Summary
여기에 전 생체 모성 태아 혈관 관류의 프로토콜이 제시 되어 모계의 혈관 조직으로 시험 물품의 투여를 가능 하 게 하 고, xenobiotic 입자 또는 약리학 적 제제의 변경 이외에의 태 반 전달을 평가할 수 있도록 태 반 생리학.
Abstract
태 반은 임신 중 태아에 대 한 장벽 역할을 하 고 폐기물에 대 한 영양분 교환을 중재 하는 주요 기관입니다. 분석은 여기에 고립 된 쥐 태 반을 완료 하 고 생체 이물질 ex vivo의 모성 대 태아 전 좌를 평가 하기 위하여 여기에 기술 됩니다. 또한, 이러한 방법론을 통해 태아 및 태 반 대사에 대 한 유체 흐름과 같은 생리 적 과정의 평가가 진행 될 수 있다. 이 기법은 제약 후보 또는 환경 오염 물질의 모계-태아 동역학을 평가 하는 데 적합 합니다. 현재의 대안적 접근법과는 대조적으로,이 방법론은 분리 된 모계 태아 맥 관 구조의 평가를 가능 하 게 하 고, 전신 신경 또는 면역 침범을 제거 하 고, 생리 적 기능에서 관찰 된 변화를 허용 한다 격리 된 조직 내의 지역 요인에 기인 합니다.
Introduction
형태 학적 구조 및 생리 적 반응성을 유지 함으로써, 장기 관류는 수용 된 시스템-또는 신진 대사 기능을 분석 하기 위한 조직 기반 접근. 이러한 관류 기술은 다양 한 약리 및 기계적 자극에 대 한 온전한 조직 반응의 전 생체 내 검사를 허용 한다. 인간 태 반의 관류는 초기에 1958에서 설명 하였으며, 구 연산 사이클의 대사 활성에 대 한 호르몬 효과를 확인 하는 단계; 이전에 조직 균질 화에서 확인 된 데, Troen과 고 든은 새로운 생리 적 접근법을 사용 하 여 내 분 비 활동을 명확히 할 필요성을 인식1. 같은 시대에, 단일 관류 (모계에서 태아 또는 태아를 산 모) 전략을 큰2,3 및 작은4 동물 모델에 설명 했다 설탕의 태 반 이동, 염, 및 안티 피 린 약물. 생체 내 및 전 생체 이중 관류 (배위 된 모성 및 태아 관류) 기술 들은 생체 내5 및 전 생체 내6,8 방법론을 이용 하 여 태 반 전달을 특성화 하기 위해 기술 되었다. 트랜스 미션 및 주사 전자 현미경의 기술적 진보는 연구원 들이 관류 후 인간 태 반 조직의 구조적 및 기능적 완전성을 검증할 수 있게 했습니다.
인간 태 반 조직과 개인 자 엽의 관류가 가장 관련성이 있지만, 약리학 적 제제 및 환경 오염 물질의 급속 한 발달은 제 노 생체의 조기 스크리닝을 위한 동물 관류 모델의 사용을 필요로 한다 태 반 장벽을 가로질러 이동 합니다. 이 태 반 관류 방법은 더 쉽게 달성 하 고 생리학적으로 관련 된 쥐 태 반을 사용 하 여 태 반 장벽에 걸쳐 전달의 평가를 허용 한다. 또한, 노출 후 일정 시간에 걸쳐 태 반 장벽을 가로지르는 유체 흐름은 배꼽 으로부터 유입 되는 관류 량의 부피를 측정 함으로써 평가 될 수 있다. 산 모의 및 태아 순환 둘 다에서 태 반 관류를 허용 하는 것에 의해,이 이중 유동 전체 기관 접근법은 현재 시험관 내 및 생체 내 접근법에 비해 유리할 수 있다. 이 방법은 산 모의 측면을 통해 서에 노 바이오 틱을 투여 하는 것은 배꼽 정 맥을 통해 태 반을 가로질러 나온다, 또는 그 반대의 경우에서 측정 될 수 있다. 여기에 제시 된 프로토콜은 모성 자 궁 동맥에서 태아 구획으로 20 nm 폴리스 티 렌 (식품 및 의료 제품에 사용 되는 일반적인 나노 플라스틱)의 전달을 설명 하기 위해 태 반을 가로질러 유체 흐름의 관련 감소를 기술 할 것 이다 임산부 및/또는 태아의 흐름에 영향을 미치는 태 반 전달, 신진 대사 및 생리 적 변형을 평가 하기 위해 여러 생리 적, 약리학 적 및 독성 학적 설정에서이 방법을 사용 합니다.
Protocol
모든 실험 절차는 럿 거 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인 되었다.
1. 실험 전 준비
참고: 이러한 단계는 실험 일/주 전에 수행 될 수 있습니다.
- 용기 챔버를 수정 합니다.
참고: 도 1a, B 는 변형 된 단일 용기 챔버를 나타낸다.- 서미스터 센서를 클립 아래에서 이동 하 고 관류 욕에 자유롭게 달려 있도록 굽 혀 냅니다 (그림 1b).
- 표준 루어 연결 허브, 1 25 g 및 1 23 g을 가진 2 개의 4 인치 무딘 팁 스테인리스 스틸 바늘을 서미스터 클립 아래에 설치 하 고 3 방향 스톱 콕을 추가 하 여 배꼽 구조를 조절 합니다 (그림 1b).
참고: 서로 다른 게이지 크기의 루어 연결은 색상으로 구분 됩니다. 이것은 실험 도중 및 후에 혈관의 쉬운 식별을 용이 하 게 합니다.
- 두 개의 70-100 µm 유리 마이크로 피 펫을 설치 합니다. 이러한 절차에 대 한 자세한 내용은 다음 참조10,11을 검토 하십시오.
참고:이 실험에서 일반적으로 사용 되는 팁 지름은 70-100 µm의 범위에 있습니다. 팁 직경이이 범위 보다 크면 칸 형성 공정에 어려움이 있을 수 있으며, 팁 직경이 60 µm 미만인 경우에는 혈관 벽에 구멍을 뚫을 수 있습니다. - 멸 균 된 나일론 봉합 사 (자 궁 동맥의 근 위 및 말단 말단 용)와 블랙 꼰 실크 비 멸 균 봉합 사 (탯 줄 용기)에서 넥타이를 준비 합니다. 앞에서 설명한 바와 같이, 정사각형 매듭을 시작 하거나 신발을 묶는 것 처럼 봉합을 반복 하여 단일 넥타이를 만드십시오.
참고: 단일 넥타이는 일반적으로 만든 하 고 스티커 배경 작업을 돕기 위해 실리콘 고무의 작은 층으로 채워진 페 트리 접시에 보관. - 2 L의 생리 식 염 용액 (PSS)을 준비 하 고, 129.8 염화 나트륨, 5.4 KCl, 0.5 na2po4, 0.83 mgso4, 19 나 코를포함 하는 1.8 cacl2및 5.5 포도 당. 용액에 산 (1m 염 산) 또는 염기 (1 N 수산화 나트륨)를 서서히 첨가 하 여 pH를 7.40 ± 0.02로 조정 하 고 조정 된 pH 측정을 읽기 전에 적어도 20 초를 기다리십시오. 냉장고에서 사용할 준비가 될 때까지 PSS를 보관 하 여 오염을 줄이고 2 주 이상 보관 하지 마십시오.
- 각 시점에서 "모성" 및 "태아" 폐수를 수집 하는 마이크로 원심 분리기 튜브, 즉 "MBaseline, M10, M20 ..." 최대 180 최소 타임 포인트. 태아 폐수 (FBaseline, M10, M20 등)에 대해 동일한 것을 준비 합니다.
- 자 궁을 유지 하는 것과 관련 된 순환 목욕 온도 및 혈압 모니터를 포함 하 여 시스템 내에서 사용 되는 모든 장비를 교정 (80 mmHg) 및 배꼽 (50 mmHg) 관류 압력.
- 실리콘 고무의 층 (< 0.25 ")을 충 진 하 여 해 부 챔버 (지름 x 1" 깊이) 또는 순환 히터 접시를 준비 합니다. 이 수정은 사전에 수행 해야 하며 고무 건조에 대 한 12-24 시간을 걸릴 것입니다.
참고: 순환 히터/냉각 접시를 사용 하는 것은 요리가 움직이지 않고 조직이 일정 한 온도를 유지 하므로 초보 외과 의사에 게 권장 됩니다.
2. 수술 역의 준비 및 장비의 평형 화
- 관류 시스템을 지 원하는 모든 장비를 켜서 적절 한 기능을 확인 합니다. PSS를 냉장에서 꺼내어 실 온으로 따뜻하게 합니다. PSS는 관류와 중첩으로 사용 됩니다.
- 작은 버블 링 스톤을 배치 하 여 가스 혼합물을 슈퍼 푸 게이트 저수지에 전달 합니다. 일반적으로 사용 되는 혼합물에는 21% o 2, 8% o2,3% 및 0% o2가 포함 됩니다. 가스를 켜서 작은 기포를 초 푸 레이트 용액에 공급 하십시오. 튀는 것을 방지 하기 위해 가스의 전달을 조정 합니다.
- 마 취를 확인 하 고, 수술 장비를 배치 하 고, 봉합 사 관계를 준비 하 여 동물 해 부 역을 준비 하십시오. 하 부 핀을 수집 하 고 냉각기 (또는 얼음을 검색)를 켜고 차가운 PSS로 하 부 챔버 (고무 실리콘으로 안 감)를 채워 색인 챔버를 준비 합니다.
- 따뜻한 PSS로 모든 챔버, 바늘, 유리 마이크로 피 펫, 튜빙 및 저수지를 조심 스럽게 채우고 미세한 팁 전달 파이 펫으로 흡입 하 여 기포를 신중 하 게 관찰 하 고 제거 하십시오. 파이 펫의 방향을 향하도록 "off"로 모든 3 방향 스톱 밸브를 돌려 파이 펫 내에서 유체를 고정 하십시오.
- 자 궁 칸을 위해 준비 된 두 개의 유리 마이크로 피 펫과 탯 줄을 위해 지정 된 두 개의 무딘 팁 바늘에 단일 넥타이를 놓습니다. 챔버 이동 중 손실을 방지 하기 위해 파이 펫 및 무딘 팁 바늘과의 관계를 확보 합니다 (그림 1c).
3. 태 반 수확
- 임신 한 여성 쥐에 게 5%의 아이 소 루 레인을 약 4 분 동안 또는 동물이 전시 된 호흡을 할 때까지 마 취 시켰다. 마 취를 유지 하기 위해 코 콘으로 동물을 이동 하 고 2.5%-3% 아이 소 루 레인을 관리 할 수 있습니다. 발가락 핀치 반사의 부족에 의해 무 의식 확인.
참고: 임신 일 20에서 쥐의 사용이이 프로토콜에 제시 되어있다. 그러나 실험 조건에서 태 반 평가가 임신 초기에 진행 되어야 하는 경우에는 동일 하 게 프로토콜을 유지 합니다. - 선택의 자 궁 경적을 확인 하 고 분리 (오른쪽 또는 왼쪽) 밖으로 해제 하 고 쥐 시체 밖으로 긴 방법을 확산. 꼰 실크 봉합 사를 사용 하 여, 난소 말단과 혼의 질 끝에서 자 궁 동맥을 묶어. 자 궁 경적으로 봉합 사의 난소 내부를 포함 시키십시오.
- 외과가 위를 사용 하 여 자 궁 경적을 양 끝에 있는 봉합 사와 함께 묶여 자 궁 경적을 남겨 두는 질 넥타이의 난소 넥타이와 말단 부의 근 위부 측에 인하를 만들기로, 떨어져 소비 합니다. 자 궁 경적을 실리콘 고무로 늘어선 하 부 접시로 옮겨 차가운 (4°c) PSS로 채웁니다. 오른쪽 또는 왼쪽 경적이 선택 되어 있는지 여부에 관계 없이 일관성을 위해 각 실험에서 동일한 쪽을 선택 하도록 유지 합니다.
참고: 태아 마 취를 위해, 새끼는 얼음 차가운 PSS에 보관 됩니다. 따라서 해 부 챔버 내의 PSS 온도는 냉각 된 순환 욕 또는 해 부 챔버에 의해 유지 되어 얼음에 보관 되어야 한다.
참고:이 시점에서 마 취 된 담는 실험실 IACUC 프로토콜 승인 당 안락사 될 수 있다. 이 경우 안락사는 기 흉 (다이어 프 램을 절단 하 여)과 모계 심장의 제거를 통해 발생 합니다. - 자 궁 경적을 통해 해 부 핀을 실리콘 고무로 부드럽게 밀고 난소 측을 왼쪽으로, 질 쪽을 오른쪽으로 밀어 자 궁 맥 관 구조를 시각화 합니다. 이것은 자 궁을 안정 시키고 태아 구획의 해 부 도중 조직의 움직임을 방지 합니다. 산 모-태 반 태아 단위를 선택 하 여 경적을 중심으로 하 고 자 궁 동맥과 정 맥을 외과가 위로 리 게이트 한다. 선택 된 태 반과 태아에 자 궁 근 근 위부 및 말단을 절단 한다. 자 궁 근육은 측면으로 당겨 후퇴 할 수 있습니다. 그것은 그대로 두고 하지만 태아 pup를 덮고에서 그것을 당겨 하는 것이 중요 하다.
참고: 임산부-태 반 태아 단위의 선택은 아치형 동맥의 양쪽에 있는 자 궁 동맥 세그먼트의 길이에 기초 해야 합니다. 더 긴 세그먼트는 더 성공적인 통조림을 허용 합니다. - 미세한 집게와가 위를 사용 하 여 태 반의 태아 표면에서 양수 막을 제거 하 고 탯 줄을 피하도록 주의 하십시오.
- 태아 강아지를 분리 하는 탯 줄을 해명 하 고 ligate.
- 탯 동맥 (두꺼운 용기)과 정 맥 (더 얇은 용기)을 확인 합니다. 탯 줄 보다 약간 짧게 절단 하 여 쉽게 식별할 수 있도록 배꼽 정 맥을 표시 합니다.
- 배꼽과 정 맥을 서로 부드럽게 분리 합니다.
- 자 궁 맥 관 구조, 자 궁 근육, 태 반 및 탯 줄을 포함 하는 전체 태 반을 절단 하 고 제거할 수 있다.
4. 태 반 관류
- 해부학 적 혈 류를 유지 하 여 자 궁 동맥의 말단-근 위부 배 향을 교정 하 고, 태 반 장치 (자 궁 맥 관, 자 궁 근육, 태 반과 탯 줄로 구성)를 개 질 된 단 리 된 용기 챔버로 채워 넣습니다 따뜻한, 산 소화 PSS와 함께.
- 한 쌍의 미세 집게를 사용 하 여 각 손에 자 궁 동맥의 근 위부 말단을 유리 마이크로 피 펫에 연결 합니다.
- 미리 멸 균 된 나일론 봉합 사 넥타이를 이용 하 여 자 궁 동맥을 단단하게 고정 시켜 마이크로 피 펫 상에 고정 시켰다.
참고: 2 타이 루프 (매듭)가 필요할 수 있습니다. 그러나 단일 tie 루프가 더 큰 조정이 가능 합니다. - 대 바늘 23g(큰) 니 들 위에 배꼽 동맥 (태아와 산 모의 혈 류)을 통조림으로 만들고 검은 땋은 실크 봉합 사로 고정 시킵니다.
- 배꼽 정 맥 (임산부와 태아의 혈 류)을 25g의 무딘 바늘에 대 고, 검은 색 꼰 실크 봉합으로 고정 합니다.
- 태 반 관류 역으로 이동 하 고 기포를 방지 하기 위해 모든 저지대와 호스를 백필. 그림 2에 따라 모든 호스를 연결 합니다.
- 산 모의 자 궁 동맥의 말단 칸에 작은 계량 보트를 배치 하 고 절차 중에 출현 하는 유출 물을 잡기 위해 태아 탯 줄의 바늘 칸을 넣습니다.
- 연동 펌프, 압력 컨트롤러 및 압력 모니터를 켜고 압력 트랜스듀서를 향해 튜브를 통과 하는 유체 흐름을 허용 하기 위해 모양을 열고, 하지만 아직 태 반에. 압력을 천천히 80 mm Hg로 늘립니다.
- 천천히 개방 하 고 챔버 내부와 넥타이 주위에 누출을 보고 태 반에 모양을 돌립니다.
참고: 연동 펌프가 고속으로 실행 되는 경우, 유체 누출에 대 한 근 위 자 궁 칸과 타이를 재평가 하십시오. 식별 된 경우 누출을 해결 해야 합니다. 또한 평균 자 궁 동맥 압력이 일정 하 게 유지 되지만 (80 mmHg로 설정), 유체 유 속은 혈관 및 태 반 생리 적 반응에 따라 가변적 일 수 있다. 유체 흐름의 정량화는 xenobiotic 노출에 반응 하 여 실험적 변수로 서 식별 될 수 있다. - 배꼽으로의 유체 흐름을 허용 하기 위해 모양을 돌립니다. 압력을 약 50 mmHg로 설정 하 여 연동 펌프 (그림 3) 또는 정 압 칼럼으로 구현할 수 있습니다.
- 모든 저장소 (자 궁, 배꼽 및 초 푸 레이트)를 리필 하 여 실험 전체에 걸쳐 체액 부피를 유지 합니다.
참고: 관류가 시작 되 고 실험이 진행 되 고 나면, 해 부 접시에 남아 있는 마 취 된 새끼는 신경학 적 반응을 유도 하기 위해 핀셋으로 새끼를 만져 생존 가능성을 평가할 수 있습니다. 새끼의 exsan구타는 자 궁 경적의 자 군 절제술을 통해 발생 합니다; 추가적으로 안락사는 승인 된 IACUC 프로토콜을 통해 완료 될 수 있습니다. 이 경우, 콜드 PSS에서 양 낭을 열고 갈비뼈를 절단 하 여 기 흉을 만듭니다.
5. 모의 실험
- PSS 관류의 통조림 및 개시 후, 조직이 새로운 유체 흐름에 적응할 수 있도록 30 분 동안 조직을 평형 화 시켜 준다. 피 펫에의 한 유출 수를 흡입 하 고 그에 상응 하는 라벨링 된 마이크로 원심 분리기 튜브에 저장 합니다.
- 평형 화 후, 마이크로 원심 분리기 튜브에 있는 양 계량 보트에서 10 분 동안 폐수를 수집 하 여 기준선 관류를 확립 하 고 자 궁 동맥 및 배꼽 정 맥을 통해 나오는 유체의 부피를 측정 합니다.
- 말단 자 궁 동맥 및 배꼽 정 맥 으로부터 폐수를 수집 하 여 10 분 간격으로 시료 채취를 시작 합니다. 예를 들어, 900 µ L 볼 루스로 다 민 표지 된 폴리스 티 렌 나노 입자 (8×1014 입자 /m l)를 투여 한 라인 관류에 0.01% 계면 활성 제에 부유 하 여 자 궁 동맥을 사용 하 여 엑 시 바이오 틱의 시간 경과 과정을 규명 한다. 태 반 장벽을 가로질러 나노 입자.
참고:이 배출물 샘플은 유체 내 오염 물질 (xenobiotic, 약리학 적 또는 대사 산물 중 하나)을 측정 하 고 자 궁 동맥을 통해 또는 태 반을 가로질러 그리고 태아 구획으로 유체 흐름의 속도를 제공 할 것입니다 ( 그림 4). - 볼 루스 주입 후, 주입 후 총 180 분 동안 말단 자 궁 동맥 및 태아 탯 줄 정 맥 으로부터 10 분 마다 샘플을 수집 한다.
6. 장비 청소
- 각 실험 후, 파이 펫에서 태 반 유닛을 제거 하십시오. 모든 봉합은 향후 실험에서 재사용 될 수 있습니다. 태 반 조직은 추가 조직학 또는 기계 론 적 연구를 위해 저장 될 수 있다.
- 70% 에탄올과 증류수 및 진공 건조로 관류 시스템의 모든 호스 링 및 캐 뉼 라스를 청소 하십시오.
참고: 튜빙 또는 파이 펫이 변색 되거나 손상 된 것으로 나타나기 시작 하면 다음 실험 전에 교체 하십시오. 또한 실험 코 호트가 완료 된 후 (예: 단일 오염 물질에 관한 모든 연구) 교차 오염을 방지 하기 위해 챔버 내의 모든 호스를 교체 합니다.
Representative Results
그림 5 는 우리에 게 시스템을 테스트 하 고 적절 한 유체 및 태 반 장벽 기능을 시각화 하 고 태아 구획에 포함을 방지 하기 위해 우리를 허용,에 반의 청색 염료를 사용 하 여 원리 증명 실험을 보여줍니다. 에 반의 청색 염료에 도달 하 고이 시스템 내에서 태 반 조직을 사용 하였다 (도 5a). 추가 조사에의 하면,에 반 청색 염료가 태아의 배꼽 정 맥 (도 5b)에 들어가지 않는 것이 분명 하 고,이는에 반 청색 염료가 알 부 민에 결합 되는 것으로 예상 된다.
그림 6 은이 프로토콜에 설명 된 모의 실험에 대 한 데이터를 보여줍니다. 유출 샘플은 자 궁 동맥 및 태아 탯 줄의 말단 부에서 볼 루스 투여 후 시간 경과에 따른 유체 흐름을 평가 하기 위해 각 10 분의 분절에서 산 모의 자궁내 동맥에 투여 하였다 (도 6). 폴리스 티 렌 주입이 확인 된 후 10 분 이내에 태아 구획으로의 체액 전달을 감소 시켰다. 시간 과정 동안에 폴리스 티 렌을 태아 격실에 양도 하는 것을 정량화 하기 위해, 96 웰 플레이트에 각 시점 으로부터의 관류 액의 25 µ L을 복제 하 여 샘플 형광을 측정 하였다. 형광은 형광 마이크로 플레이트 판독기를 사용 하 여 546/575 nm (ex/em)에서 분 광학적 판독에 의해 결정 되었다. 태아 구획에 폴리스 티 렌 전달은 10 분 이내에 발생 하 고 20 분 동안 뾰 족 하 고 90 분 동안 계속 되었다 (도 6b).
관류 된 태 반 조직의 서브셋은 조직 병리학 및 형태학 적 평가를 위해 저장 되었습니다. 상기 조직은 포 르 말린-고정 및 헤 마 톡 실린 및에 오신을 염색 하 고 보드 공인 수의학 병리학 자에 의해 검토 하였다. 이러한 전문가 들은 구조적 이상이 없는 것으로 확인 했습니다 .로 다 민 라벨이 부착 된 폴리스 티 렌의 볼 루스 용량으로 PSS 또는 PSS에 의해서만 사용 됩니다.
도 1: 개 질 된 단일 용기 챔버. (A) 수정 된 챔버의 개요. (B) 상기 용기 챔버 내에 고정 된 무딘 팁 바늘의 클로즈업 이미지. 적색 화살표는 탯 줄을 위해 바늘을 제자리에 고정 시키기 위해 변경 된 서미스터 클립을 나타냅니다. (C) 조직 통조림을 위해 제조 된 4 개의 캐 뉼 라스의 대표적인 이미지 이다. 빨간색 화살표는 4 개의 캐 뉼 라스 각각을 가리킵니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
도 2: 태 반 관류 챔버의 면밀 한 시야. (A)이는 압력 트랜스듀서에 부착 된 튜빙을 나타내고 근 위 모성 자 궁 동맥 또는 "유입"을 표로 작성 한다. 압력은 문헌에 의해 정의 된 바와 같이 일정 한 80 mmHg로 설정 된다. (B) 이것은 관류 동안 태 반 조직을 둘러싼 초 푸 레이트의 챔버 드레인 포트를 나타낸다. (C)이는 관류 중에 데워 진 PSS로 태 반을 목욕 시키기 위한 초 푸 레이트의 챔버 유입을 나타낸다. (D) 이것은 자 궁 관류 로부터의 배출물 들이 수집 될 수 있는 말단 모성 자 궁 포트를 나타낸다. (E) 이것은 실험 전반에 걸쳐 일정 한 온도를 유지 하기 위해 용기 챔버가 온도계 및 히터에 부착 될 수 있는 온도 포트를 나타낸다. (F) 이것은 대 동맥 칸 형성을 나타낸다. 배꼽 동맥은 50 mmHg에 가압 되어 태 반의 수준에서 역류 흐름을 허용 합니다. (G) 이것은 배꼽 정 맥 유출 물 수집을 나타낸다. 관류 중 태아 구획을 향해 흐르는 유체는 여기에서 수집 됩니다. (H) 이것은 관류 시스템의 중심 이며, 여기서 태 반은 관류에 걸쳐 보존 되 고 유지 된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
도 3: 태 반 관류 시스템의 도면. (A 와 B) 자 궁 동맥을 통해 관류의 80 mmHg를 모니터링 하 고 유지 하기 위해 사용 되는 압력 제어 시스템. (C)이는 관류 챔버의 열 조절을 나타낸다. (D) 현미경. (E) 관류 챔버. (F) 50 mmHg에서 중력 사육 배꼽 관류 세트. (G) 태 반 초전도 PSS를 채우고 배수 하는 데 사용 되는 연동 펌프. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
도 4: 태 반 관류 시스템의 개략. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5:에 반 파랑 염료를 사용한 원리 증명 실험의 대표 이미지. (A 와 B)에 반의 청색이 자 궁 맥 관 구조, 자 궁 근육 및 태 반을 사용 하지만 알 부 민 결합으로 인 한 태 반 장벽을 교차 하지 않는다는 것을 증명 하는 원리. 녹색 화살표는 태 반에서 산 모의 순환으로 다시 블루 정 맥 배수를 나타냅니다. 적색 화살표는 탯 줄 정 맥 배출물을 태아 구획 쪽으로 가리킨다. 청색 염료의 부족을 유의 하십시오. (C) 배꼽 정 맥 으로부터 배수 되는 배출물 들을 수집 하는 대표적인 이미지. 빨간색 화살표는 수집 전에 낙하 형성을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6: 모의 실험에서 파생 된 데이터입니다. 로 다 민 라벨 폴리스 티 렌 나노 물질의 형광 측정은 (A) 자 궁 동맥 및 (B) 태아 배꼽 정 맥의 수집을 통해 기준선 형광으로 정상화 된다. 기준 형광 ± 표준 오차 (SE)로 정규화 된 것을 의미 한다. 분산 분석 (ANOVA)을 통해 p < 0.05 및 T: p < 0.1 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Discussion
이러한 관류 법은 자 궁 혈관 구조 및 트로 포 블 라스트 층의 태 반 장벽 및 생리 적 기능에 대 한 신속한 평가를 가능 하 게 한다. 모계 자 궁 동맥의 원 위부 말단에 근 위를 관류 하는 것은 태아에 혈액을 보내는 것을 담당 하는이 주요 혈관을 통해 모계 혈액 흐름의 생리학을 시뮬레이션 한다. 이 방법론은 고립 된 모성, 태 반 및 배꼽 조직에 대 한 생리 적 평가를 허용 하며, 따라서 생리학의 변화는 혈관 병리학으로 확인 될 수 있습니다. 면역 및 신경 자극은 전 생체 절차에서 제거 됩니다. 따라서 적절 한 평가를 위해 용기 벽에 눈물 이나 구멍을 뚫 지 않고 기포를 제거 하지 않도록이 용기를 조심 스럽게 분리 하는 것이 중요 합니다. 가스 색 전 혈관의 내 피 층에 손상을 일으킬 수 있습니다. 해 부 동안 자 궁, 태 반 및 태아 사이의 혈관 연결을 유지 함으로써, 태아에 대 한 유체 및 트랜스 로케이션의 평가가 관찰 될 수 있다. Xenobiotic의 투여와 함께,이 경우 20 nm 폴리스 티 렌, 자 궁 동맥의 말단 부 및 태 반을 통해 태아 구획에 대 한 반응 속도는 180 분의 시간 과정에 걸쳐 폐수의 분석에 의해 평가 될 수 있다.
이중 관류 모델을 설명 하 고이 문서에서 산 모의 입자와 체액을 태아 구획으로 이송 하는 동안, 평가는 또한 태아에서 산 모 구획으로 역으로 이루어질 수 있다. 여기에서 설명 되는 방법의 한 가지 제한은 말단 자 궁 정 맥이 통조림 또는 샘플링 되지 않은 것 이다. 향후 연구에서, 특히 태아와 모계 간의 전이에 초점을 맞춘, 말단 자 궁 혈관을 통조림 화 하 고 샘플링 하는 것이 중요할 것 이다. 이 모의 실험에서 취해진 폐수는 엑 시 놀 틱 전달을 평가 하는데 사용 되었다; 그러나 내 분 비 및 분자 태 반 기능 또는 태아 영양과 관련 된 다양 한 평가가 수행 될 수 있습니다.
이 프로토콜의 강점은 사소한 제한 보다 훨씬 큽니다. 준비는 실험 조건을 평가 하기 위하여 전체 기관의 생리 적인 구조 그리고 완전성을 유지 합니다. Ex vivo 태 반 관류는 생식 위험 평가를 제대로 결정 하기 위해 세포 기반 시험관 내에서 전체 동물 노출로의 과학적 진행입니다. 이것은 태 반 약리학 적 약물 처분, 약 동학, 독성 학, 생리학 및 모성 태아 의학을 평가 하는 연구를 위한 귀중 한 기술로 간주 될 수 있습니다.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 국립 환경 보건 과학 연구소 (R00-ES024783), 럿 거 스 센터 환경 노출과 질병 (P30 ES005022), 트 러 거 스 공동 대학원 독성 학 프로그램 (T32)에 의해 지원 되었다. 우리는 또한 마이클 고 드 켄, 마리 안 Polunas, 페드로 루로가 기술 전문성을 보유 하 고 있으며, 아담 박사는 관류 회로도 설계에 대 한 호의를 베 고 싶습니다 (그림 5).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Black braided silk non-absorbable surgical suture non-sterile | Surgical Specialties Look | AACO805 | |
| Fine forceps | FST by Dumont Switzerland | 11252-20 | |
| Fine scissors | FST by Dumont Switzerland | 14060-10 | |
| Glass cannula pack | Living Systems Instrumentation (LSI) | GCP-75-100 | |
| Microcentrifuge Tubes 2.0mL polypropylene graduated tube with locking lid MIXED | Fisherbrand | 02-681-299 | |
| Non-serrated fine curved micro serrefine clamps | InterFocus | 18052-03 | |
| Perfusate pump | ISMATEC | ISM795C | |
| Pressure monitor | Living Systems Instrumentation (LSI) | Mode PM-4 | |
| Self-heating single vessel chamber | Living Systems Instrumentation (LSI) | CH-1 | |
| Servo Pump | Living Systems Instrumentation (LSI) | ModelPS-200-P | |
| Stainless steel blunt needle 23 gauge | Component Supply Co. | 04651-01 | |
| Stainless steel blunt needle 25 gauge | Component Supply Co. | 07116-01 | |
| STERILE Nylon Suture | AROSurgical Instruments Corporation | T04A00N07-13 | |
| Stopcock | Sedation Resource | 6-205-04 | |
| Temperature Controller | Living Systems Instrumentation (LSI) | Model TC-09S |
References
- Troen, P., Gordon, E. E. Perfusion studies of the human placenta. I. Effect of estradiol and human chorionic gonadotropin on citric acid metabolism. Journal of Clinical Investigation. 37, 1516-1523 (1958).
- Alexander, D. P., Huggett, A. S., Nixon, D. A., Widdas, W. F. The placental transfer of sugars in the sheep: the influence of concentration gradient upon the rates of hexose formation as shown in umbilical perfusion of the placenta. Journal of Physiology. 129, 367-383 (1955).
- Alexander, D. P., Andrews, R. D., Huggett, A. S., Nixon, D. A., Widdas, W. F. The placental transfer of sugars in the sheep: studies with radioactive sugar. Journal of Physiology. 129, 352-366 (1955).
- Dancis, J., Money, W. L. Transfer of sodium and iodo-antipyrine across guinea pig placenta with an in situ perfusion technique. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 80, 215-220 (1960).
- London, W. T., Money, W. L., Rawson, R. W. Placental Transport of I-131-Labeled Thyroxine and Triiodothyronine in the Guinea Pig. Endocrinology. 73, 205-209 (1963).
- Stulc, J., Stulcova, B., Svihovec, J. Transport of calcium across the dually perfused placenta of the rat. Journal of Physiology. 420, 295-311 (1990).
- Goeden, N., Bonnin, A. Ex vivo perfusion of mid-to-late-gestation mouse placenta for maternal-fetal interaction studies during pregnancy. Nature Protocols. 8, 66-74 (2013).
- Bond, H., et al. Artificial perfusion of the fetal circulation of the in situ mouse placenta: methodology and validation. Placenta. 27, Suppl A, S69-75 (2006).
- Illsley, N. P., Fox, H., Van der Veen, F., Chawner, L., Penfold, P. Human placental ultrastructure after in vitro dual perfusion. Placenta. 6, 23-32 (1985).
- Davis, M. J., Kuo, L., Chilian, W. M., Muller, J. M. Isolated, Perfused Microvessels. Clinically Applied Microcirculation Research. Barker, J. H., Anderson, G. L., Menger, M. D. , 1 ed, CRC Press. Boca Raton. 435-456 (1995).
- Butcher, J. T., Goodwill, A. G., Frisbee, J. C. The ex vivo isolated skeletal microvessel preparation for investigation of vascular reactivity. Journal of Visualized Experiments. (62), 3674 (2012).
