Summary
Мы представляем протоколы для изучения развития сердца мыши, с помощью микроскопии всю гору epifluorescent эмбрионов мыши, расчлененный от желудочков конкретных док 2v-tdTomato репортер забивные мышей. Этот метод позволяет нам непосредственно визуализировать каждый этап формирования желудочка во время разработки сердца мыши без трудоемкого гистохимические методы.
Abstract
Цель настоящего Протокола заключается в описания метода для визуализации желудочков палат эмбриона мыши во время разработки сердца с помощью желудочков конкретных флуоресцентные репортер стук в мышах (док 2v-tdTomato мышей) и dissection зародышей мыши. Сердце развития включает в себя формирование трубки линейной сердце, сердце трубки циклов и четыре камеры septation. Эти сложные процессы сохраняются весьма всех позвоночных. Сердце эмбриона мыши широко используется для развития исследований сердца. Однако из-за их крайне небольшой размер, рассекает мыши эмбриональные сердца технически сложным. Кроме того визуализация сердечной камеры формирования часто нуждается в гибридизации situ, бета галактозидазы окрашивание с помощью LacZ репортер мышей, или иммуноокрашивания секционного эмбриональных сердец. Здесь мы опишем, как вскрыть мыши эмбриональные сердца и непосредственно визуализировать желудочков камеры формирования док 2v-tdTomato мышей, используя всю гору epifluorescent микроскопии. С помощью этого метода возможность непосредственно изучить сердце трубки формирования и циклов и четыре камеры формирования без дальнейших экспериментальных манипуляций зародышей мыши. Хотя линия стук в мыши репортер док 2v-tdTomato используется в этот протокол в качестве примера, этот протокол может применяться на другие линии сердца конкретных флуоресцентные репортер трансгенные мыши.
Introduction
Камеры формирования во время разработки сердца является сложным процессом перехода через несколько морфологически различные эмбриональных стадий1,2. Форме полумесяца сердечной прогениторных клеток населения образует трубу линейной сердца и затем подвергается удлинение и циклы в форму спирали развивающихся сердца. После его septation процесса развивающегося сердце превращается в четырех-сердце. Перерыва какого-либо из этих процессов в результате пороков развития сердца. Таким образом важно понять молекулярные механизмы, лежащие в основе формирования палаты во время разработки сердца. Несмотря на многочисленные предыдущие исследования по развитию сердца наше понимание этого сложного процесса, остается ограниченным.
Гибридизации in situ, иммуногистохимия и бета галактозидазы окрашивание с помощью LacZ репортер мышей широко использовался для изучения формирования палаты во время разработки сердца мыши, снабдив сердечной конкретных или камеры конкретных структурных генов или белки (например, НПЛН, переворот-TFII, Irx4, док 2a и док 2v)3,4,5,6,,78,9,10. Однако, эти эксперименты с использованием эмбрионов мыши требуется значительное время и опыт, потому что несколько различных экспериментальных шаги должны быть выполнены последовательно11. Здесь мы описываем метод простой всю гору epifluorescent микроскопии визуализировать развивающихся желудочков с использованием эмбрионов, расчлененный от док 2v-tdTomato репортер мышей стук в12. Преимущество этого метода по сравнению с ранее использовавшихся методов, чтобы избежать сложных экспериментальные шаги, которые часто может создать экспериментальные варианты. Основной целью настоящего Протокола является описать как вскрыть зародышей мыши и развивающихся сердца и изучить каждый этап развития сердечной камеры мыши без утомительного гистохимические экспериментов. Этот метод легко может применяться для оценки развития сердца, с использованием различных других трансгенные мыши линии маркировки ранней сердечной маркеров (например, Mesp1Cre: Rosa26EYFP13, Isl1Cre: Rosa26EYFP13, Hcn4H2BGFP14, Hcn4Cre: Роза mT /MG14, Nkx2-5Cre: Роза mT/мг14, Hcn4-eGFP15, Isl1Cre: Роза mT/мг14, Nkx2.5Cre: Rosa26tdTomato15и TgMef2c-AHF-GFP16 мышей).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все животные процедуры выполнялись с одобрения Вандербильта университета медицинский центр институциональных животное уход и использование Комитета.
1. мышь эмбриона коллекции и рассечение
- Мате женского док 2v-tdTomato 8-10 неделя+ / мышей с 8-10 недельных док 2v-tdTomato+ / мышей-самцов для получения док 2v-tdTomato+/ +, док 2v-tdTomato+ / и док 2v-tdTomato- / - эмбрионов.
- Проверьте плотин для вагинальных свечей каждое утро. Полдень в день обнаружения Вагинальные вилка рассматривается как E0.5.
Примечание: Вагинальный осмотр для выявления Вагинальные вилка должна быть выполнена в первой половине дня (в течение 8-24 ч после сексуальной активности), так как Вагинальные вилка может быть потеряно в течение дня. - Усыпить беременных плотин в разные дни поста coitum (например, E8.5, E10.5 и E12.5) с использованием CO2 ингаляции следуют шейки матки дислокации.
- Положите лежачем мышей и спрей 70% этанол на брюшке мышей, чтобы избежать загрязнения волос мыши во время вскрытия.
- Откройте брюшной полости, разрез кожи и брюшной стенки, используя острые ножницы хирургические и forcep.
- Найдите двусторонних маточные рожки в спинной части брюшной полости.
- Отделить всю матку, тщательно резки выше яйцеводов с обеих сторон, используя острые ножницы хирургические и forcep.
- Поместите всю расчлененных матки в 10см Петри с ледяной PBS и осторожно отделить каждый Амниотический мешок вдоль рога матки, используя острые ножницы хирургические и forcep.
- Перевод каждого эмбриона на отдельных скважин 6 хорошо пластины, наполненный ледяной PBS с помощью пипетки передачи.
- Под микроскопом рассечения открыть Амниотический мешок и подвергать каждого эмбриона, отрезав пуповины, используя острые ножницы хирургические и forcep в отдельных хорошо 6 хорошо плиты с ледяной PBS.
- Отделка из экстра эмбриональных тканей как можно больше не повреждая зародыша, используя острые ножницы хирургические и forcep.
Примечание: Вся гора epifluorescent томографии всего мыши эмбриона обычно выполняется перед рассекает развивающихся сердце, как описано ниже. - Вырежьте голову эмбриона, используя острые ножницы хирургические и forcep и передачи в 1,5 мл трубку с 100 мкл буфера A (25 мм NaOH и 0,2 мм ЭДТА) для генотипирования коррелируют с результатами epifluorescent изображений.
- Открыть сундук эмбриона с помощью тонкой щипцы, удалить сердце от легких и сосудистую, используя острые ножницы хирургические и щипцы и передача расчлененных сердце эмбриона в колодец 12 хорошо плиты с PBS с помощью пипетки передачи. Все рассечение процедуры завершаются под микроскопом рассечения волоконно-оптического микроскопа осветитель.
Примечание: Технически трудно анализировать из эмбриональных сердца мыши на E8.0 или E8.5, из-за их чрезвычайно малые размеры и хрупкой структуры. Ранних эмбриональных сердца (то есть, E8.0 и E8.5) может быть рассмотрен в рамках всей горе эмбриона без вскрытия.
2. всего гора эпифлуоресцентного изображений
- Поместите 12 хорошо пластину с мыши эмбриональные сердца под epifluorescent, рассекает микроскопом.
- Под epifluorescent, пройдя микроскопа с помощью тонкой щипцы позиция эмбриональных сердце что развивающиеся желудочки расположены недалеко от экзаменатора.
- Настройка фокусировки изображения, используя цель 0,63 x (диапазон масштабирования между 3,15 x и 18,9 x) в режиме светлые области.
- Возьмите светлые области воздействия и захватить несколько изображений. Обычно изображения были получены путем одной секунды воздействия. Однако время экспозиции может варьироваться в зависимости от освещения и specificationss камеры и должны быть оптимизированы для каждой установки.
- Выключить волоконно оптический микроскоп осветитель и установите фильтр для красной флуоресценцией (Ex545 Нм/Em 605 Нм) для визуализации tdTomato выражение.
- Перенастраивать фокусировки изображения, если необходимо.
- Отрегулируйте яркость и контрастность, взять красный флуоресцентные воздействия и захватить несколько изображений.
Примечание: Обычно используются следующие настройки изображения: 1 s воздействия раз, 2 x прибыль, 1.0 насыщенность и 1.0 гамма-коррекции. Оптимальные настройки должна быть оптимизирована для каждого эксперимента. После того, как определяется оптимальная установка, те же настройки необходимо использовать для всего эксперимента.
3. генотипирования
- Сварить образцы из шага 1.12 1 ч при 100 ° C.
- Центрифуга для 2 мин на 11,360 x g, передачи 20 мкл супернатант в новой 1,5 мл трубку с 20 мкл буфера B (40 мм Tris-HCl, pH 5.5) и смешивать их.
- Взять 4.5 мкл смешанных супернатант из шага 3.2 как шаблон ДНК, объединить его с 0.5 мкл каждого из конкретных вперед и обратного грунтовки (10 мкм), 10 мкл предварительно смешанные полимеразы и реакция буфера (2 x) (см. Таблицу материалы), а затем добавить воды в целом v olume 20 мкл. грунтовка последовательностей являются как указано ниже.
F1: 5'-TACCCACGGAGAAGAGAAGGACT-3'
R1: 5'-TGGACTTCTTGGAACTGACTCTGT-3'
F2: 5'-ACGGCACGCTGATCTACAAGGT-3'
R2: 5'-TTTGCGCACAGCCCTGGGAT-3' - Запуск полимеразной цепной реакции (ПЦР) с программой следующим ПЦР (Таблица 1 и Таблица 2).
- Запуск ПЦР образцов и лестница ДНК на геле агарозы 1% на 140 V в 1 x TAE (Tris ацетат ЭДТА) буфера (40 мм трис ацетат и 1 мм ЭДТА) 25 мин использовать 100 лестница ДНК bp для оценки размера диапазоны PCR.
- Поместите гель ДНК на УФ transilluminator для выявления ДНК полос и включите УФ света.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В ходе развития сердца док 2v считается ранних маркер для желудочковой палата спецификации17. Как показано на рисунке 1, мы разобрал весь зародышей мыши и эмбриональных сердца от док 2v-tdTomato репортер забивные мышей и изучены док 2v-tdTomato репортер выражение во время разработки сердца. В док 2v-tdTomato репортер стук в мышей, учредительного tdTomato выражение в самом развивающемся визуализируется помощью эпифлуоресцентного всю гору изображений как раньше на E8.012 (рис. 2). Относительно слабое выражение tdTomato в трубке линейной сердца в E8.0 становится сильнее в E8.5. В E10.5 док 2v-tdTomato репортер выражение был продемонстрирован в желудочковой части расчлененных петельные сердца от всей мыши эмбриона, хотя он не был показан в урочище притока, урочище отток или будущих предсердий. В E12.5-E13.5 вся гора epifluorescent томография расчлененных сердце эмбриона мыши забивные репортер док 2v-tdTomato показало, что репортер tdTomato исключительно выражается в желудочках сердца четырех камерная. Аналогичный шаблон желудочков конкретные выражения док 2v-tdTomato репортер был показан в расчлененных мыши эмбриона на E16.5. С помощью этого метода, мы можем легко отслеживать вниз желудочков камеры формирования во время разработки сердце мыши.
После съемки всей горе epifluorescent эмбрионов мыши или расчлененных развивающихся сердца, мы ретроспективно подтвердил генотип эмбриона, используя головку зародышей мыши. Использование двух наборов праймеров, как показано на рис 3А, мы провели генотипирования ПЦР. Эмбрионов, перевозящих аллеля дикого типа показал 383 bp ПЦР продукта с помощью F1 и R1 грунт. Эмбрионов, перевозящих tdTomato забивные аллеля, показал 497 продукт PCR bp, используя праймер F2 и R2 набор (рис. 3B). Гетерозиготных эмбрионы были определены, продемонстрировав оба 383 bp и 487 bp полос, в то время как дикого типа или гомозиготных генотип был определен путем демонстрации одного 383 bp или 497 bp группы, соответственно.
Рисунок 1. План поэтапного экспериментальной процедуры для всей горе epifluorescent изображений сердца мыши репортер эмбриональных док 2v-tdTomato. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2. Представитель epifluorescent изображения всего эмбрионов и развивающихся сердца расчлененный от док 2v-tdTomato репортер стук в мышах. Epifluorescent изображений всей горе эмбрионов и расчлененных сердце на разных этапах эмбрионального демонстрирует конкретное выражение tdTomato в желудочках сердца развивающихся. Весь эмбриона (A) в E8.0, весь эмбриона (B) в E8.5, весь эмбриона (C) в E9.0, весь эмбриона (D) в E10.5, весь эмбриона (E) в E13.5, весь эмбриона (F) в E16.5, (G) эмбриональных сердца в E9.0, (H ) Эмбриональных сердца в E10.5, (я) Embryonic сердца в E13.5 и эмбриональных сердца (J) на E16.5. , Атриум; V, желудочка; IFT, приток тракта; OFT отток тракта. Масштаб бар (A\u2012F) = 1 мм; Масштаб бар (G-J) = 500 мкм. Этот рисунок был изменен из ссылки #12 с разрешения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3. Генотипированию эмбрионов док 2v-tdTomato репортер стук в. (A) Иллюстрация генотипирования конструкции праймера. (B) представитель генотипирования результатов с помощью F1 и R1 грунты (слева) и F2 и R2 грунтовки (справа). +/ +: гомозиготных, + /: гетерозиготных,- / -: дикого типа. Эксон: сегмент гена, который содержит сведения, необходимые для синтеза белка; IRES: Внутренний рибосома запись сайта; FRT: Флиппазы рекомбиназа -рекомбинации целевой объект. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Шаг | Температура ° C | Время | Примечание |
| 1 | 94 | 3 мин | |
| 2 | 94 | 30 s | |
| 3 | 60 | 35 s | |
| 4 | 72 | 35 s | |
| 5 | Повторите шаги 2-4 для 38 циклов | ||
| 6 | 72 | 5 мин | |
| 7 | 10 | Удерживайте |
Таблица 1: ПЦР программы с помощью F1 и R1 праймеры
| Шаг | Температура ° C | Время | Примечание |
| 1 | 94 | 3 мин | |
| 2 | 94 | 30 s | |
| 3 | 61,7 | 35 s | |
| 4 | 72 | 35 s | |
| 5 | Повторите шаги 2-4 для 38 циклов | ||
| 6 | 72 | 5 мин | |
| 7 | 10 | Удерживайте |
Таблица 2: Программа ПЦР с помощью F2 и R2 праймеры
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Метод, описанный здесь является относительно простым для изучения развития желудочковой камеры, без выполнения трудоемких эксперименты на этикетке желудочка или сердечной конкретных структурных генов и белков. Таким образом этот метод минимизирует технические изменчивости, которые часто были найдены в immunostained сердце секций.
Есть два критических шагов для успешного выполнения этого метода, включая точную оценку эмбриональных возраста мышей и рассечение эмбриональных сердец. Мы оцениваем практически эмбриональных возраст мышей путем выявления вагинальные пробки в самок мышей. Однако наличие Вагинальные вилка не обязательно указывают беременности. Он только указывает, что половое сношение произошло в течение периода приблизительно 8-24 ч. Даже если найдены вагинальных свечей, часто трудно определить ли мышь действительно беременны или не до 10-11 дней после coitum путем изучения живота самок мышей. Разведения нескольких пар мужские и женские мышей — это стратегия безопасного разведения получить ожидаемый возраст мыши эмбрионов. Изоляция развивающихся сердца мыши без существенного ущерба их структур имеет решающее значение для точного изучения развития сердечной камеры во время эмбриогенеза мыши, как показано на рисунке 1. Тщательное вскрытие под рассекает микроскопом и понимание развития сердечной анатомии в каждой начальной стадии до вскрытия, необходимые для успешного выполнения настоящего Протокола.
Поскольку выражение репортер док 2v-tdTomato впервые наблюдали на E8.0, это не возможно изучить более ранних эмбриональных сердца трубки или сердечной Полумесяца этап12. Различные линии мыши репортер, маркировки ранее сердца маркеров (например Mesp1Cre: Rosa26EYFP13, Isl1Cre: Rosa26EYFP13, Hcn4H2BGFP14, Hcn4Cre: Роза mT/мг14, Nkx2-5Cre: Роза mT/мг14, Hcn4-eGFP15 Isl1Cre: Роза mT/мг14и Nkx2.5Cre: Rosa26tdTomato15, TgMef2c-AHF-GFP16 мышей) может использоваться для изучения более ранних этапах развития камеры, с помощью метода, описанного в этой статье.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана NIH R03 HL140264 (ю.-Дж. N) и Галааде наук исследования ученый программа (ю.-Дж. N).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| dissecting microscope | Leica | MZ125 | |
| DNA ladder (100 bp) | Promega | G2101 | |
| epifluorescence dissecting microscope | Leica | M165 FC | |
| GoTaq Green master Mix | Promega | M712 | |
| PCR machine (master cycler) | Eppendorf | 6336000023 |
References
- Evans, S. M., Yelon, D., Conlon, F. L., Kirby, M. L. Myocardial lineage development. Circulation Research. 107 (12), 1428-1444 (2010).
- Paige, S. L., Plonowska, K., Xu, A., Wu, S. M. Molecular regulation of cardiomyocyte differentiation. Circulation Research. 116 (2), 341-353 (2015).
- Lee, K. J., et al. Myosin light chain-2 luciferase transgenic mice reveal distinct regulatory programs for cardiac and skeletal muscle-specific expression of a single contractile protein gene. Journal of Biological Chemistry. 267 (22), 15875-15885 (1992).
- Chen, J., et al. Selective requirement of myosin light chain 2v in embryonic heart function. Journal of Biological Chemistry. 273 (2), 1252-1256 (1998).
- Ross, R. S., Navankasattusas, S., Harvey, R. P., Chien, K. R. An HF-1a/HF-1b/MEF-2 combinatorial element confers cardiac ventricular specificity and established an anterior-posterior gradient of expression. Development. 122 (6), 1799-1809 (1996).
- Christoffels, V. M., et al. Chamber formation and morphogenesis in the developing mammalian heart. Dev Biol. 223 (2), 266-278 (2000).
- Wu, S. P., et al. Atrial identity is determined by a COUP-TFII regulatory network. Developmental Cell. 25 (4), 417-426 (2013).
- Nelson, D. O., Jin, D. X., Downs, K. M., Kamp, T. J., Lyons, G. E. Irx4 identifies a chamber-specific cell population that contributes to ventricular myocardium development. Developmental Dynamics. 243 (3), 381-392 (2014).
- Bao, Z. Z., Bruneau, B. G., Seidman, J. G., Seidman, C. E., Cepko, C. L. Regulation of chamber-specific gene expression in the developing heart by Irx4. Science. 283 (5405), 1161-1164 (1999).
- Kubalak, S. W., Miller-Hance, W. C., O'Brien, T. X., Dyson, E., Chien, K. R. Chamber specification of atrial myosin light chain-2 expression precedes septation during murine cardiogenesis. Journal of Biological Chemistry. 269 (24), 16961-16970 (1994).
- Bardot, P., et al. The TAF10-containing TFIID and SAGA transcriptional complexes are dispensable for early somitogenesis in the mouse embryo. Development. 144 (20), 3808-3818 (2017).
- Zhang, Z., Nam, Y. J. Generation of MLC-2v-tdTomato knock-in reporter mouse line. Genesis. , (2018).
- Ieda, M., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell. 142 (3), 375-386 (2010).
- Liang, X., et al. HCN4 dynamically marks the first heart field and conduction system precursors. Circulation Research. 113 (4), 399-407 (2013).
- Nam, Y. J., et al. Induction of diverse cardiac cell types by reprogramming fibroblasts with cardiac transcription factors. Development. 141 (22), 4267-4278 (2014).
- Spater, D., et al. A HCN4+ cardiomyogenic progenitor derived from the first heart field and human pluripotent stem cells. Nature Cell Biology. 15 (9), 1098-1106 (2013).
- O'Brien, T. X., Lee, K. J., Chien, K. R. Positional specification of ventricular myosin light chain 2 expression in the primitive murine heart tube. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (11), 5157-5161 (1993).
