Summary
우리는 프로토콜 검사 실의 특정 MLC-2v-tdTomato 기자 노크에 쥐에서 해 부 마우스 배아에 전체 마운트 epifluorescent 현미경 검사 법을 사용 하 여 마우스 심장 개발을 제시. 이 방법을 직접 노동 집약적인 조직화 학적인 방법 없이 마우스 심장 개발 하는 동안 심 실 형성의 각 단계를 시각화 수 있습니다.
Abstract
이 프로토콜의 목표 마우스 태아의 해 부 및 배아 마우스 심 실 챔버의 심장 개발 심 실 특정 형광 기자 노크에서 마우스 (마우스 MLC-2v-tdTomato)를 사용 하 여 시각화 하는 방법을 설명 하는 것입니다. 심장 개발에는 선형 심장 관 형성, 루핑, 심장 관 및 4 챔버 septation 포함 한다. 이러한 복잡 한 프로세스는 매우 모든 척추 동물에 보존 됩니다. 마우스 배아 심장 심장 발달 연구에 널리 사용 되었습니다. 그러나, 그들의 매우 작은 크기로 인해, 마우스 미 발달 심 혼을 해 부 기술적 도전 이다. 또한, 종종 심장 챔버의 시각화 제자리 교 잡, 베타-galactosidase LacZ 기자 쥐, 또는 sectioned 미 발달 심 혼의 immunostaining를 사용 하 여 얼룩을 해야 합니다. 여기, 우리는 쥐 미 발달 심 혼 부 직접 심 실 챔버 형성 MLC-2v-tdTomato 마우스 전체 마운트 epifluorescent 현미경 검사 법을 사용 하 여 시각화 하는 방법을 설명 합니다. 이 방법으로 직접 검사 심장 관 형성 및 반복, 마우스 배아의 추가 실험 조작 없이 4 개의 챔버 형성 가능 하다. MLC-2v-tdTomato 기자 노크 마우스 라인은 사용 하지만이 프로토콜에 예를 들어,이 프로토콜 다른 심장 특정 형광 성 취재 원 유전자 변형 마우스 라인에 적용할 수 있습니다.
Introduction
챔버 형성 심장 개발 하는 동안 여러 형태학 상으로 다른 배아 단계1,2를 통해 전환 복잡 한 과정 이다. 심장 조상 인구 셀의 초승달 모양 선형 심장 튜브를 형성 하 고 신장 및 개발 중심의 나선형 모양을 형성에 반복을 겪 습. 그것의 septation 과정 후 개발 심장 4 연 발 심장으로 변화 됩니다. 이러한 프로세스의 중단 발달 심장 결함 발생합니다. 따라서, 챔버 형성 심장 개발 하는 동안 기본 분자 메커니즘을 이해 하는 것이 중요 하다. 수많은 이전 연구 심장 발달에,에 불구 하 고이 복잡 한 과정의 우리의 이해 제한 된 남아 있습니다.
제자리 교 잡, immunohistochemistry, 및 베타-galactosidase 얼룩 LacZ 기자 마우스를 사용 하 여 널리 사용 된 특정 심장 또는 챔버 특정 구조 유전자의 라벨 마우스 심장 개발 동안 챔버 형성 연구 또는 단백질 (예를 들어, Nppa 쿠데타-TFII, Irx4, MLC-2a, MLC-2v)3,,45,6,7,8,9,10. 그러나, 이러한 실험 마우스 배아를 사용 하 여 필요 상당한 시간과 전문성, 여러 다른 실험적인 단계 될 필요가 있기 때문에11을 순차적으로 수행. 여기, 우리 개발 심 배아 MLC-2v-tdTomato 기자 노크 쥐12에서 해 부를 사용 하 여 시각화 하는 간단한 전체 마운트 epifluorescent 현미경 메서드를 설명 합니다. 이전에 사용한 방법에 비해이 방법의 장점은 종종 실험의 유사 콘텐츠를 만들 수 있습니다 복잡 한 실험 단계를 피하기 위해입니다. 이 프로토콜의 주요 목적은 마우스 배아와 마음을 개발 해 부 하 고 지루한 조직화 학적인 실험 없이 마우스 심장 챔버 개발의 각 단계를 검사 하는 방법을 설명 하는 것 이다. 이 방법은 심장 개발 초기 심장 마커 라벨 다른 다양 한 유전자 변형 마우스 라인을 사용 하 여 평가에 쉽게 적용할 수 있습니다 (예: Mesp1Cre: Rosa26EYFP13, Isl1Cre: Rosa26EYFP13, Hcn4H2BGFP14, Hcn4Cre:로 사 산 /mG14, Nkx2-5Cre:로 사 산/mG14, Hcn4 eGFP15, Isl1Cre:로 사 산/mG14, Nkx2.5Cre: Rosa26tdTomato15및 TgMef2c-AHF-GFP16 쥐).
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Protocol
모든 동물 절차 Vanderbilt 대학 의료 센터 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인으로 수행 했다.
1. 마우스 배아 수집 및 해 부
- 친구 8 10 주 오래 된 여성 MLC-2v-tdTomato+ 마우스 8 10 주 오래 된 남성 MLC-2v-tdTomato+ 마우스를 MLC-2v-tdTomato+ +, MLC-2v-tdTomato+ 와 MLC-2v-tdTomato-/- 배아.
- 매일 아침 질 플러그에 대 한 댐을 확인 하십시오. 질 플러그 감지 당일 정오 E0.5로 간주 됩니다.
참고: 질 플러그를 탐지 하기 위한 질 시험 (8-24 h 성행위 후), 내 아침에 수행 되어야 합니다 때문에 질 플러그 하루 동안 손실 될 수 있습니다. - 다른 일 게시물 coitum (예: E8.5, E10.5, 및 E12.5)에서 임신 댐 안락사 경부 전위 다음 공동2 흡입을 사용 하 여.
- 부정사 쥐를 쥐 해 부 동안 마우스 머리 오염을 피하기 위하여의 복에 70% 에탄올을 스프레이.
- 피부와 날카로운 수술가 위를 사용 하 여 한 forcep 복 벽의 절 개 하 여 복 부 구멍을 엽니다.
- 복 부 구멍의 등 쪽 부분에 양측 자 궁 뿔을 찾습니다.
- 날카로운 수술가 위를 사용 하 여 한 forcep 양쪽에는 oviducts 위에서 신중 하 게 절단 하 여 자 궁 전체를 구분 합니다.
- 10 cm 배양 접시 얼음 처럼 차가운 PBS 가진 전체 해 부 자 궁을 놓고 신중 하 게 날카로운 수술가 위를 사용 하 여 한 forcep 자 궁 경적 따라 각 amniotic sac를 분리 합니다.
- 6 잘 플레이트 전송 피 펫을 사용 하 여 얼음 처럼 차가운 PBS 가득의 개별 우물에 각 배아를 전송 합니다.
- 해 현미경 amniotic sac를 열고 사용 하 여 날카로운 수술가 위는 forcep 얼음 처럼 차가운 PBS 가진 6 잘 플레이트의 개별 잘에서 탯에서 절단 하 여 각 배아를 노출 합니다.
- 날카로운 수술가 위를 사용 하 여 한 forcep 태아 손상 없이 가능한 여분의 배아 조직 밖으로 잘라.
참고: 전체 마우스 배아의 전체 마운트 epifluorescent 이미징 일반적으로 아래에 설명 된 개발 심장 해 부 하기 전에 수행 됩니다. - 유전형 epifluorescent 이미징의 결과와 상관 관계를 100 µ L 버퍼 A의 (25 m m NaOH와 0.2 m m EDTA)와 날카로운가 위를 수술과 forcep 1.5 mL 튜브에 사용 하 여 태아 머리를 잘라.
- 미세 집게를 사용 하 여 태아의 가슴을 열고, 폐 맥 관 구조 날카로운 수술가 위, 집게를 사용 하 여에서 마음을 제거 하 고 전송 피 펫을 사용 하 여 PBS를 가진 해 부 배아 심장 12 잘 접시의 우물으로 전송. 섬유 광학 현미경 illuminator와 해 현미경으로 모든 해 부 절차 완료 됩니다.
참고: 그것은 기술적으로 어려운 그들의 매우 작은 크기와 깨지기 쉬운 구조 때문에 E8.0 또는 E8.5, 쥐 미 발달 심 혼을 해 부 했다. 초기 미 발달 심 혼 (E8.0 및 E8.5) 절 개 없이 전체 마운트 태아 내에서 시험 될 수 있다.
2. 전체-마운트 epifluorescence 이미징
- epifluorescent 해 부 현미경 아래 마우스 배아 마음으로 12 잘 접시를 놓습니다.
- 해 부 현미경 미세 집게를 사용 하는 epifluorescent에서 개발 심 시험관 가까이 되도록 배아 심장 위치.
- 0.63 x 목표를 사용 하 여 이미지의 초점을 조정 (3.15 x와 18.9 사이 범위를 확대 x) 밝은 필드 모드에서.
- 밝은 분야 노출 하 고 여러 이미지를 캡처하십시오. 이미지는 일반적으로 1 초 노출에 의해 얻은 했다. 그러나, 노출 시간 조명 및 카메라 specificationss을 따라 하 고 각 설정에 대 한 최적화 하는 데 필요한 수 있습니다.
- 섬유 광학 현미경 illuminator 끄고 빨간 형광 (Ex545 nm/Em 605 nm) tdTomato 식 시각화에 대 한 필터를 설정.
- 다시 필요한 경우에 이미지의 초점을 조정 합니다.
- 밝기 및 대비 조정, 빨간 형광 노출 걸릴 하 고 여러 이미지를 캡처하십시오.
참고: 다음 이미지 설정에 일반적으로 사용 되었다: 1 s 노출 시간, 이득, 1.0 채도 및 1.0 감마 보정 x 2. 최적의 설정은 각 실험에 대 한 최적화가 필요 합니다. 최적의 설정은 결정 되 면 같은 설정을 전체 실험에 사용할 필요가 있다.
3입니다. 유전형
- 1.12 100 ° c.에서 1 h 단계에서 샘플을 끓여
- (40 mM Tris HCl, pH 5.5) 11,360 x g, 버퍼 B의 20 µ L와 함께 상쾌한 새로운 1.5 mL 튜브에의 전송 20 µ L에서 2 분 동안 centrifuge과 그들을 믹스.
- DNA 템플렛으로 3.2 단계에서 혼합된 상쾌한의 4.5 µ L, 0.5 µ L의 특정 앞으로 각각의 결합 및 역방향 뇌관 (10 µ M), 미리 혼합된 중 합 효소와 반응 버퍼 (2 배)의 10 µ L ( 재료의 표참조), 다음 물 총 v에 추가 20 µ L. 뇌관 시퀀스의 olume는 아래에.
F1: 5'-TACCCACGGAGAAGAGAAGGACT-3'
R1: 5'-TGGACTTCTTGGAACTGACTCTGT-3'
F2: 5'-ACGGCACGCTGATCTACAAGGT-3'
R2: 5'-TTTGCGCACAGCCCTGGGAT-3' - 다음 PCR 프로그램 (표 1 및 표 2) 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR)를 실행 합니다.
- 샘플 및 DNA 사다리 140 V 25 분에 대 한 1 x TAE (트리 스-아세테이트-EDTA) 버퍼 (40mm 트리 아세테이트 및 1 mM EDTA)에 1 %agarose 젤에 PCR 밴드의 크기를 추정 100 bp DNA 사다리를 사용 PCR을 실행 합니다.
- DNA 젤을 DNA 밴드를 식별 하는 UV 빛 UV transilluminator에 놓습니다.
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Representative Results
심장 개발, MLC-2v는 심 실 챔버 사양17에 대 한 초기 마커 간주 됩니다. 그림 1에서 같이, 우리가 마우스 전체 배아 및 배아 마음 MLC-2v-tdTomato 기자 노크에서 마우스에서 해 부 하 고 MLC-2v-tdTomato 기자 식 심장 개발 중 시험. MLC-2v-tdTomato 쥐 노크에서 기자, 개발 마음에 제정 tdTomato 식 epifluorescence 전체 마운트 영상 통해 시각 이다 이르면 E8.012 (그림 2). E8.0에서 선형 심장 튜브에 tdTomato의 상대적으로 약한 표현이 된다 E8.5에 강한. E10.5에서 MLC-2v-tdTomato 기자 식 시연 했다 반복된 해 부 심장의 심 실 부분에 전체 마우스 배아에서 유입 관, 유출 관 또는 미래의 atria에 표시 하지 했다. E12.5-E13.5, MLC-2v-tdTomato 노크 기자 마우스 태아의 해 부 심장의 전체 마운트 epifluorescent 이미징이 보였다 tdTomato 기자 4 연 발 심장의 심 실에서 독점적으로 표현 된다. 유사한 MLC-2v-tdTomato 기자 실의 특정 식 패턴 E16.5에서 해 부 마우스 배아에 표시 했다. 이 방법을 사용 하 여, 우리가 쉽게 마우스 심장 개발 하는 동안 심 실 챔버 형성 아래로 추적할 수 있습니다.
마우스 배아 또는 해 부 개발 심 혼의 전체 마운트 epifluorescent 이미징, 후 우리는 소급 마우스 배아의 머리를 사용 하 여 태아의 유전자 형을 확인 했다. 그림 3A에서볼 수 있듯이 뇌관의 2 세트를 사용 하 여, 우리 PCR 유전형을 수행. 강포한 유형 대립 유전자를 운반 하는 배아 383 bp의 PCR 제품을 F1 R1 뇌관 세트를 사용 하 여 보였다. TdTomato 노크에서 대립 유전자 f 2와 r 2 뇌관을 사용 하 여 497 bp PCR 제품을 보여주었다 들고 배아 설정 (그림 3B). Heterozygous 배아 두는 383으로 정의 된 bp와 487 bp 밴드, 야생 타입 또는 homozygous 유전자 단일 383으로 결정 했다 하는 동안 혈압 또는 497 bp 밴드, 각각.
그림 1입니다. 배아 MLC-2v-tdTomato 기자 쥐 심 혼의 전체 마운트 epifluorescent 이미징 stepwise 실험 절차의 개요. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2입니다. 전체 배아 및 개발 심 혼의 대표 epifluorescent 이미지 MLC-2v-tdTomato 기자 노크에 쥐에서 해 부. 다른 배아 단계에서 전체 마운트 배아 및 해 부 마음 Epifluorescent 이미징 개발 심 혼의 심에서 tdTomato의 구체적인 표현을 보여 줍니다. E8.0에서 (A) 전체 태아, E8.5에서 (B) 전체 태아, E9.0에서 (C) 전체 태아, E10.5에서 (D) 모든 배아, E13.5에서 (E) 전체 태아, E16.5에서 (F) 전체 태아 (G) E9.0, (H에서 배아 심장 ) E10.5, E13.5에서 (내가) 배아 심장 및 E16.5에서 (J) 배아 심장에서 배아 심장. A, 아 트리 움; V, 심 실; IFT, 유입 관; 자주, 유출 요 로입니다. (A\u2012F) 바 규모 = 1 밀리미터; (G-J) 바 규모 500 µ m =. 이 그림은 권한이 있는 참조 # 12에서에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3입니다. MLC-2v-tdTomato 기자 노크에서 배아의 유전형. (A) 유전형 뇌관 디자인의 그림. (B) 대표적인 유전형 f 1와 R1 뇌관 (왼쪽)과 f 2와 r 2 뇌관 (오른쪽)를 사용 하 여 결과. + +: + homozygous: heterozygous,-/-: 야생 타입. Exon: 단백질 합성;에 대 한 필요한 정보를 포함 하는 유전자의 세그먼트 IRES: 내부 리보솜 입장 위치; FRT: flippase recombinase-재결합 대상. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 단계 | 온도 ° C | 시간 | 참고 |
| 1 | 94 | 3 분 | |
| 2 | 94 | 30 s | |
| 3 | 60 | 35 s | |
| 4 | 72 | 35 s | |
| 5 | 2-4 단계를 반복 하 여 38 사이클 | ||
| 6 | 72 | 5 분 | |
| 7 | 10 | 보류 |
표 1: PCR 프로그램 f 1와 R1 뇌관을 사용 하 여
| 단계 | 온도 ° C | 시간 | 참고 |
| 1 | 94 | 3 분 | |
| 2 | 94 | 30 s | |
| 3 | 61.7 | 35 s | |
| 4 | 72 | 35 s | |
| 5 | 2-4 단계를 반복 하 여 38 사이클 | ||
| 6 | 72 | 5 분 | |
| 7 | 10 | 보류 |
표 2: PCR 프로그램 f 2와 r 2 뇌관을 사용 하 여
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Discussion
여기 설명 하는 방법을 심 실 또는 심장 관련 구조 유전자 또는 단백질을 많은 실험을 수행 하지 않고 심 실 챔버 개발 검토를 상대적으로 간단 하다. 따라서,이 메서드는 immunostained 심장 섹션에서 종종 발견 된 기술 variabilities 최소화 합니다.
쥐의 배아 나이 그리고 미 발달 심 혼의 해 부의 정확한 평가 포함 하 여이 메서드를 성공적으로 수행 하기 위한 두 개의 중요 한 단계가 있습니다. 우리는 실질적으로 질을 식별 하 여 생쥐의 배아 나이 여성 쥐에 플러그 예상. 그러나, 질 플러그의 존재는 반드시 임신을 표시 하지 않습니다. 만 성교는 대략 8 ~ 24 h 기간 내 발생 했음을 나타냅니다. 질 플러그를 발견 하는 경우에 그것은 종종 마우스 실제로 임신 여부 10 월 11 일 때까지 게시물 coitum 여성 쥐의 복 부를 검사 하 여 결정 어렵다. 남성 및 여성 쥐의 여러 쌍을 사육 마우스의 예상된 나이 배아를 안전 번 식 전략 이다. 쥐 심 혼 그들의 구조에 중대 한 손해 없이 개발을 분리 하는 것은 정확 하 게 마우스 embryogenesis 그림 1에서 볼 수 있듯이 동안 심장 챔버 개발을 검토 하 중요 합니다. 조심 해 부 해 부 현미경 및 해 부 하기 전에 각 배아 단계에서 발달 심장 해부학을 이해는이 프로토콜을 성공적으로 수행 하는 데 필요 합니다.
MLC-2v-tdTomato 기자 식 E8.0에서 처음 관찰은, 이후 검사는 이전 미 발달 심 혼 관 또는 심장 초승달 단계12수는. 다양 한 기자 마우스 라인 이전 심장 마커 라벨 (예: Mesp1Cre: Rosa26EYFP13, Isl1Cre: Rosa26EYFP13, Hcn4H2BGFP14, Hcn4Cre:로 사 산/mG14, Nkx2-5Cre:로 사 산/mG14, Hcn4 eGFP15 Isl1Cre:로 사 산/mG14및 Nkx2.5Cre: Rosa26tdTomato15, TgMef2c-AHF-GFP16 쥐)이이 문서에 설명 된 방법을 사용 하 여 챔버 개발의 초기 단계를 검사 하는 데 사용할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 작품은 NIH R03 HL140264에 의해 지원 되었다 (Y.-제이 N)와 길 르 앗 과학 연구 학자 프로그램 (Y.-제이 N)입니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| dissecting microscope | Leica | MZ125 | |
| DNA ladder (100 bp) | Promega | G2101 | |
| epifluorescence dissecting microscope | Leica | M165 FC | |
| GoTaq Green master Mix | Promega | M712 | |
| PCR machine (master cycler) | Eppendorf | 6336000023 |
References
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