Summary
यहां पूर्व वीवो मातृ-भ्रूण संवहनी छिड़काव के एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया है मातृ वाहिकान्यास में एक परीक्षण लेख के प्रशासन को सक्षम करने के लिए और में परिवर्तन के अलावा xenobiotic कणों या औषधीय एजेंटों के अपरा हस्तांतरण का मूल्यांकन करने के लिए अपरा फिजियोलॉजी.
Abstract
अपरा गर्भावस्था के दौरान एक प्रमुख अंग है कि भ्रूण xenobiotic जोखिम के लिए एक बाधा के रूप में कार्य करता है और कचरे के लिए पोषक तत्वों के आदान प्रदान मध्यस्थता करता । एक परख यहां वर्णित करने के लिए एक अलग चूहा अपरा शवद और मातृ का मूल्यांकन-xenobiotics पूर्व vivo के भ्रूण स्थानांतरण । इसके अलावा, इस तरह के भ्रूण और अपरा चयापचय के लिए तरल पदार्थ प्रवाह के रूप में शारीरिक प्रक्रियाओं का मूल्यांकन इस पद्धति के साथ आयोजित किया जा सकता है । इस तकनीक का मूल्यांकन करने के लिए उपयुक्त है मातृ-भ्रूण कैनेटीक्स दवा उंमीदवारों या पर्यावरण contaminants । वर्तमान वैकल्पिक दृष्टिकोण के विपरीत, इस पद्धति अलग मातृ-भ्रूण वाहिकान्यास के मूल्यांकन की अनुमति देता है, प्रणालीगत तंत्रिका या प्रतिरक्षा की भागीदारी के साथ हटा दिया, शारीरिक समारोह में किसी भी मनाया परिवर्तन होने की अनुमति अलग ऊतक के भीतर स्थानीय कारकों के कारण ।
Introduction
रूपात्मक संरचना और शारीरिक जवाबदेही को बनाए रखने के द्वारा, अंग छिड़काव एक स्वीकार किए जाते है प्रणाली या ऊतक चयापचय समारोह का विश्लेषण करने के लिए आधारित दृष्टिकोण रहा है । ये छिड़काव तकनीक औषधीय और यांत्रिक उत्तेजकों की एक किस्म के लिए बरकरार ऊतक प्रतिक्रियाओं के पूर्व vivo परीक्षा के लिए अनुमति देते हैं । मानव नाल के छिड़काव शुरू में वर्णित किया गया था १९५८ में साइट्रिक एसिड चक्र की चयापचय गतिविधि पर हार्मोनल प्रभाव की पहचान करने के लिए; पहले ऊतक homogenates में पहचान की गई, Troen और गॉर्डन एक उपंयास शारीरिक दृष्टिकोण1का उपयोग कर endocrine गतिविधि को स्पष्ट करने की आवश्यकता को मांयता दी । एक ही युग में, एक-perfusion (मातृ-भ्रूण या भ्रूण के लिए मातृ) रणनीतियों बड़े2,3 और छोटे4 पशु मॉडल में वर्णित करने के लिए शर्करा, लवण, और एंटीपाइरीन दवाओं के अपरा हस्तांतरण को समझने थे । Vivo में और पूर्व vivo में दोहरे perfusion (समंवित मातृ और भ्रूण perfusion) तकनीकों को आगे के लिए विवो5 और पूर्व वीवो6,7,8 पद्धतियों में उपयोग करते हुए अपरा हस्तांतरण की विशेषता वर्णित किया गया था । ट्रांसमिशन और स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी में तकनीकी प्रगति शोधकर्ताओं ने मानव अपरा ऊतकों की संरचनात्मक और कार्यात्मक अखंडता की पुष्टि के बाद9छिड़काव करने के लिए अनुमति दी ।
जबकि मानव अपरा ऊतकों और व्यक्तिगत बीजपत्र के छिड़काव सबसे अधिक प्रासंगिक है, औषधीय एजेंटों और पर्यावरण contaminants के तेजी से विकास xenobiotic की जल्दी स्क्रीनिंग के लिए एक पशु छिड़काव मॉडल के उपयोग की आवश्यकता अपरा बाधा भर में स्थानांतरण. इस अपरा छिड़काव विधि अधिक आसानी से प्राप्य और फिजिकली प्रासंगिक चूहा अपरा का उपयोग कर अपरा बाधा भर में हस्तांतरण के मूल्यांकन के लिए अनुमति देता है । इसके अलावा, एक जोखिम के बाद समय की अवधि में अपरा बाधा भर में द्रव प्रवाह नाल धमनी से आ रही perfusate की मात्रा को मापने के द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है । दोनों मातृ और भ्रूण circulations से अपरा छिड़काव की अनुमति के आधार पर, इस दोहरे प्रवाह पूरे अंग दृष्टिकोण में वर्तमान की तुलना में लाभप्रद हो सकता है विट्रो और vivo में दृष्टिकोण में । इस विधि मातृ पहलू के माध्यम से एक xenobiotic के प्रशासन की अनुमति देता है perfusate कि नाल शिरा, या इसके विपरीत के माध्यम से अपरा भर में उभर से मापा जा करने के लिए । प्रोटोकॉल यहां प्रस्तुत 20 एनएम polystyrene (एक आम nanoplastic खाद्य और चिकित्सा उत्पादों में इस्तेमाल किया) मातृ गर्भाशय धमनी से भ्रूण के डिब्बे के हस्तांतरण और अपरा भर में द्रव प्रवाह में एक से जुड़े कमी वर्णन करने के लिए वर्णन होगा अपरा स्थानांतरण, चयापचय, और शारीरिक परिवर्तन का आकलन करने के लिए एकाधिक शारीरिक, औषधीय, और विष-विज्ञान सेटिंग्स में इस विधि का उपयोग मातृ और/या भ्रूण प्रवाह को प्रभावित करने वाले.
Protocol
रटगर्स यूनिवर्सिटी की इंस्टीट्यूशनल एनिमल केयर एंड यूज कमिटी ने सभी प्रायोगिक प्रक्रियाओं को मंजूरी दे दी ।
1. प्रयोग से पहले तैयारी
नोट: इन चरणों का प्रयोग करने से पहले दिनों/हफ्तों के भीतर किया जा सकता है ।
- पोत चैंबर को संशोधित करें ।
नोट: चित्रा 1a, बी संशोधित एकल पोत चैंबर से पता चलता है ।- क्लिप के नीचे से थर्मिस्टर सेंसर को खिसकाएं और उसे मोड़ें ताकि यह परफ्यूजन बाथ में स्वतंत्र रूप से लटक जाए (चित्र 1b) ।
- स्थापित दो 4 इंच कुंद-टिप मानक luer कनेक्शन हब के साथ स्टेनलेस स्टील सुई, १ २५ जी और १ २३ जी थर्मिस्टर क्लिप के नीचे सुरक्षित और एक 3 तरह के रोधनी जोड़ने के लिए नाल वाहिकान्यास के cannulation (चित्र 1b) के लिए अनुमति देते हैं ।
नोट: विभिंन गेज आकार के luer कनेक्शन रंग कोडित रहे हैं । यह प्रयोग के दौरान और बाद में जहाजों की आसानी से पहचान की सुविधा प्रदान करता है ।
- दो 70 − 100 माइक्रोमीटर ग्लास माइक्रोपिपेट्स स्थापित करें । इन कार्यविधियों पर अधिक जानकारी के लिए, कृपया निम्न संदर्भ10,11की समीक्षा करें ।
नोट: आमतौर पर इन प्रयोगों में उपयोग किया जाने वाला टिप व्यास 70 − 100 μm की श्रेणी में होता है । इस श्रेणी से अधिक व्यास में कठिनाई cannulation प्रक्रिया को जोड़ सकते हैं, जबकि टिप ६० μm से छोटे व्यास cannulation के दौरान संवहनी दीवार पंचर हो सकता है । - बाँझ नायलॉन सीवन से संबंध तैयार (गर्भाशय धमनी के समीपस्थ और बाहरी छोर के लिए) और काले लट से रेशम गैर बाँझ सीवन (नाल वाहिकाओं के लिए) । एक वर्ग गाँठ आरंभ या एक जूता टाई के रूप में, पहले से11वर्णित के रूप में लूपिंग सीवन से एकल संबंध बनाओ ।
नोट: एकल संबंधों को सामांयतः बनाया जाता है और सिलिकॉन रबर की एक छोटी सी परत से भरा एक Petri पकवान में रखा एक चिपचिपा पृष्ठभूमि पर काम करने में मदद । - 2 एल शारीरिक नमक समाधान (पीएसएस) जिसमें mmol/L, १२९.८ NaCl, ५.४ KCl, ०.५ नाह2पो4, ०.८३ mgso4में, 19 Nahco3, १.८ cacl2, और ५.५ ग्लूकोज तैयार । ७.४० ± ०.०२ करने के लिए पीएच समायोजित करें धीरे से एसिड की कुछ बूंदें जोड़ने (1 एम हाइड्रोक्लोरिक एसिड) या आधार (1 N सोडियम हाइड्रोक्लोरिक) समाधान करने के लिए और समायोजित पीएच माप को पढ़ने से पहले ंयूनतम 20 एस प्रतीक्षा करें । स्टोर करने के लिए तैयार है जब तक कि फ्रिज में उपयोग के लिए संदूषण को कम करने के लिए, लेकिन अधिक से अधिक 2 सप्ताह के लिए दुकान नहीं है ।
- "मातृ" और "भ्रूण" प्रत्येक समय बिंदु पर, अर्थात, "MBaseline, M10, M20,..." १८० ंयूनतम timepoint तक । भ्रूण कचरे के लिए एक ही तैयार (FBaseline, M10, M20,....) ।
- सभी उपकरण प्रणाली के भीतर इस्तेमाल किया, परिसंचारी स्नान तापमान और रक्तचाप को बनाए रखने (८० mmHg) और नाभि (५० mmHg) perfusate दबाव के साथ जुड़े मॉनिटर सहित, जांचना ।
- एक विच्छेदन चैंबर तैयार (4 "व्यास x 1" गहरा) या एक परिसंचारी हीटर डिश एक परत (< ०.२५ ") सिलिकॉन रबर की भरने के द्वारा । इस संशोधन को पहले से किया जाना चाहिए और चूंकि रबड़ सूखने में 12 − 24 घंटे का समय लगेगा ।
नोट: एक recirculating हीटर का उपयोग करें/.......... ।
2. शल्य स्टेशन की तैयारी और उपकरणों का समलिकरण
- सभी उपकरण है कि छिड़काव प्रणाली का समर्थन करता है उचित समारोह के लिए जांच करने पर मुड़ें । प्रशीतन से PSS निकालें और गर्म करने के लिए कमरे के तापमान । पीएसएस एक perfusate और एक superfusate दोनों के रूप में इस्तेमाल किया जाएगा ।
- एक छोटे से bubbling पत्थर प्लेस को superfusate जलाशय में एक गैस मिश्रण उद्धार । सामान्यतः उपयोग किए जाने वाले मिश्रण में 21% o 2, 8% o2, 3% o2, और 0% o2शामिल हैं । गैस पर बारी करने के लिए superfusate समाधान के लिए छोटे बुलबुले प्रदान करते हैं । Splashing से बचने के लिए गैस के वितरण को समायोजित करें ।
- चतनाशूंय करनेवाली औषधि की जांच, शल्य चिकित्सा उपकरणों की व्यवस्था, और सीवन संबंधों की तैयारी के द्वारा पशु विदारक स्टेशन की व्यवस्था । विदारक पिन इकट्ठा करके विदारक चैंबर तैयार, छिल्लर पर मोड़ (या बर्फ वापस लाने), और विदारक चैंबर भरने (रबर सिलिकॉन के साथ पंक्तिवाला) ठंड PSS के साथ ।
- धीरे सभी कक्षों, सुई, ग्लास micropipettes, टयूबिंग भरने, और गरम PSS के साथ जलाशयों, सावधानी के लिए देख रहे है और उंहें एक ठीक टिप हस्तांतरण pipette के साथ बाहर suctioning द्वारा हवा बुलबुले को नष्ट करने । पिपेट के भीतर तरल पदार्थ को सुरक्षित करने के लिए पिपेट की दिशा का सामना कर रहे "बंद" के साथ सभी 3 तरह के stopcocks मुड़ें ।
- दो ग्लास माइक्रोपिपेट्स में से प्रत्येक पर एक एकल टाई रखें जो गर्भाशय के लिए तैयार किया जाता है और दो कुंद नोक पर नाल के लिए नामित सुई । चैंबर आंदोलनों के दौरान नुकसान को रोकने के क्रम में पिपेट और कुंद टिप सुई को सुरक्षित संबंधों (चित्रा 1 सी) ।
3. अपरा संचयन
- के बारे में 4 मिनट के लिए 5% isoflurane के साथ गर्भावधि 20 दिन पर एक गर्भवती महिला चूहे anesthetize या जब तक जानवर सांस लेने परिश्रम प्रदर्शित । नाक शंकु के लिए पशु ले जाएँ और संज्ञाहरण बनाए रखने के लिए 2.5% − 3% isoflurane प्रशासन । पैर की अंगुली चुटकी पलटा की कमी से बेहोशी की पुष्टि करें ।
नोट: गर्भावधि 20 दिन में एक चूहा का उपयोग इस प्रोटोकॉल में प्रस्तुत किया है । तथापि, प्रोटोकॉल वही रहता है यदि प्रायोगिक स्थितियों में गर्भकाल में पहले होने के लिए अपरा मूल्यांकन की आवश्यकता होती है । - पहचान और बाहर उठाने और चूहे के शव के बाहर लंबे रास्ते बाहर फैल द्वारा पसंद के गर्भाशय सींग (सही या बाईं) को अलग । एक लट में रेशम सीवन का उपयोग, अंडाशय अंत और सींग के योनि अंत में गर्भाशय धमनी टाई । गर्भाशय के सींग के साथ सीवन के अंदर अंडाशय शामिल हैं ।
- शल्य चिकित्सा कैंची का उपयोग करना, दूर उत्पाद अंडाशय टाई के समीपस्थ पक्ष पर कटौती कर और योनि टाई के बाहर की ओर, गर्भाशय के सींग दोनों सिरों पर टांके के साथ बंद बंधे छोड़ कर । विदारक डिश सिलिकॉन रबर के साथ पंक्तिवाला में गर्भाशय सींग हस्तांतरण और ठंड से भरा (4 ° c) PSS । भले ही दाएं या बाएं हॉर्न को चुना गया हो, निरंतरता के लिए प्रत्येक प्रयोग में चयन के लिए उसी पक्ष को बनाए रखें ।
नोट: भ्रूण संज्ञाहरण के लिए, पिल्ले बर्फ-ठंड PSS में रखा जाता है । इसलिए, विदारक चैंबर के भीतर पीएसएस तापमान ठंडा परिसंचारी स्नान या विदारक चैंबर बर्फ पर रखा जाना चाहिए द्वारा बनाए रखा है ।
नोट: इस बिंदु पर संवेदनीकृत बांध प्रयोगशाला IACUC प्रोटोकॉल अनुमोदन प्रति euthanized जा सकता है । इस मामले में, इच्छामृत्यु (डायाफ्राम काटने से) और मातृ हृदय को हटाने के माध्यम से वातिलवक्ष होता है । - धीरे से गर्भाशय के सींग के माध्यम से एक विदारक पिन सिलिकॉन रबर में धक्का, अंडाशय के साथ बाईं और योनि की ओर करने के लिए सही करने के लिए गर्भाशय वैस्क्युलेशन कल्पना । यह गर्भाशय को स्थिर और भ्रूण के डिब्बे के विच्छेदन के दौरान ऊतक की आवाजाही को रोकने जाएगा । एक मातृ-नाल-भ्रूण सींग के लिए केंद्रीय इकाई का चयन करें और शल्य कैंची के साथ गर्भाशय धमनी और नस ligate । चयनित अपरा और भ्रूण को गर्भाशय मांसपेशी समीपस्थ और बाहर की काट । गर्भाशय की मांसपेशी को साइड में खींचने से मुकर सकता है; यह महत्वपूर्ण है इसे बरकरार छोड़ लेकिन यह भ्रूण पिल्ला कवर से दूर खींच ।
नोट: मातृ-अपरा-भ्रूण इकाई का चयन चापाकार धमनी के दोनों ओर गर्भाशय धमनी खंड की लंबाई पर आधारित होना चाहिए । अब खंडों अधिक सफल cannulation अनुमति देगा । - ठीक संदंश और कैंची का प्रयोग, नाल की भ्रूण सतह से एमनियोटिक झिल्ली को हटाने, देखभाल करने के लिए गर्भनाल से बचने के ।
- भ्रूण pup अलग करने के लिए गर्भनाल को सुलझाना और ligate ।
- नाभि धमनी (मोटा वाहिका) और शिरा (पतले बर्तन) की पहचान करें । नाल धमनी से थोड़ा छोटा काट कर आसान पहचान के लिए नाभि शिरा चिह्नित करें ।
- एक दूसरे से नाल की धमनी और शिरा को धीरे से अलग कर लें ।
- गर्भाशय वाहिकाविन्यास, गर्भाशय की मांसपेशी, अपरा और गर्भनाल सहित संपूर्ण अपरा इकाई को काटा और हटाया जा सकता है ।
4. अपरा छिड़काव
- शारीरिक रक्त प्रवाह को बनाए रखने की सही दूर रखने के लिए गर्भाशय धमनी के समीपस्थ अभिविन्यास, अपरा इकाई (गर्भाशय वाहिकीय, गर्भाशय की मांसपेशी, नाल, और गर्भनाल) संशोधित पृथक पोत चैंबर में भरा में जगह के साथ गर्म, oxygenated PSS ।
- प्रत्येक हाथ में ठीक संदंश की एक जोड़ी का उपयोग, कांच micropipettes पर गर्भाशय धमनी के समीपस्थ और बाहर का छोर cannulate ।
- कसकर गर्भाशय के नायलॉन सीवन टाई का उपयोग कर पहले micropipette पर सुरक्षित धमनी सुरक्षित ।
नोट: दो टाई छोरों (गाँठ) आवश्यक हो सकता है; हालांकि, एक एकल टाई पाश अधिक से अधिक समायोजन के लिए अनुमति देता है. - नाल धमनी (भ्रूण के लिए मातृ रक्त प्रवाह) पर 23 जी (बड़ा) सुई और काले लट रेशम सीवन के साथ सुरक्षित cannulate ।
- नाल शिरा (मातृ-भ्रूण रक्त प्रवाह) 25 ग्राम (छोटे) कुंद सुई पर cannulate और काले लट में रेशम सीवन के साथ सुरक्षित ।
- अपरा छिड़काव स्टेशन के लिए कदम और backfill सभी stopcocks और tubings हवा बुलबुले को रोकने के लिए । चित्रा 2के अनुसार सभी tubings कनेक्ट.
- इस प्रक्रिया के दौरान उभरने वाले बहिस्त्राव को पकड़ने के लिए मातृ गर्भाशय धमनी के डिकल कनकुलेशन और भ्रूण की नाभि शिरा की सुई तोपों के नीचे छोटी वजनी नौकाओं को रखें ।
- सिकुड़नेवाला पंप, दबाव नियंत्रक, और दबाव मॉनिटर पर मुड़ें और दबाव transducer की ओर टयूबिंग के माध्यम से द्रव प्रवाह की अनुमति के लिए रोधनी खुला है, लेकिन अभी तक अपरा के लिए नहीं । धीरे ८० mm Hg करने के लिए दबाव बढ़ाएं ।
- धीरे से खोलने के लिए और चैंबर के अंदर लीक और संबंधों के आसपास के लिए देखने के लिए नाल को रोधनी बारी ।
नोट: यदि सिकुड़नेवाला पंप एक उच्च गति पर चल रहा है, फिर से समीपस्थ गर्भाशय cannulation और तरल पदार्थ लीक के लिए संबंधों का मूल्यांकन । यदि पहचान की है, लीक remedied किया जाना चाहिए । यह भी ध्यान दें, जबकि मतलब गर्भाशय धमनी का दबाव लगातार रहेगा (८० mmHg के लिए सेट), द्रव प्रवाह की दर चर हो सकता है संवहनी और अपरा शारीरिक प्रतिक्रियाओं पर निर्भर करता है । द्रव प्रवाह का परिमाणीकरण, जैनोबायोटिक जोखिम के प्रत्युत्तर में प्रायोगिक चर के रूप में पहचाना जा सकता है । - नाल धमनी में द्रव प्रवाह की अनुमति के लिए रोधनी मुड़ें । लगभग ५० mmhg, जो एक सिकुड़नेवाला पंप (चित्रा 3) या एक हीड्रास्टाटिक स्तंभ के साथ लागू किया जा सकता है के लिए दबाव सेट करें ।
- पूरे प्रयोग में द्रव की मात्रा को बनाए रखने के लिए सभी जलाशयों (गर्भाशय, नाभि, और superfusate) को फिर से भरना ।
नोट: एक बार छिड़काव शुरू कर दिया गया है और प्रयोग चल रहा है, विच्छेदी डिश में शेष संवेदनीकृत पिल्ले को तंत्रिका संबंधी प्रतिक्रिया प्राप्त करने के लिए संदंश के साथ पिल्ले को छूकर व्यवहार्यता के लिए मूल्यांकन किया जा सकता है । पिल्ले का बहिर्ंगुलन गर्भाशय सींग के हिस्टेरेक्टॉमी के माध्यम से हो जाएगा; इसके अलावा स्वीकृत IACUC प्रोटोकॉल के माध्यम से इच्छामृत्यु को पूरा किया जा सकता है । इस मामले में, ठंडी पीएसएस में एमनियोटिक सैक खोलना और पसलियों को काटकर न्यूमोथोरेक्स बनाना ।
5. मॉक प्रयोग
- Cannulation और पीएसएस छिड़काव की दीक्षा के बाद, ऊतकों को 30 मिनट के लिए equilibrate करने के लिए वाहिकाविन्यास नए द्रव प्रवाह को समायोजित करने के लिए अनुमति देते हैं । एक पिपेट द्वारा उत्प्रवाह चूषण और एक तदनुसार लेबल माइक्रो अपकेंद्रित्र ट्यूब में इसे बचाने के लिए ।
- समानता के बाद, सूक्ष्म अपकेंद्रित्र ट्यूबों में दोनों वजनी नावों से 10 मिनट के लिए बहिस्त्रावों का संग्रह करके आधारभूत छिड़काव की स्थापना करें और गर्भाशय धमनी और नाभि शिरा के माध्यम से उभरने वाले द्रव की मात्रा को मापना ।
- दूर गर्भाशय धमनी और नाभि शिरा से अपशिष्ट इकट्ठा करके 10 मिनट के अंतराल पर नमूना संग्रह आरंभ करें । उदाहरण के लिए, एक ९०० μl सांस खुराक के 20 एनएम rhodamine लेबल polystyrene नैनोकणों (8 x 1014 कणों/एमएल) ०.०१% में निलंबित करने के लिए गर्भाशय धमनी perfusing के समय कोर्स के मार्ग की पहचान करने के लिए xenobiotic अपरा बाधा के पार नैनोकणों ।
नोट: इन प्रवाह नमूनों तरल पदार्थ (या तो xenobiotic, औषधीय, या metabolite) के भीतर contaminants के मापन के लिए अनुमति देगा और गर्भाशय धमनी के माध्यम से या अपरा भर में तरल पदार्थ का प्रवाह की दर प्रदान करने और भ्रूण के डिब्बे में ( चित्रा 4) । - बोलस आसव के बाद, बाहर का गर्भाशय धमनी और भ्रूण नाल शिरा प्रवाह से नमूने एकत्र के अर्क के बाद १८० मिनट की कुल के लिए हर 10 मिनट ।
6. उपकरण क्लीनिंग
- प्रत्येक प्रयोग के बाद प्लेनेटल यूनिट को पिपेट्स से निकाल लें । सभी टांके भविष्य के प्रयोगों में reused किया जा करने के लिए बचाया जा सकता है । अपरा ऊतक अतिरिक्त ऊतकीय या यंत्रवादी अध्ययन के लिए बचाया जा सकता है ।
- स्वच्छ सभी tubings और ७०% आसुत जल और वैक्यूम सूखी के बाद इथेनॉल के साथ छिड़काव प्रणाली के cannulas ।
नोट: यदि tubings या पिपेट शुरू करने के लिए उतरना या क्षतिग्रस्त दिखाई देते हैं, अगले प्रयोग से पहले की जगह । इसके अलावा, एक प्रयोगात्मक पलटन के बाद पूरा हो गया है (जैसे, सभी एक एकल contaminant से संबंधित अध्ययन), चैंबर के भीतर सभी tubings की जगह पार संदूषण को रोकने के लिए.
Representative Results
चित्रा 5 सबूत के सिद्धांत है इवान ब्लू डाई का उपयोग कर प्रयोगों से पता चलता है, हमें प्रणाली का परीक्षण करने के लिए और उचित तरल पदार्थ और अपरा बाधा समारोह कल्पना और भ्रूण के डिब्बे में रोकथाम हस्तांतरण को रोकने की अनुमति । इवान के नीले रंग तक पहुंच गया और इस प्रणाली के भीतर अपरा के ऊतकों perfused (चित्रा 5a) । आगे की जांच पर, यह स्पष्ट है कि इवान के नीले रंग भ्रूण नाभि नस में प्रवेश नहीं किया (चित्रा 5B), जो है इवान नीले रंग के रूप में उंमीद है albumin से बंधे है ।
चित्र 6 इस प्रोटोकॉल में वर्णित मॉक प्रयोग के लिए डेटा दर्शाता है । गर्भाशय धमनी और भ्रूण नाल शिरा के बाहर के छोर से बहिस्त्राव नमूने प्रत्येक 10 मिनट के खंड पर मापा गया था समय के बाद तरल प्रवाह का मूल्यांकन करने के बाद बोलस खुराक मातृ गर्भाशय धमनी के लिए प्रशासित किया गया था (चित्रा 6) । पॉलीस्टाइरीन निषेचन की पहचान के बाद 10 मिनट के भीतर भ्रूण के डिब्बे को कम तरल पदार्थ हस्तांतरण । समय पाठ्यक्रम के दौरान भ्रूण डिब्बे को polystyrene के हस्तांतरण की मात्रा निर्धारित करने के लिए जब यह होता है, प्रत्येक समय बिंदु से 25 μL perfused तरल पदार्थ का नमूना प्रतिदीप्ति को मापने के लिए डुप्लिकेट में एक ९६ कूप प्लेट में रखा गया था । प्रतिदीप्ति पर स्पेक्ट्रोस्कोपिक रीडिंग द्वारा निर्धारित किया गया था 546/575 एनएम (पूर्व/em) एक फ्लोरोसेंट माइक्रोप्लेट रीडर का उपयोग भ्रूण के डिब्बे में पॉलीस्टाइरीन स्थानांतरण 10 मिनट के भीतर हुआ और 20 मिनट पर नुकीला और ९० मिनट के लिए जारी रखा (चित्रा 6B) ।
ऊतक विज्ञान और रूपात्मक आकलनों के लिए पूर्णप्रयुक्त अपरा ऊतकों का एक उपसमुच्चय सहेजा गया. ऊतक formalin-फिक्स्ड और hematoxylin और eosin दाग और एक बोर्ड द्वारा की समीक्षा पशु रोगविज्ञानी प्रमाणित किया गया । इन विशेषज्ञों placentas में कोई संरचनात्मक असामान्यताओं की पहचान केवल pss द्वारा perfused, या pss rhodamine-लेबल polystyrene के सांस खुराक के साथ ।
चित्रा 1: संशोधित एकल पोत चैंबर । (क) संशोधित चैंबर का एक सिंहावलोकन । (ख) पोत चैम्बर के भीतर सुरक्षित कुंद नोक की सुइयों की एक क्लोज़-अप छवि । लाल तीर नाल cannulation के लिए जगह में सुइयों पकड़ करने के लिए बदल दिया गया है कि थर्मिस्टर क्लिप को इंगित करता है । (ग) ऊतक कनकुलेशन के लिए तैयार की गई चार कैन्नुको की एक प्रतिनिधिक छवि । लाल तीर चार cannulas में से प्रत्येक को इंगित करें । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।
चित्रा 2: अपरा छिड़काव चैंबर के एक करीब देखने. (क) यह दाब ट्रांसड्यूसर से जुड़ी ट्यूबिंग का प्रतिनिधित्व करता है और समीपस्थ मातृ गर्भाशय धमनी, या "अंतर्वाह" को cannulated है । दबाव एक निरंतर ८० mmHg के रूप में साहित्य द्वारा परिभाषित करने के लिए सेट है । (इ) यह परिगलन के दौरान अपरा ऊतक के आस-पास के चैम्बर ड्रेन पोर्ट को दर्शाता है । (ग) यह पेसेंटा के दौरान गर्म पीएसएस के साथ अपरा को नहलाने के लिए सुपर फ्यूटेट के चैंबर अंतर्वाह को दर्शाता है । (घ) यह उस दूरस्थ मातृ गर्भाशय पत्तन का प्रतिनिधित्व करता है जहां गर्भाशय से निकलने वाले बहिस्त्राव को एकत्र किया जा सकता है । (ड) यह ताप द्वारक का प्रतिनिधित्व करता है, जहाँ प्रयोग के दौरान एक सुसंगत तापक्रम बनाए रखने के लिए पोत-कक्ष को तापमापी तथा हीटर से जोड़ा जा सकता है । (च) यह नाल धमनी केनोलेशन को दर्शाता है । नाल धमनी ५० mmHg के लिए दबाव है अपरा के स्तर पर countercurrent प्रवाह के लिए अनुमति देते हैं । (ह) यह नाभि शिरा बहिस्राव संग्रह को निरूपित करता है । तरल पदार्थ है कि छिड़काव के दौरान भ्रूण के डिब्बे की ओर बहती है यहां एकत्र किया जाएगा । (ज) यह छिड़काव प्रणाली है, जहां नाल cannulated है और छिड़काव भर में बनाए रखा है के केंद्र है । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।
चित्रा 3: अपरा छिड़काव प्रणाली का एक दृश्य. (A और B) दबाव नियंत्रण प्रणाली की निगरानी और गर्भाशय धमनी के माध्यम से perfusate के ८० mmhg बनाए रखने के लिए इस्तेमाल किया । (ग) यह परफ्यूजन चैंबर के थर्मो-रेगुलेशन का प्रतिनिधित्व करता है । (घ) सूक्ष्मदर्शी । (ङ) छिड़काव कक्ष । (च) गुरुत्व-पोषित नाल धमनी छिड़काव ५० एमएमएचजी पर निर्धारित किया गया है । (छ) एक परिस्तंभी पंप को भरने और अपरा superfusate पीएसएस के निकास के लिए इस्तेमाल किया । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।
चित्रा 4: अपरा छिड़काव प्रणाली की योजनाबद्ध । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।
चित्रा 5: है इवान नीले रंग का उपयोग कर सबूत के सिद्धांत के प्रयोग के प्रतिनिधि छवियां । (ए और बी) सबूत के सिद्धांत है कि इवान नीले गर्भाशय वाहिकन्यास, गर्भाशय की मांसपेशी, और अपरा शवद लेकिन अपरा एल्ब्युमिन बाध्यकारी के कारण बाधा पार नहीं करेगा । हरी तीर नाल से वापस मातृ परिसंचरण के लिए नीले शिरापरक जल निकासी इंगित करता है । लाल तीर भ्रूण के डिब्बे की ओर नाल शिरा बहिस्त्राव इंगित करता है । नीले रंग की कमी पर ध्यान दें । (ग) नाभि शिरा से बहिस्त्राव को एकत्र करने की एक प्रतिनिधिक छवि । लाल तीर संग्रह करने से पहले ड्रॉप निर्माण को इंगित करता है । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।
चित्र 6: मॉक प्रयोग से प्राप्त डाटा । रोडैमाइन-लेबल पॉलीस्टाइरीन नैनोमैटेरियल्स के प्रतिदीप्ति माप, बेसलाइन फ्लोरोसेंस के लिए सामान्यीकृत, के संग्रह के माध्यम से (क) गर्भाशय धमनी और (ख) भ्रूण नाल शिरा बहिस्त्रावों. आधारभूत प्रतिदीप्ति ± मानक त्रुटि (SE) के लिए सामान्यीकृत मतलब है । *: p < ०.०५ और T: प्रसरण (ANOVA) के विश्लेषण के माध्यम से p < ०.१ । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।
Discussion
यह परफ्यूजन विधि गर्भाशय वाहिकान्यास और पोषकोरक परत के अपरा बाधा और शारीरिक कार्य के तेजी से मूल्यांकन के लिए अनुमति देता है । यह एक प्रमुख पोत के माध्यम से मातृ रक्त प्रवाह के शरीर क्रिया विज्ञान के माध्यम से विकसित भ्रूण के लिए रक्त भेजने के लिए जिंमेदार है । इस पद्धति अलग मातृ, अपरा और नाल वाहिकाविन्यास के शारीरिक मूल्यांकन के लिए अनुमति देता है, और इसलिए शरीर विज्ञान में परिवर्तन संवहनी विकृति विज्ञान के रूप में पहचाना जा सकता है; प्रतिरक्षा और तंत्रिका innervations पूर्व vivo प्रक्रिया में हटा रहे हैं । उचित मूल्यांकन सुनिश्चित करने के लिए, इसलिए इन जहाजों को सावधानी से cannulate के रूप में किसी भी आंसू या पोत दीवारों में पंचर नहीं बनाने के लिए, और हवा के बुलबुले को दूर करने के लिए महत्वपूर्ण है । गैस एम्बुली से वेस्क्युलेचर की एंडोथेलियल लेयर को नुकसान हो सकता है या रक्त वाहिकाओं में रुकावट आ सकती है । विच्छेदन के दौरान गर्भाशय, अपरा और भ्रूण के बीच संवहनी कनेक्शन को बनाए रखने के द्वारा, भ्रूण के लिए तरल पदार्थ और स्थानांतरण का मूल्यांकन मनाया जा सकता है । एक xenobiotic के प्रशासन के साथ, इस मामले में 20 एनएम polystyrene, गर्भाशय धमनी के बाहर का छोर और भ्रूण के डिब्बे के लिए अपरा के माध्यम से कैनेटीक्स १८० मिनट के समय पाठ्यक्रम पर अपशिष्ट के विश्लेषण के द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है ।
जबकि एक ड्यूअल-परफ्यूजन मॉडल बताया गया था और मातृ से भ्रूण के डिब्बे में कणों और तरल पदार्थ के हस्तांतरण पर नजर रखी गई थी इस आर्टिकल में यह आकलन भी किया जा सकता है कि भ्रूण से लेकर मातृ कम्पार्टमेंट तक में रिवर्स में क्या कर सकते हैं । विधि की एक सीमा यहां वर्णित है कि बाहर का गर्भाशय शिरा cannulated या जांचा नहीं गया था । भविष्य के अध्ययन में, विशेष रूप से उन पर ध्यान केंद्रित भ्रूण को मातृ हस्तांतरण, यह cannulate और नमूना बाहर का गर्भाशय पोत महत्वपूर्ण होगा । इस नकली प्रयोग से लिए गए बहिस्त्रावों का उपयोग xenobiotic अंतरण का आकलन करने के लिए किया गया था; तथापि, अंत: स्रावी और आणविक अपरा कार्यों या भ्रूण के पोषण से संबंधित आकलन की एक विस्तृत सरणी प्रदर्शन किया जा सकता है.
इस प्रोटोकॉल की ताकत अभी तक अपनी छोटी सीमाओं पल्ला झुकना । यह तैयारी प्रायोगिक परिस्थितियों का आकलन करने के लिए पूरे अंग की शारीरिक संरचना और अखंडता को बनाए रखती है । Ex vivo अपरा छिड़काव पूरी तरह से प्रजनन जोखिम मूल्यांकन का निर्धारण करने के लिए पूरे पशु जोखिम के लिए सेलुलर आधारित इन विट्रो से एक वैज्ञानिक प्रगति है । यह अपरा औषधीय दवा स्वभाव, फार्माकोकाइनेटिक्स, विष विज्ञान, शरीर विज्ञान, और मातृ-भ्रूण चिकित्सा का मूल्यांकन अध्ययन के लिए एक मूल्यवान तकनीक माना जा सकता है ।
Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
इस काम के राष्ट्रीय पर्यावरण स्वास्थ्य विज्ञान संस्थान (R00-ES024783), Rutgers पर्यावरण जोखिम और रोग (P30-ES005022), और Rutgers संयुक्त स्नातक विष विज्ञान में कार्यक्रम (T32-ES007148) के लिए केंद्र द्वारा समर्थित था । हम भी डीआरएस का शुक्रिया अदा करना चाहेंगे । माइकल goedken, marianne polunas, और pedro louro अपने तकनीकी विशेषज्ञता और Dr. एडम सद्भावना के लिए अपनी सहायता के लिए हमारी छिड़काव योजनाबद्ध डिजाइन में (चित्रा 5) ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Black braided silk non-absorbable surgical suture non-sterile | Surgical Specialties Look | AACO805 | |
| Fine forceps | FST by Dumont Switzerland | 11252-20 | |
| Fine scissors | FST by Dumont Switzerland | 14060-10 | |
| Glass cannula pack | Living Systems Instrumentation (LSI) | GCP-75-100 | |
| Microcentrifuge Tubes 2.0mL polypropylene graduated tube with locking lid MIXED | Fisherbrand | 02-681-299 | |
| Non-serrated fine curved micro serrefine clamps | InterFocus | 18052-03 | |
| Perfusate pump | ISMATEC | ISM795C | |
| Pressure monitor | Living Systems Instrumentation (LSI) | Mode PM-4 | |
| Self-heating single vessel chamber | Living Systems Instrumentation (LSI) | CH-1 | |
| Servo Pump | Living Systems Instrumentation (LSI) | ModelPS-200-P | |
| Stainless steel blunt needle 23 gauge | Component Supply Co. | 04651-01 | |
| Stainless steel blunt needle 25 gauge | Component Supply Co. | 07116-01 | |
| STERILE Nylon Suture | AROSurgical Instruments Corporation | T04A00N07-13 | |
| Stopcock | Sedation Resource | 6-205-04 | |
| Temperature Controller | Living Systems Instrumentation (LSI) | Model TC-09S |
References
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