Summary
Burada, bir test makalesinin maternal damar içine uygulanmasını sağlamak ve ksenobiyotik partiküllerin veya farmakolojik ajanların plasental aktarımını değerlendirmek için ex vivo maternal-fetal vasküler perfüzyon Protokolü sunulmuştur. Plasental Fizyoloji.
Abstract
Plasenta fetal ksenobiyotik pozlama için bir engel olarak hizmet veren ve atık için besin değişimi aracılık hamilelik sırasında anahtar bir organdır. Bir tahlil burada izole sıçan plasenta perfkullanmak ve Ksenobiyotiklerin ex vivo maternal-to-fetal translokasyon değerlendirmek için açıklanmıştır. Buna ek olarak, fetus ve plasental metabolizması için sıvı akışı gibi fizyolojik süreçlerin değerlendirilmesi Bu metodoloji ile yapılabilir. Bu teknik, ilaç adaylarının veya çevresel kirleticilerin maternal-fetal kinetiği değerlendirmek için uygundur. Bu metodoloji, mevcut alternatif yaklaşımların aksine, sistemik nöral veya bağışıklık tutulumu ile izole maternal-fetal damar sisteminin değerlendirilmesine izin verir ve fizyolojik işlevde gözlenen değişikliklerin izole doku içinde yerel etkenlere attenable.
Introduction
Morfolojik yapısı ve fizyolojik tepkisini koruyarak, organ perfüzyon metabolik fonksiyon analizi için kabul edilen bir sistem veya doku tabanlı bir yaklaşım olmuştur. Bu perfüzyon teknikleri, çeşitli farmakolojik ve mekanik uyaranlara ait bozulmamış doku yanıtlarının ex vivo incelemesine izin verir. İnsan plasenta perfüzyon başlangıçta açıklanan 1958 sitrik asit döngüsünün metabolik aktivite üzerinde hormonal etkileri tanımlamak için; daha önce doku homojenlerde tanımlanmıştı, Troen ve Gordon yeni bir fizyolojik yaklaşım kullanarak endokrin etkinliğini açıklığa kavuşturmak için ihtiyaç kabul1. Aynı dönemde, şeker, tuzlar ve antipyrin ilaçların plasental aktarımını anlamak için büyük2,3 ve küçük4 hayvan modellerinde tek perfüzyon (maternal-to-fetal veya fetal-maternal) stratejileri tanımlanmıştır. In vivo ve ex vivo Dual-perfüzyon (koordineli maternal ve fetal perfüzyon) teknikleri, In vivo5 ve ex vivo6,7,8 metodolojileri kullanarak plasental transferini daha fazla karakterize etmek için tanımlanmıştır. Şanzıman ve Tarama elektron Mikroskopisinde teknolojik gelişmeler, araştırmacılar perfüzyon9' dan sonra insan plasental dokularının yapısal ve fonksiyonel bütünlüğünü doğrulamasına izin verdi.
İnsan plasental dokuları ve bireysel kotiledon perfüzyon en alakalı olmakla beraber, farmakolojik ajanlar ve çevresel kirleticilerin hızlı gelişimi ksenobiyotik erken tarama için bir hayvan perfüzyon modelinin kullanımını gerektirir Plasental bariyer üzerinden transfer. Bu plasental perfüzyon yöntemi, daha kolay ulaşılabilir ve fizyolojik olarak ilgili sıçan plasenta kullanarak plasental bariyer boyunca transferin değerlendirilmesi için izin verir. Buna ek olarak, bir pozlama sonra bir süre içinde plasental bariyer boyunca sıvı akışı göbek arter gelen perfüzat hacmi ölçerek değerlendirilebilir. Hem maternal hem de fetal sirkülasyonlardan plasental perfüzyon sağlayarak, bu çift akışlı tüm organ yaklaşımı, mevcut in vitro ve in vivo yaklaşımlara kıyasla avantajlı olabilir. Bu yöntem, maternal yönü ile bir ksenobiyotik yönetimi, plasenta boyunca göbek ven üzerinden ortaya çıkan perfuzatta ölçülmesi veya tersi sağlar. Burada sunulan protokol, maternal uterin arter fetal bölmesine 20 Nm Polistiren (Gıda ve tıbbi ürünlerde kullanılan ortak bir nanoplastik) ve plasenta boyunca sıvı akışında ilişkili bir azalma göstermek için aktarımını açıklayacaktır Bu yöntemin, maternal ve/veya fetal akışı etkileyen plasental aktarımı, metabolizmayı ve fizyolojik değişimleri değerlendirmek için birden fazla fizyolojik, farmakolojik ve toksikoloji ayarlarında kullanımı.
Protocol
Tüm deneysel prosedürler Rutgers Üniversitesi Kurumsal hayvan bakımı ve kullanım Komitesi tarafından onaylanmıştır.
1. deneyden önce hazırlık
Not: Bu adımlar, deneyden önce gün/hafta içinde gerçekleştirilebilir.
- Gemi odasını değiştirin.
Not: Şekil 1a, B değiştirilmiş tek gemi odasını gösterir.- Termistör sensörünü klibin altından taşıyın ve perfüzyon banyosunun içinde serbestçe asılı şekilde bükün (Şekil 1B).
- Standart Luer bağlantı hub 'ları ile iki 4-inç künt ucu paslanmaz çelik iğneler yükleyin, 1 25 g ve 1 23 g termistör klip altında güvenli ve göbek damar kanülasyon için izin vermek için 3-yönlü stopkoku ekleyin (Şekil 1B).
Not: farklı ölçer boyutlarının Luer bağlantıları renk kodlu. Bu, deney sırasında ve sonrasında gemilerin kolay tanımlanması kolaylaştırır.
- İki adet 70 − 100 μm cam mikropipet takın. Bu prosedürler hakkında daha fazla bilgi için lütfen aşağıdaki referansları10,11' i inceleyin.
Not: Bu deneylerde yaygın olarak kullanılan uç çapı 70 − 100 μm arasındadır. bu aralıktan daha büyük olan uç çapları kanülasyon sürecine zorluk katabilir, 60 μm ' den küçük uç çapları kanülasyon sırasında vasküler duvarı delebilir. - Steril naylon sütür (uterin arter proksimal ve distal uçları için) ve siyah örgülü ipek olmayan steril sütür (göbek damarlarında) ile bağları hazırlayın. Daha önce11açıklandığı gibi, bir kare düğüm başlatmak veya bir ayakkabı kravat olarak sütür döngü tarafından tek bağları olun.
Not: tek bağları yaygın olarak yapılır ve yapışkan bir arka plan üzerinde çalışmaya yardımcı olmak için silikon kauçuk küçük bir tabaka ile dolu bir petri çanak tutulur. - Hazırlamak 2 L fizyolojik tuz çözeltisi (PSS) içeren, içinde mmol/L, 129,8 NaCl, 5,4 KCl, 0,5 NaH2Po4, 0,83 MgSO4, 19 NaHCO3, 1,8 CAcl2, ve 5,5 glikoz. Solüsyona birkaç damla asit (1 M hidroklorik asit) veya baz (1 N sodyum hidroksit) ekleyerek pH 'yi 7,40 ± 0,02 olarak ayarlayın ve ayarlanan pH ölçümünü okumadan önce en az 20 s bekleyin. PSS 'nin soğutucunda kullanım için hazır olana kadar kirayı azaltmasını ancak 2 haftadan fazla süre saklamayın.
- Her zaman noktasında "maternal" ve "fetal" atıkları toplamak için mikro santrifüj tüpler, yani, "mbaseline, M10, M20,..." 180 dk timepoint kadar. Fetal atıkları için aynı hazırlamak (fbaseline, M10, M20,....).
- Sistem içinde kullanılan tüm donanımları kalibrasyon, dolaşım banyo sıcaklığı ve kan basıncı monitörler uterin (80 mmHg) ve göbek (50 mmHg) perfuzatta basıncını korumak ile ilişkili dahil.
- Silikon kauçuk bir tabaka (< 0,25 ") doldurarak bir diseksiyon odası (4" çapı x 1 "derin) veya sirkülasyon ısıtıcı çanak hazırlayın. Bu değişikliğin önceden yapılması ve kauçukun kuruması için 12 − 24 h alacak olması gerekir.
Not: bir sirkülasyon ısıtıcı kullanımı/soğutma çanak acemi cerrahlar için tavsiye edilir, çanak hareket etmez ve doku tutarlı bir sıcaklık koruyacaktır gibi.
2. cerrahi istasyon ve ekipmanların dengelilme hazırlığı
- Perfüzyon sistemini destekleyen tüm donanımları doğru işlevi kontrol etmek için açın. PSS soğutucuyu ve sıcak oda sıcaklığına kadar çıkarın. PSS, hem perfuzatta hem de superfusate olarak kullanılacaktır.
- Superfusate rezervuar içine bir gaz karışımı sunmak için küçük bir köpürme taşı yerleştirin. Yaygın olarak kullanılan karışımları içerir 21% O2, 8% o2, 3% o2, ve 0% o2. Süperfusate çözüme küçük kabarcıklar sağlamak için gaz açın. Sıçramasını önlemek için gaz teslimatını ayarlayın.
- Anestezi kontrol ederek, cerrahi ekipman düzenlenmesi ve dikiş bağları hazırlamak hayvan diseksiyon İstasyonu düzenleyin. Diseksiyon pimlerini toplayarak, Soğutucun (veya buzu alma) açılması ve diseksiyon odasını (kauçuk silikon ile astarlı) soğuk PSS ile doldurarak, diseksiyon odasını hazırlayın.
- Tüm odaları, iğneler, cam mikropipetleri, boruları ve rezervuarları ısınmış PSS ile hafifçe doldurun, ince uç transfer pipetiyle onları ısıtarak hava kabarcıklarını dikkatle izleyerek ve ortadan kaldırır. Pipet içindeki sıvıyı sabitlemek için tüm 3-yönlü stopmusluklar "kapalı" ile pipet yönüne bakacak şekilde çevirin.
- Rahim kanülasyon için hazırlanan iki cam mikro pipetlerin her birinde tek bir kravat yerleştirin ve göbek kanülasyonu için belirlenmiş iki künt uçlu iğne üzerinde. Oda hareketleri sırasında kaybı önlemek için Pipetler ve künt uçlu iğneler ile bağları koruyun (Şekil 1C).
3. plasental hasat
- Gestasyonel gün 20 hamile bir kadın sıçan anestezize% 5 ile yaklaşık 4 dk veya hayvan sergileyen nefes ağrı kadar Isoflurane. Hayvanı burun konisine taşıyın ve anestezi sağlamak için% 2,5 −% 3 isofluran yönetin. Ayak tutam refleks eksikliği ile bilinçsizlik onaylayın.
Not: Gestasyonel gün 20 bir sıçan kullanımı Bu protokolde sunulmaktadır. Ancak, deneysel koşullar, daha önce gebelik sırasında yer almak için plasental değerlendirme gerektiriyorsa, protokol aynı kalır. - Belirlemek ve kaldırmak ve sıçan karkas dışında uzun yollar dışarı yaymak ile tercih rahim boynuz (sağ veya sol) izole. Bir örgülü ipek sütür kullanarak, yumurtalıklı ucunda rahim arter ve boynuz vajinal ucunda kravat. Uterin boynuz ile sütür içinde yumurtlama dahil.
- Cerrahi makas kullanarak, yumurtlama kravat ve distal tarafındaki vajinal kravat proksimal tarafında kesikler yaparak uterus boynuz uzaklaştırın, uterus boynuz her iki ucunda sütürler ile bağlı bırakarak. Uterus boynuz silikon kauçuk ile kaplı ve soğuk (4 °C) PSS ile doldurulmuş diseksiyon çanak içine aktarın. Ne olursa olsun sağ veya sol boynuz seçilir, tutarlılık için her denemede seçim için aynı tarafı korumak.
Not: fetal anestezi Için, PUPs, buzdan soğuk PSS 'de tutulur. Bu nedenle, diseksiyon odası içinde PSS sıcaklığı soğutulmuş dolaşım banyosu veya diseksiyon odası tarafından korunur buz üzerinde tutulmalıdır.
Not: Bu noktada anestezize baraj laboratuvar ıABUC protokol onayı başına ötenize olabilir. Bu durumda, ötenazi pnömotoraks yoluyla oluşur (diyaframı keserek) ve maternal kalbin çıkarılması. - Yavaşça, uterus korna ile silikon kauçuk içine bir diseksiyon pin itmek, yumurtlama tarafı sol ve vajinal tarafı için sağ uterin damar görselleştirmek için. Bu uterusun stabilizasyonu ve fetal bölmesinin diseksiyonu sırasında dokusunun hareketini önlemektir. Bir maternal-plasenta-fetal ünite boynuz merkezi seçin ve rahim arter ve damar cerrahi makas ile indirgeme uzman. Seçilmiş plasenta ve fetus için proksimal ve distal uterus kasını kes. Uterin kası yan çekerek geri çekilebilir; Onu bozulmamış bırakmak önemlidir ama fetal yavru kapsayan uzak çekin.
Not: maternal-plasenta-fetal ünitenin seçilmesi, arcuat arter her iki tarafında uterin arter segmenti uzunluğuna dayalı olmalıdır. Daha uzun segmentler daha başarılı kanülasyon izin verecektir. - İnce forseps ve makas kullanarak, plasenta fetal yüzeyinden amonoz membranı çıkarın, göbek kordonunu önlemek için özen.
- Fetal yavrusu ayırmak için göbek kordonu çözün ve indirgeme uzman.
- Göbek arter (kalın damar) ve ven (ince damar) tanımlayın. Göbek damarından biraz daha kısa keserek kolay tanımlama için göbek ven işaretle.
- Göbek arter ve ven yavaşça birbirinden ayırın.
- Uterus damar, uterus kası, plasenta ve göbek kordonu dahil olmak üzere tüm plasental ünite kesilebilir ve kaldırılabilir.
4. placental perfüzyon
- Uterus arter doğru distal-to-proksimal yönünü koruyarak anatomik kan akışını koruyun, plasental üniteyi (uterus damar, uterus kası, plasenta ve göbek kordondan oluşan) değiştirilmiş izole damar odasına dolduran sıcak, oksijenli PSS ile.
- Her elinde bir çift ince forseps kullanarak, uterin arter proksimal ve distal uçları cam Micropipettes üzerine cannulate.
- Daha önce mikropipet üzerine korunan steril naylon dikiş kravatı kullanarak uterin arter sıkıca güvenli.
Not: Iki kravat döngüler (düğüm) gerekli olabilir; Ancak, tek bir kravat döngüsü daha fazla ayarlama sağlar. - Göbek arter cannulate (fetal--maternal kan akışı) üzerine 23 G (daha büyük) iğne ve siyah örgülü ipek sütür ile güvenli.
- Göbek ven (maternal-fetal kan akımı) 25 G (küçük) künt iğne üzerine cannulate ve siyah örgülü ipek sütür ile güvenli.
- Plasental perfüzyon istasyonuna gidin ve hava kabarcıkları önlemek için tüm Kesme muslukları ve tübings geri doldurun. Tüm tüpleri Şekil 2' ye göre bağlayın.
- Maternal uterus arter distal kanülasyon altında küçük tartım tekneleri ve prosedür sırasında ortaya çıkacak atık yakalamak için fetal göbek ven iğne kanülasyon yerleştirin.
- Peristaltik pompa, basınç kontrolörü ve basınç monitörü açın ve basınç dönüştürücünün doğru boru üzerinden sıvı akışına izin vermek için stopkoku açın, ama henüz plasenta için. Yavaşça 80 mm Hg basınç artırın.
- Yavaşça açmak ve oda içinde ve bağları etrafında sızıntıları izlemek için plasenta için stopkoku çevirin.
Not: peristaltik pompa yüksek hızda çalışıyorsa, proksimal uterin kanülasyon ve sıvı sızıntıları için bağları yeniden değerlendirmek. Tanımlanırsa, sızıntılar düzeltilmelidir. Ayrıca dikkat, ortalama rahim arter basıncı sabit kalacaktır iken (80 mmHg olarak ayarlanmış), sıvı akış oranı vasküler ve plasental fizyolojik tepkiler bağlı olarak değişken olabilir. Sıvı akışının ölçülmesini ksenobiyotik maruz kalma yanıt olarak deneysel bir değişken olarak tespit edilebilir. - Göbek arter içine sıvı akışına izin stopkoku çevirin. Basınç ayarlamak yaklaşık 50 mmHg, hangi bir peristaltik pompa ile uygulanabilir (Şekil 3) veya hidrostatik sütun.
- Deney boyunca sıvı hacmini korumak için tüm rezervuar (uterus, göbek ve superfusate) doldurun.
Not: perfüzyon başlatıldı ve deney devam ederken, diseksiyon çanak kalan anestezize pups nörolojik yanıt almak için forseps ile pups dokunarak cansızlık için değerlendirilebilir. Pups Exsanguination uterus boynuz histerektomi yoluyla ortaya çıkar; daha fazla ötenazi onaylanmış ıASUC protokolleri ile tamamlanabilir. Bu durumda, soğuk PSS 'de amonoz kesesinin açılması ve kaburgalarını kesip pnömotoraks yaratılması.
5. sahte deney
- Kanülasyon ve PSS perfüzyon başladıktan sonra, damarlarının yeni sıvı akışına göre ayarlanmasına izin vermek için dokulara 30 dakika dengelenmeye izin verin. Bir pipet tarafından atık kadar emme ve bir ilgili etiketli mikrosantrifüjte tüp kaydedin.
- Equilibrasyon sonrası, mikrosantrifüjlü tüplerde her iki tartım teknisinden 10 dakika boyunca atık suyu toplayarak ve rahim arter ve göbek damarından çıkan sıvının hacminin ölçülmesi ile temel perfüzyon oluşturun.
- Distal uterus arter ve göbek ven atıkları toplayarak 10 dakikalık aralıklarla örnek toplama başlatın. Örneğin, bir 900 μL bolus doz 20 Nm Rhodamine etiketli polistiren nanopartiküller (8 x 1014 parçacıklar/ml), ksenobiyotik zaman ders geçişi belirlemek için uterus arter durumu çizgide 0,01% yüzey içinde asılı yönetmek Plasental bariyer genelinde nanopartiküller.
Not: Bu atık örnekleri, sıvının içinde (xenobiotic, farmakolojik veya metabolit) kontaminantların ölçülmesine izin verecektir ve uterus arter veya plasenta üzerinden ve fetal bölmesine sıvı akışı oranı sağlar ( Şekil 4). - Bolus infüzyon sonra, distal uterus arter ve fetal göbek ven atık numuneleri toplamak her 10 dakikada toplam 180 Min infüzyon sonra.
6. Ekipmanı Temizleme
- Her denemenin ardından plasental üniteyi Pipetlerden çıkarın. Tüm dikişler gelecekteki deneylerde yeniden kullanılabileceği şekilde kaydedilebilir. Plasental doku ek histolojik veya mekanik çalışmalar için kaydedilebilir.
- Perfüzyon sisteminin tüm tüpleri ve kanüller ile 70% etanol ile temizleyin ve ardından damıtılmış su ve vakum kuru.
Not: tüpler veya pipetler renk bozulmadan veya hasarlı görünüyorsa, sonraki deneyden önce değiştirin. Ayrıca, deneysel bir kohort tamamlandıktan sonra (örneğin, tek bir kirletici ile ilgili tüm çalışmalar), çapraz kontaminasyonu önlemek için odanın içindeki tüm tüpleri değiştirin.
Representative Results
Şekil 5 , Evan 'ın mavi boyasını kullanarak, sistemi test etmenize ve uygun akışkan ve plasental bariyer fonksiyonunu görselleştirmemize ve fetal bölmesine kapsama transferini önlemeye olanak tanıyan prensip olarak deney deneylerini gösterir. Evan 'ın mavi boyası, bu sistemde plasentanın dokusunu aldı ve mükemmelliği kullandı (Şekil 5A). Daha fazla soruşturma üzerine, Evan 'ın mavi boya fetüs göbek ven (Şekil 5B), Evan 'ın mavi boya albumin bağlı olarak beklenen girmiyor açıktır.
Şekil 6 Bu protokolde açıklanan sahte denemenin verilerini gösterir. Uterus arter ve fetal göbek ven distal ucundaki atık numuneleri, her 10 dakikalık segmentte, bolus dozunun maternal uterus arterine uygulandıktan sonra zaman içinde sıvı akışını değerlendirmek için ölçülmüştür (Şekil 6). Polistiren infüzyon sonrasında 10 dakika içinde fetal bölmeye azaltılmış sıvı aktarımı belirlendi. Zaman ders sırasında fetüs bölmesine polistiren transferini ölçmek için, her zaman noktasından 25 μL perfkullanılmış sıvı örnek floresans ölçmek için yinelenen bir 96 iyi plaka yerleştirilir. Floresan Mikroplaka Okuyucu kullanılarak 546/575 Nm (ex/em) ' de spektroskopik okuma ile floresans belirlendi. Fetüs bölmesine polistiren transferi 10 dakika içinde meydana geldi ve 20 dakika içinde zirve yaptı ve 90 dakika boyunca devam etti (Şekil 6B).
Histopatoloji ve morfolojik değerlendirmeler için perfkullanılan plasental dokulardan oluşan bir alt kümesi kaydedildi. Dokularda formalin-sabit ve hematoksinli ve eozin lekelenmiş ve bir yönetim kurulu sertifikalı veteriner patolog tarafından gözden geçirildi. Bu uzmanlar, sadece PSS veya PSS ile Rhodamine etiketli polistiren bolus dozu ile perfüze plasenta satıyor hiçbir yapısal anormallikleri tespit.
Şekil 1: modifiye tek damar odası. (A) değiştirilmiş odaya genel bakış. (B) damar odasının içinde korunan künt uçlu iğneleri yakın çekim görüntüsü. Kırmızı ok, iğneleri göbek kanülasyon için yerinde tutmak üzere değiştirilmiş olan termistör klibini gösterir. (C) doku kanülasyon için hazırlanan dört kanül temsili bir görüntü. Kırmızı oklar dört kanüller her işaret. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 2: plasental perfüzyon odasının daha yakından görünümü. (A) Bu basınç dönüştürücülüğü bağlı tüp temsil eder ve proksimal maternal uterus arter kanüle, ya da "girişi". Baskı, literatür tarafından tanımlandığı şekilde mmHg 80 sabit olarak ayarlanmıştır. (B) bu perfüzyon sırasında plasental doku çevreleyen superfusate Oda drenaj portu temsil eder. (C) Bu, perfüzyon sırasında plasentayı ıSıTıLMıŞ PSS ile yıkanmak için superfusate Oda girişi temsil eder. (D) Bu, uterus perfüzyonundan atık alınabilen distal maternal uterus limanında temsil edilir. (E) Bu, damar odasının deney boyunca tutarlı bir sıcaklık sağlamak için bir termometre ve ısıtıcıya bağlanabileceği sıcaklık bağlantı noktasını temsil eder. (F) Bu göbek arter kanülasyon temsil eder. Göbek arter plasenta düzeyinde karşı akım akışı için izin vermek için 50 mmHg basınçlanmış. (G) Bu göbek ven atık toplama temsil eder. Perfüzyon sırasında fetal bölmesine doğru akan sıvı burada toplanacaktır. (H) Bu, plasentanın perfüzyon boyunca kanüle edildiği ve korunduğu perfüzyon sisteminin merkezidir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 3: plasental perfüzyon sisteminin bir görünümü. (A ve B) basınç kontrol sistemi, uterin arter ile perfuzatta 80 mmHg izlemek ve korumak için kullanılır. (C) bu perfüzyon odasının termo-düzenlenmesi temsil eder. (D) mikroskop. (E) perfüzyon odası. (F) 50 mmHg 'de yer alan yerçekimi beslenen göbek arter perfüzyon. (G) plasental superfusate PSS doldurmak ve boşaltmak için kullanılan bir peristaltik pompa. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 4: plasental perfüzyon sisteminin şematik. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 5: Evan 'ın mavi boyasını kullanarak ilke kanıtı deneylerinin temsili görüntüleri. (A ve B) kanıtı-of-prensibi Evan 'ın mavi uterus damar, uterus kas ve plasenta perfkullanmak ama albümin bağlayıcı nedeniyle plasental bariyer geçmez. Yeşil ok, plasentadan maternal dolaşıma kadar mavi venöz drenajı gösterir. Kırmızı ok, fetal bölmesine doğru göbek damarını gösterir. Mavi boya eksikliği unutmayın. (C) göbek ven drenaj atık toplama temsili bir görüntü. Kırmızı ok, toplama işleminden önce damla oluşumunu gösterir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 6: sahte deneyden türetilen veriler. Rhodamine etiketli polistiren Nanomalzemelerin floresans ölçümleri, (A) uterus arter ve (B) fetal göbek ven effluents koleksiyonu yoluyla, temel floresans normalleştirilmiş. Temel floresans ± standart hata (SE) normalleştirilmiş ortalama. *: p < 0,05 ve T: p < 0,1 varyans analizi (ANOVA) ile. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Discussion
Bu perfüzyon yöntemi, rahim damarının ve trofoblast tabakasının plasental bariyer ve fizyolojik fonksiyonunun hızlı değerlendirilmesi için izin verir. Maternal uterus arter distal uçları proksimal kanülasyon ve perfüzyon gelişmekte olan fetüse kan göndermekten sorumlu bu büyük gemi ile maternal kan akışının fizyolojisi simüle eder. Bu metodoloji, izole maternal, plasental ve göbek damarının fizyolojik değerlendirilmesini sağlar ve bu nedenle fizyolojideki değişiklikler vasküler patoloji olarak tanımlanabilir; bağışıklık ve nöral innervations ex-vivo işlemde kaldırılır. Uygun değerlendirme sağlamak için, bu nedenle bu gemiler dikkatle damar duvarlarında herhangi bir gözyaşı veya delik oluşturmak ve hava kabarcıkları kaldırmak için cannulate için önemlidir. Gaz emboli, damarların endotel tabakasına zarar verebilir veya kan damarlarını engelleyebilir. Diseksiyon sırasında uterusun, plasenta ve fetüs arasındaki vasküler bağlantıları koruyarak, fetüse sıvı ve transkonumun değerlendirilmesi gözlenebilir. Bir xenobiotic yönetimi ile, bu durumda 20 Nm polistiren, uterus arter distal ucuna ve plasenta aracılığıyla fetal bölmesine kinetik 180 dakika boyunca bir zaman ders üzerinde atıkları analizi ile değerlendirilebilir.
Bu yazıda bir çift perfüzyon modeli tanımlanırken, maternal 'den fetal bölmesine kadar partiküllerin ve sıvının aktarımı izlenirken, bu makalede, fetal, maternal bölmeye karşı değerlendirilmesi de yapılabilir. Burada açıklanan yöntemin bir sınırlama distal uterus ven kanüle veya örneklenmez olmasıdır. Gelecekteki çalışmalarda, özellikle fetal-maternal transfer odaklı, bu cannulate ve distal uterus damar numune önemli olacaktır. Bu sahte deneyden alınan atıkları ksenobiyotik transfer değerlendirmek için kullanıldı; Ancak endokrin ve moleküler plasental fonksiyonları veya fetal beslenme ile ilgili geniş bir değerlendirme yelpazesi gerçekleştirilebilir.
Bu protokolün güçlü yönleri, küçük sınırlamalarına çok daha fazla basar. Hazırlık, deneysel koşulları değerlendirmek için tüm organın fizyolojik yapısını ve bütünlüğünü korur. Ex vivo plasental perfüzyon, üreme riski değerlendirmesini düzgün bir şekilde belirlemek için hücresel tabanlı in vitro tüm hayvan maruz kalma bilimsel bir ilerlemektir. Bu plasental farmakolojik ilaç eğilimi, farmakokinetik, toksikoloji, fizyoloji ve maternal-fetal tıbbı değerlendirmede çalışmalar için değerli bir teknik olarak kabul edilebilir.
Disclosures
Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Bu çalışma Ulusal çevre sağlığı Bilimleri Enstitüsü (R00-ES024783), Rutgers çevre pozlama ve hastalık Merkezi (P30-ES005022) ve toksikoloji (T32-ES007148) Rutgers ortak lisansüstü programı tarafından destekleniyordu. Biz de bizim perfüzyon şematik tasarımı onun yardımı için DRS. Michael Goedken, Marianne Polunas, ve Pedro Louro teknik uzmanlık ve Dr adam Goodwill için teşekkür etmek istiyorum (Şekil 5).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Black braided silk non-absorbable surgical suture non-sterile | Surgical Specialties Look | AACO805 | |
| Fine forceps | FST by Dumont Switzerland | 11252-20 | |
| Fine scissors | FST by Dumont Switzerland | 14060-10 | |
| Glass cannula pack | Living Systems Instrumentation (LSI) | GCP-75-100 | |
| Microcentrifuge Tubes 2.0mL polypropylene graduated tube with locking lid MIXED | Fisherbrand | 02-681-299 | |
| Non-serrated fine curved micro serrefine clamps | InterFocus | 18052-03 | |
| Perfusate pump | ISMATEC | ISM795C | |
| Pressure monitor | Living Systems Instrumentation (LSI) | Mode PM-4 | |
| Self-heating single vessel chamber | Living Systems Instrumentation (LSI) | CH-1 | |
| Servo Pump | Living Systems Instrumentation (LSI) | ModelPS-200-P | |
| Stainless steel blunt needle 23 gauge | Component Supply Co. | 04651-01 | |
| Stainless steel blunt needle 25 gauge | Component Supply Co. | 07116-01 | |
| STERILE Nylon Suture | AROSurgical Instruments Corporation | T04A00N07-13 | |
| Stopcock | Sedation Resource | 6-205-04 | |
| Temperature Controller | Living Systems Instrumentation (LSI) | Model TC-09S |
References
- Troen, P., Gordon, E. E. Perfusion studies of the human placenta. I. Effect of estradiol and human chorionic gonadotropin on citric acid metabolism. Journal of Clinical Investigation. 37, 1516-1523 (1958).
- Alexander, D. P., Huggett, A. S., Nixon, D. A., Widdas, W. F. The placental transfer of sugars in the sheep: the influence of concentration gradient upon the rates of hexose formation as shown in umbilical perfusion of the placenta. Journal of Physiology. 129, 367-383 (1955).
- Alexander, D. P., Andrews, R. D., Huggett, A. S., Nixon, D. A., Widdas, W. F. The placental transfer of sugars in the sheep: studies with radioactive sugar. Journal of Physiology. 129, 352-366 (1955).
- Dancis, J., Money, W. L. Transfer of sodium and iodo-antipyrine across guinea pig placenta with an in situ perfusion technique. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 80, 215-220 (1960).
- London, W. T., Money, W. L., Rawson, R. W. Placental Transport of I-131-Labeled Thyroxine and Triiodothyronine in the Guinea Pig. Endocrinology. 73, 205-209 (1963).
- Stulc, J., Stulcova, B., Svihovec, J. Transport of calcium across the dually perfused placenta of the rat. Journal of Physiology. 420, 295-311 (1990).
- Goeden, N., Bonnin, A. Ex vivo perfusion of mid-to-late-gestation mouse placenta for maternal-fetal interaction studies during pregnancy. Nature Protocols. 8, 66-74 (2013).
- Bond, H., et al. Artificial perfusion of the fetal circulation of the in situ mouse placenta: methodology and validation. Placenta. 27, Suppl A, S69-75 (2006).
- Illsley, N. P., Fox, H., Van der Veen, F., Chawner, L., Penfold, P. Human placental ultrastructure after in vitro dual perfusion. Placenta. 6, 23-32 (1985).
- Davis, M. J., Kuo, L., Chilian, W. M., Muller, J. M. Isolated, Perfused Microvessels. Clinically Applied Microcirculation Research. Barker, J. H., Anderson, G. L., Menger, M. D. , 1 ed, CRC Press. Boca Raton. 435-456 (1995).
- Butcher, J. T., Goodwill, A. G., Frisbee, J. C. The ex vivo isolated skeletal microvessel preparation for investigation of vascular reactivity. Journal of Visualized Experiments. (62), 3674 (2012).
