلى المشيمة لفتح ومشاهده التسريبات داخل الغرفة وحول العلاقات.
ملاحظه: إذا كانت المضخة التمعجيه تعمل بسرعة عاليه ، فأعد تقييم التعليب الرحمي القريب والعلاقات لتسريب السوائل. إذا تم تحديدها ، يجب تصحيح التسريبات. لاحظ أيضا, في حين ان متوسط ضغط الشريان الرحمي ستبقي ثابته (تعيين إلى 80 زئبق), قد يكون معدل تدفق السائل متغير اعتمادا علي الاستجابات الفسيولوجية الوعائية والمشيمة. ويمكن تحديد كميه تدفق السوائل باعتبارها متغيرا تجريبيا استجابه للتعرض للإشعاعات البيولوجية. - أدر القضيب للسماح بتدفق السوائل إلى الشريان السري. اضبط الضغط علي حوالي 50 مم زئبق ، والذي يمكن تنفيذه باستخدام مضخة التمعجيه (الشكل 3) أو عمود هيدروستاتيكي.
- أعاده ملء جميع الخزانات (الرحم ، السرة ، و superfusate) للحفاظ علي حجم السوائل في جميع انحاء التجربة.
ملاحظه: بمجرد البدء بالانصهار والتجربة جاريه ، قد يتم تقييم الجراء التخدير المتبقية في صحن تشريح للبقاء من خلال لمس الجراء مع ملقط للحصول علي استجابه عصبيه. سيحدث الإفراط في الدم من الجراء من خلال استئصال الرحم من قرن الرحم. يمكن الانتهاء من المزيد من القتل الرحيم من خلال بروتوكولات IACUC المعتمدة. في هذه الحالة ، فتح الكيس السلوى في PSS الباردة وخلق استرواح الصدر عن طريق قطع الأضلاع.
5-التجربة الصورية
- بعد التعليب والبدء في العجان PSS ، والسماح للانسجه تتوازن لمده 30 دقيقه للسماح للاوعيه الوعائية للتكيف مع تدفق السوائل الجديدة. شفط النفايات السائلة بواسطة ماصه وحفظه في أنبوب الطرد المركزي المسمي بالمقابل.
- بعد التاخيرمن ، يمكنك إنشاء الخط القاعدي عن طريق جمع الفضلات السائلة لمده 10 دقائق من كل من الزوارق التي تزن في أنابيب الطرد المركزي وقياس حجم السائل الذي يظهر من خلال الشريان الرحمي والوريد السري.
- بدء جمع العينات في فترات مدتها 10 دقائق عن طريق جمع الفضلات السائلة من الشريان الرحمي البعيد والوريد السري. علي سبيل المثال ، أداره 900 μl بوليوس جرعه من 20 نانومتر رونامامين المسمي البوليسترين الجسيمات النانويه (8 × 1014 جزيئات/مل) معلقه في 0.01 ٪ السطحي إلى الخط النبض الشريان الرحمي للتعرف علي مرور الوقت دوره من غريب حيوي جسيمات نانويه عبر حاجز المشيمة.
ملاحظه: هذه العينات النفايات السائلة سوف تسمح لقياس الملوثات داخل السائل (اما اكسيبيوبيوتيك ، الدوائية ، أو المستقلب) وتوفير معدل تدفق السوائل من خلال الشريان الرحمي أو عبر المشيمة وفي حجره الجنين ( الشكل 4). - بعد ضخ بولوس ، وجمع عينات من الشريان الرحمي البعيد والجنين الوريد السري الجنيني كل 10 دقيقه لما مجموعه 180 دقيقه بعد التسريب.
6. تنظيف المعدات
- بعد كل تجربه ، قم بازاله وحده المشيمة من الماصات. قد يتم حفظ جميع الخيوط لأعاده استخدامها في التجارب المستقبلية. قد يتم حفظ انسجه المشيمة للدراسات النسيجية أو الميكانيكية الاضافيه.
- تنظيف جميع الأنابيب وأكلات اللحوم من نظام ترويه مع 70 ٪ الايثانول تليها المياه المقطرة والفراغ الجاف.
ملاحظه: إذا كانت الأنابيب أو الماصات تبدا بالتلطيخ أو تظهر تالفة ، استبدلها قبل التجربة التالية. وعلاوة علي ذلك ، بعد اكتمال الفوج التجريبي (علي سبيل المثال ، جميع الدراسات المتعلقة بملوث واحد) ، يستعاض عن جميع الأنابيب داخل الغرفة لمنع التلوث العابر.
Representative Results
يبين الشكل 5 تجارب إثبات المبدا باستخدام صبغه ايفان الزرقاء ، مما يسمح لنا باختبار النظام وتصور وظيفة حاجز السوائل والمشيمة المناسبة ومنع نقل الاحتواء إلى مقصوره الجنين. الصبغة الزرقاء ايفان وصلت و perfused انسجه المشيمة داخل هذا النظام (الشكل 5A). وعند المزيد من التحقيق ، من الواضح ان صبغه ايفان الزرقاء لم تدخل الوريد السري الجنيني (الشكل 5 ب) ، والذي من المتوقع ان تكون صبغه ايفان الزرقاء مرتبطة بالزلال.
ويبين الشكل 6 بيانات التجربة الصورية الموصوفة في هذا البروتوكول. وقد قيست عينات النفايات السائلة من الطرف البعيد لشريان الرحم والوريد السري الجنيني في كل جزء من القطعة التي تبلغ 10 دقائق لتقييم تدفق السوائل بمرور الوقت بعد ان كانت الجرعة البولية تدار علي شريان الرحم الأمومي (الشكل 6). انخفاض نقل السوائل إلى المقصورة الجنينية في غضون 10 دقيقه بعد ان تم التعرف علي ضخ البوليسترين. لقياس نقل البوليسترين إلى المقصورة الجنينية اثناء الدورة الزمنيه عند حدوثه ، تم وضع 25 μL من السائل perfused استخدام من كل نقطه زمنيه في لوحه 96 جيدا في نسخه مكرره لقياس الفلورية عينه. وقد تم تحديد الفلورية عن طريق قراءه الطيفية في 546/575 نانومتر (ex/em) باستخدام قارئ ميكروبلايت الفلورسنت. وقد تم نقل البوليسترين إلى حجره الجنين في غضون 10 دقائق وبلغ ذروته في 20 دقيقه واستمر لمده 90 دقيقه (الشكل 6 ب).
تم حفظ مجموعه فرعيه من انسجه المشيمة التي تم استخدامها للحصول علي التقييمات التشريحية والمورفولوجية. وكانت الانسجه formalin-ثابته والدموية والملطخة يوزين ومراجعتها من قبل مجلس الأطباء البيطريين المعتمدين. وقد حدد هؤلاء الخبراء عدم وجود تشوات هيكليه في مشيمة perfused مستخدمه من قبل pss فقط ، أو pss مع جرعه البلعه من البوليسترين المسمي رونامامين.
الشكل 1: غرفه السفينة الواحدة المعدلة. (ا) لمحه عامه عن الغرفة المعدلة. (ب) صوره عن قرب لابر الأطراف الحاده المضمونة داخل غرفه السفينة. يشير السهم الأحمر إلى القصاصة الحرارية التي تم تغييرها للاحتفاظ بالابر في مكانها لاجراء التعليب السري. (ج) صوره تمثيليه لأكله اللحوم الاربعه المعدة لتعليب الانسجه. السهام الحمراء تشير إلى كل من الأكلات الاربعه. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: نظره فاحصه علي غرفه المشيمة. (ا) يمثل هذا الأنبوب الملحق بمحول الضغط والشريان الرحمي للامومه القريبة ، أو "التدفق الداخلي". ضبطت ضغطه إلى ثابته 80 [زئبق] بما ان يعين بالأدب. (ب) وهذا يمثل ميناء استنزاف الغرفة من superfusate المحيطة انسجه المشيمة اثناء الانصهار. (ج) وهذا يمثل التدفق الغرفة من superfusate للاستحمام المشيمة مع تحسنت PSS خلال perfusion. (د) وهذا يمثل الميناء الرحمي الأمومي البعيد الذي يمكن فيه جمع النفايات السائلة من التروية الرحمية. (ه) وهذا يمثل الميناء درجه الحرارة ، حيث يمكن ربط غرفه السفينة إلى ميزان الحرارة وسخان للحفاظ علي درجه حرارة ثابته طوال التجربة. (و) وهذا يمثل تعليب الشريان السري. يتم ضغط الشريان السري إلى 50 مم زئبق للسماح بتدفق التيار المعاكس علي مستوي المشيمة. (ز) وهذا يمثل جمع نفايات الوريد السري. سيتم جمع السوائل التي تتدفق نحو المقصورة الجنينية اثناء التروية هنا. (H) هذا هو مركز النظام ترويه ، حيث يتم تعليب المشيمة والحفاظ عليها في جميع انحاء ترويه. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: منظر لنظام التروية المشيمة. (ا و ب) نظام التحكم في الضغط المستخدمة لرصد وصيانة 80 مم زئبق من perfusate من خلال الشريان الرحمي. (ج) وهذا يمثل التنظيم الحراري للغرفة ترويه. (د) المجهر. (ه) غرفه perfusion. (و) الشرايين السرية التي تغذيها الجاذبية والتي تم ضبطها عند 50 مم زئبق. (ز) مضخة التمعجيه تستخدم لملء وتصريف المشيمة الفائقة PSS. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: تخطيط نظام التروية المشيمة. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: صور تمثيليه لتجارب إثبات المبدا باستخدام صبغه ايفان الزرقاء. (A و B) دليل علي مبدا ان الأزرق ايفان سوف حقنت الاوعيه الدموية في الرحم ، وعضلات الرحم ، والمشيمة ولكن لن عبور حاجز المشيمة بسبب ملزمه الزلال. يشير السهم الأخضر إلى التصريف الوريدي الأزرق من المشيمة مره أخرى إلى الدورة الدموية الام. يشير السهم الأحمر إلى تدفق الوريد السري نحو حجره الجنين. لاحظ عدم وجود صبغه زرقاء. (ج) صوره تمثيليه لجمع النفايات السائلة التي تستنزف من الوريد السري. يشير السهم الأحمر إلى تشكيل الإسقاط قبل التجميع. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: البيانات المستمدة من التجربة الصورية. القياسات الفلورية من رونامامين-المسمي البوليسترين المواد النانويه ، تطبيع إلى الخط القاعدي ، من خلال جمع (ا) الشريان الرحمي و (ب) نفايات الوريد السري الجنيني. يعني تطبيع لخط الأساس مضان ± الخطا القياسي (SE). *: p < 0.05 و T: p < 0.1 عن طريق تحليل الفرق (ANOVA). يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
Discussion
هذا الأسلوب ترويه يسمح للتقييم السريع لحاجز المشيمة والوظيفة الفسيولوجية للطبقة الوعائية الرحمية وطبقه تروفوبلاست. ويحاكي التعليب والانصهار في النهايات القريبة لشريان الرحم الأمومي فسيولوجيا تدفق الدم الأمومي من خلال هذه السفينة الرئيسية المسؤولة عن إرسال الدم إلى الجنين النامي. وتسمح هذه المنهجية بالتقييم الفسيولوجي للاوعيه الدموية المعزولة الاموميه والمشيمة والسرية ، التالي يمكن التعرف علي التغيرات في فسيولوجيا كامراض وعائية ؛ تتم أزاله الإينيرفيشنز المناعية والعصبية في الاجراء السابق فيفو. ولضمان التقييم السليم ، من المهم لذلك ان تقوم هذه الاوعيه بعناية بحيث لا تخلق اي دموع أو ثقوب في جدران الاوعيه ، وتزيل فقاعات الهواء. قد يسبب الغاز الصمات ضررا علي الطبقة البطانية من الاوعيه الدموية أو عرقله الاوعيه. من خلال الحفاظ علي الاتصالات الوعائية بين الرحم والمشيمة والجنين اثناء التشريح ، يمكن ملاحظه تقييم السوائل والنقل إلى الجنين. مع الاداره من [اكسيبيوتيك], في هذا حاله 20 [نم] بوليستيرين, حركيه إلى النهاية بعيده من الشريان رحميه ومن خلال المشيمة إلى المقصورة جنينيه يستطيع كنت قيمت بتحليل الفضلات علي دوره زمنيه من 180 دقائق.
في حين تم وصف نموذج ثنائي الانصهار وتم رصد نقل الجزيئات والسوائل من الام إلى المقصورة الجنينية في هذه المقالة ، ويمكن أيضا اجراء تقييمات في الاتجاه المعاكس من الجنين إلى حجره الامومه. أحد القيود علي الطريقة الموصوفة هنا هو ان الوريد الرحمي البعيد لم يتم أكله أو أخذ عينات. في الدراسات المستقبلية ، وخاصه تلك التي تركز علي نقل الجنين إلى الام ، سيكون من المهم تعليب وتذوق الاوعيه الرحمية البعيدة. واستخدمت النفايات السائلة الماخوذه من هذه التجربة الصورية لتقييم نقل القيم البيولوجية. ومع ذلك ، يمكن اجراء مجموعه واسعه من التقييمات المتعلقة بوظائف الغدد الصماء والمشيمة الجزيئية أو تغذيه الجنين.
وقوه هذا البروتوكول تفوق بكثير قيوده الطفيفة. ويحافظ الاعداد علي البنية الفسيولوجية والسلامة للجهاز بأكمله لتقييم الظروف التجريبية. السابقة المجرية المشيمة التروية هو تطور علمي من الخلوية القائمة في المختبر إلى التعرض الحيواني كله لتحديد بشكل صحيح تقييم المخاطر الانجابيه. وهذا يمكن اعتبار ان تكون تقنيه قيمه للدراسات تقييم التخلص من المخدرات الدوائية المشيمة, الدوائية, علم السموم, فسيولوجيا, وطب الام والجنين.
Disclosures
وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.
Acknowledgments
وقد دعم هذا العمل المعهد الوطني لعلوم الصحة البيئية (R00-ES024783) ، ومركز روتجرز للتعرض البيئي والامراض (P30-ES005022) ، وبرنامج روتجرز المشترك للدراسات العليا في علم السموم (T32-ES007148). ونود أيضا ان نشكر السيد مايكل غويدكين ، وماريان بولناس ، وبيدرو لورو علي خبرتهم التقنية والدكتور ادم حسن النية لمساعدته في تصميم التخطيطي الخاص بنا (الشكل 5).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Black braided silk non-absorbable surgical suture non-sterile | Surgical Specialties Look | AACO805 | |
| Fine forceps | FST by Dumont Switzerland | 11252-20 | |
| Fine scissors | FST by Dumont Switzerland | 14060-10 | |
| Glass cannula pack | Living Systems Instrumentation (LSI) | GCP-75-100 | |
| Microcentrifuge Tubes 2.0mL polypropylene graduated tube with locking lid MIXED | Fisherbrand | 02-681-299 | |
| Non-serrated fine curved micro serrefine clamps | InterFocus | 18052-03 | |
| Perfusate pump | ISMATEC | ISM795C | |
| Pressure monitor | Living Systems Instrumentation (LSI) | Mode PM-4 | |
| Self-heating single vessel chamber | Living Systems Instrumentation (LSI) | CH-1 | |
| Servo Pump | Living Systems Instrumentation (LSI) | ModelPS-200-P | |
| Stainless steel blunt needle 23 gauge | Component Supply Co. | 04651-01 | |
| Stainless steel blunt needle 25 gauge | Component Supply Co. | 07116-01 | |
| STERILE Nylon Suture | AROSurgical Instruments Corporation | T04A00N07-13 | |
| Stopcock | Sedation Resource | 6-205-04 | |
| Temperature Controller | Living Systems Instrumentation (LSI) | Model TC-09S |
References
- Troen, P., Gordon, E. E. Perfusion studies of the human placenta. I. Effect of estradiol and human chorionic gonadotropin on citric acid metabolism. Journal of Clinical Investigation. 37, 1516-1523 (1958).
- Alexander, D. P., Huggett, A. S., Nixon, D. A., Widdas, W. F. The placental transfer of sugars in the sheep: the influence of concentration gradient upon the rates of hexose formation as shown in umbilical perfusion of the placenta. Journal of Physiology. 129, 367-383 (1955).
- Alexander, D. P., Andrews, R. D., Huggett, A. S., Nixon, D. A., Widdas, W. F. The placental transfer of sugars in the sheep: studies with radioactive sugar. Journal of Physiology. 129, 352-366 (1955).
- Dancis, J., Money, W. L. Transfer of sodium and iodo-antipyrine across guinea pig placenta with an in situ perfusion technique. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 80, 215-220 (1960).
- London, W. T., Money, W. L., Rawson, R. W. Placental Transport of I-131-Labeled Thyroxine and Triiodothyronine in the Guinea Pig. Endocrinology. 73, 205-209 (1963).
- Stulc, J., Stulcova, B., Svihovec, J. Transport of calcium across the dually perfused placenta of the rat. Journal of Physiology. 420, 295-311 (1990).
- Goeden, N., Bonnin, A. Ex vivo perfusion of mid-to-late-gestation mouse placenta for maternal-fetal interaction studies during pregnancy. Nature Protocols. 8, 66-74 (2013).
- Bond, H., et al. Artificial perfusion of the fetal circulation of the in situ mouse placenta: methodology and validation. Placenta. 27, Suppl A, S69-75 (2006).
- Illsley, N. P., Fox, H., Van der Veen, F., Chawner, L., Penfold, P. Human placental ultrastructure after in vitro dual perfusion. Placenta. 6, 23-32 (1985).
- Davis, M. J., Kuo, L., Chilian, W. M., Muller, J. M. Isolated, Perfused Microvessels. Clinically Applied Microcirculation Research. Barker, J. H., Anderson, G. L., Menger, M. D. , 1 ed, CRC Press. Boca Raton. 435-456 (1995).
- Butcher, J. T., Goodwill, A. G., Frisbee, J. C. The ex vivo isolated skeletal microvessel preparation for investigation of vascular reactivity. Journal of Visualized Experiments. (62), 3674 (2012).
