Summary
Nous présentons les protocoles afin d’examiner le développement de coeur de souris au microscope de toute monture épifluorescente sur des embryons de souris disséqués de ventriculaire spécifiques MLC-2v-tdTomato journaliste souris knock-in. Cette méthode nous permet de directement visualiser chaque étape de la formation ventriculaire au cours du développement de coeur de souris sans fastidieuses méthodes histochimiques.
Abstract
Le but du présent protocole est de décrire une méthode pour la dissection des embryons de souris et la visualisation des cavités ventriculaires embryonnaires de souris au cours du développement de coeur à l’aide de la souris knock-in ventriculaire journaliste fluorescents spécifiques (MLC-2v-tdTomato souris). Développement de coeur implique une formation du tube cardiaque linéaire, le tube de coeur looping et quatre chambre septation. Ces processus complexes sont hautement conservées chez tous les vertébrés. Le coeur embryonnaire de souris a été largement utilisé pour les études sur le développement cardiaque. Toutefois, en raison de leur taille extrêmement petite, coeurs embryonnaires de souris de dissection est techniquement difficile. En outre, visualisation de formation de chambre cardiaque souvent a besoin d’hybridation in situ, bêta-galactosidase, coloration à l’aide de la souris journaliste LacZ ou immunostaining des coeurs embryonnaires sectionnés. Ici, nous décrivons comment disséquer coeurs embryonnaires de souris et de visualiser directement formation chambre ventriculaire du MLC-2v-tdTomato de souris au microscope toute monture épifluorescente. Avec cette méthode, il est possible d’examiner directement la formation du tube cardiaque et une boucle et quatre formation de chambre sans plus loin la manipulation expérimentale des embryons de souris. Bien que la ligne de souris knock-in journaliste MLC-2v-tdTomato est utilisée dans le présent protocole à titre d’exemple, le présent protocole peut être appliqué aux autres lignées de souris transgéniques journaliste fluorescents spécifiques à cœur.
Introduction
Formation de chambre pendant le développement du cœur est un processus complexe qui passe par plusieurs stades embryonnaires morphologiquement distinctes1,2. La forme en croissant de progéniteurs cardiaques de population forme un tube cardiaque linéaire et puis subit une élongation et une boucle pour obtenir la forme de la spirale du coeur en développement. Après son processus de cloisonnement, le coeur en développement se transforme en le cœur à quatre cavités. Interruption de le quelconque de ces processus résulte du développement de cardiopathies congénitales. Ainsi, il est important de comprendre les mécanismes moléculaires qui sous-tendent la formation de la chambre au cours du développement du cœur. Malgré de nombreuses études précédentes sur le développement du cœur, notre compréhension de ce processus complexe reste limitée.
Hybridation in situ, immunohistochimie et bêta-galactosidase LacZ journaliste chez des souris de coloration ont été largement utilisées pour étudier la formation de chambre pendant le développement cardiaque chez la souris par marquage cardiaque spécifique ou une chambre spécifique des gènes de structure ou protéines (p. ex., Ppne, Coup-TFII, Irx4, MLC-2 a et MLC-2v)3,4,5,6,7,8,9,10. Toutefois, ces expériences utilisant des embryons de souris exigent beaucoup de temps et expertise, parce que plusieurs différentes étapes expérimentales doivent être effectuées dans l’ordre de11. Nous décrivons ici une méthode de microscopie épifluorescente de Mont toute simple pour visualiser les ventricules en développement utilisant des embryons disséqués du MLC-2v-tdTomato journaliste souris knock-in12. L’avantage de cette méthode par rapport aux méthodes utilisées précédemment est d’éviter les étapes expérimentales complexes qui peuvent souvent créer des variations expérimentales. L’objectif principal du présent protocole est de décrire comment disséquer des embryons de souris et coeurs en voie de développement et d’examiner chaque étape du développement cardiaque chambre souris sans expériences histochimiques fastidieux. Cette méthode peut être facilement appliquée pour évaluer le développement de coeur à l’aide de divers autres lignées de souris transgéniques étiquetage des marqueurs cardiaques précoces (par exemple, Mesp1Cre : Rosa26EYFP13, Isl1Cre : Rosa26EYFP13, Hcn4H2BGFP14, Hcn4Cre : Rosa mT /mG14, Nkx2-5Cre : Rosa mT/mG14, Hcn4-eGFP15, Isl1Cre : Rosa mT/mG14, Nkx2.5Cre : Rosa26tdTomato TgMef2c-AHF-GFP16 souris et15).
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Protocol
Toutes les procédures d’animaux ont été effectués avec l’approbation du comité de l’emploi et Vanderbilt University Medical Center institutionnels animalier.
1. la collecte des embryons et la dissection de la souris
- S’accouplent MLC-2v-tdTomato+/- souris femelles vieux de 8 à 10 semaine avec MLC-2v-tdTomato+/- souris mâles âgé de 8-10 semaine pour obtenir le MLC-2v-tdTomato+ / +, tdTomato-2v-MLC+/- et MLC-2v-tdTomato- / - embryons.
- Vérifier les barrages pour bouchons vaginales tous les matins. Midi le jour de la détection plug vaginal est considéré comme E0.5.
Remarque : Un examen Vaginal pour détecter un plug vaginal doit être effectué dans la matinée (à moins de 8 à 24 heures après l’activité sexuelle), car un plug vaginal peut être perdu au cours de la journée. - Euthanasier les mères enceintes à des jours différents post coitum (p. ex., E8.5, E10.5 et E12.5) à l’aide de CO2 par inhalation suivie d’une dislocation cervicale.
- Posez les souris en position couchée et pulvériser l’éthanol à 70 % sur l’abdomen de la souris pour éviter la contamination de cheveux de souris au cours de la dissection.
- Ouvrir la cavité abdominale par une incision de la peau et la paroi abdominale à l’aide de ciseaux chirurgicaux tranchants et un instrument.
- Localiser les cornes utérines bilatérales dans la partie dorsale de la cavité abdominale.
- Séparer l’utérus tout en coupant soigneusement au-dessus les oviductes des deux côtés à l’aide de ciseaux chirurgicaux tranchants et un instrument.
- Placer tout l’utérus découpé dans une boîte de pétri avec du PBS glacée de 10 cm et séparer soigneusement chaque sac amniotique le long de la corne utérine à l’aide de ciseaux chirurgicaux tranchants et un instrument.
- Transférer chaque embryon dans les puits individuels de 6 assiette bien remplie avec du PBS glacé à l’aide d’une pipette de transfert.
- Sous un microscope à dissection, ouvrir un sac amniotique et exposer chaque embryon en coupant le cordon ombilical à l’aide de ciseaux chirurgicaux tranchants et un instrument dans un puits individuel d’une plaque 6 puits avec du PBS glacée.
- Couper les tissus embryonnaires extra autant que possibles sans endommager l’embryon à l’aide de ciseaux chirurgicaux tranchants et un instrument.
Remarque : Toute monture épifluorescente imagerie d’embryon de souris entière est habituellement réalisée avant la dissection du coeur en développement tel que décrit ci-dessous. - Couper la tête de l’embryon à l’aide de ciseaux chirurgicaux tranchants et un instrument et transférez dans un tube de 1,5 mL avec 100 µL de tampons A (25 mM EDTA NaOH et 0,2 mM) pour le génotypage à mettre en corrélation avec les résultats de l’imagerie épifluorescence.
- Ouvrir le coffre de l’embryon à l’aide de pinces fines, enlever le cœur hors les poumons et le système vasculaire à l’aide de ciseaux chirurgicaux tranchants et forceps et transférer le coeur embryonnaire disséqué dans un puits d’une plaque bien 12 avec du PBS à l’aide d’une pipette de transfert. Toutes les procédures de dissection sont accomplies sous un microscope à dissection avec un illuminateur microscope optique de fibre.
NOTE : Il est techniquement difficile à décortiquer les coeurs embryonnaires de souris au E8.0 ou E8.5, en raison de leur très petite taille et la structure fragile. Les coeurs embryonnaires précoces (E8.0 et E8.5) peuvent être examinés au sein de l’embryon de support entier sans dissection.
2. ensemble-Mont épifluorescence imagerie
- Placer la plaque bien 12 avec coeurs embryonnaires de souris sous un épifluorescente binoculaire.
- Sous une épifluorescence binoculaire à l’aide de pinces fines, placez le coeur embryonnaire de telle sorte que les ventricules en voie de développement sont situés à proximité de l’examinateur.
- Ajuster la mise au point de l’image à l’aide d’un objectif x 0.63 (gamme de zoom entre 3,15 x et 18,9 x) en mode de champ lumineux.
- Prendre les expositions champ lumineux et saisir des images multiples. Les images ont été habituellement obtenus par une seconde exposition. Toutefois, des temps d’exposition peuvent varier selon l’éclairage et appareil photo specificationss et doivent être optimisées pour chaque configuration.
- Désactiver un illuminateur microscope optique de fibre et positionnez le filtre rouge par fluorescence (Ex545 nm/Em 605 nm) visualiser l’expression tdTomato.
- Réglez à nouveau mise au point de l’image si nécessaire.
- Ajuster la luminosité et le contraste, prendre des expositions fluorescentes rouges et saisir des images multiples.
Remarque : Le paramètre d’image suivant a été utilisé habituellement : le temps de l’exposition s 1, 2 x gain 1,0 saturation et correction gamma de 1,0. Le réglage optimal doit être optimisée pour chaque expérience. Une fois le réglage optimal est déterminé, le même paramètre doit être utilisé pour une expérience complète.
3. génotypage
- Faire bouillir les échantillons à l’étape 1.12 pendant 1 h à 100 ° C.
- Centrifuger pendant 2 min à 11 360 x g, transférer 20 µL du surnageant dans un nouveau tube de 1,5 mL avec 20 µL de tampon B (40 mM Tris HCl, pH 5,5) et mélangez-les.
- Prendre 4,5 µL du surnageant mixte de l’étape 3.2 comme une matrice d’ADN, combinez-le avec 0,5 µL de chacune des spécifique avant et inverse des amorces (10 µM), 10 µL de tampon polymérase et réaction prémélangé (x 2) (voir la Table des matières), puis ajoutez l’eau à un total v olume de 20 µL. séquences d’amorces sont comme ci-dessous.
F1 : 5'-TACCCACGGAGAAGAGAAGGACT-3'
R1 : 5'-TGGACTTCTTGGAACTGACTCTGT-3'
F2 : 5'-ACGGCACGCTGATCTACAAGGT-3'
R2 : 5'-TTTGCGCACAGCCCTGGGAT-3' - Lancer une réaction en chaîne par polymérase (PCR) avec le programme PCR suivant (tableau 1 et tableau 2).
- Exécuter des PCR échantillons et échelle d’ADN sur un gel d’agarose de 1 % à 140 V en 1 x TAE (Tris-acétate-EDTA) tampon (40 mM Tris-acétate et EDTA 1 mM) pendant 25 min. utilisent une échelle d’ADN bp 100 pour estimer la taille des bandes PCR.
- Placer le gel ADN sur un transilluminateur UV pour identifier les bandes d’ADN et d’allumer la lampe à UV lumière.
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Representative Results
Au cours du développement du cœur, MLC-2v est considéré comme le premier marqueur pour chambre ventriculaire spécification17. Comme illustré à la Figure 1, nous avons disséqué les embryons entiers de souris et coeurs embryonnaires de souris MLC-2v-tdTomato journaliste knock-in et examiné MLC-2v-tdTomato expression du rapporteur au cours du développement du cœur. Dans souris mise knock-in journaliste MLC-2v-tdTomato, expression constitutive tdTomato en plein développement est visualisée par épifluorescence support entier imagerie dès à E8.012 (Figure 2). Relativement faible expression de tdTomato dans le tube de coeur linéaire à E8.0 devient plus forte au E8.5. À E10.5, expression du rapporteur MLC-2v-tdTomato a été démontrée dans la partie ventricule du cœur disséqué en boucle d’un embryon de souris entière, alors qu’il ne figurait pas dans les voies d’entrée, les voies de sortie ou les oreillettes futures. E12.5-E13.5, toute monture épifluorescente imagerie du cœur disséqué d’embryon de souris knock-in journaliste MLC-2v-tdTomato ont montré que le journaliste tdTomato est exclusivement exprimé dans les ventricules du coeur quatre-chambré. Le même modèle de ventriculaire expression spécifique du MLC-2v-tdTomato reporter a été montré chez l’embryon de souris disséquée à E16.5. En utilisant cette méthode, nous pouvons facilement traquer formation chambre ventriculaire au cours du développement de coeur de souris.
Après toute monture épifluorescente imagerie des embryons de souris ou disséqués coeurs en voie de développement, nous avons confirmé a posteriori le génotype de l’embryon à l’aide de la tête des embryons de souris. À l’aide de deux ensembles d’amorces comme illustré dans la Figure 3 a, nous avons réalisé des ACP genotyping. Les embryons porteurs de l’allèle de type sauvage a montré un produit PCR bp 383 à l’aide de la F1 et R1 d’amorces. Les embryons porteurs du tdTomato knock-in allèle a montré le produit PCR bp 497 à l’aide de l’apprêt F2 et R2 défini (Figure 3 b). Embryons hétérozygotes ont été définis en montrant les deux le 383 bp et les bandes de bp 487, tandis que le type sauvage ou génotype homozygote a été déterminé en démontrant une seule 383 bp, soit 497 bp bande, respectivement.
Figure 1. Contour du gradué expérimentale pour l’imagerie toute monture épifluorescence des embryonnaires cœurs du MLC-2v-tdTomato journaliste souris. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2. Images représentant épifluorescence des embryons entiers et les cœurs en développement dissection de souris MLC-2v-tdTomato journaliste knock-in. Épifluorescente imagerie d’embryons de support entier et découpé des coeurs à différents stades embryonnaires montre une expression spécifique de tdTomato dans les ventricules de développer des coeurs. (B) tout embryon à E8.5, embryon entier (C), à E9.0, embryon entier (D), à E10.5, embryon, tout (E) à E13.5, embryon entier (A), à E8.0, embryon entier (F), à E16.5, (G) coeur embryonnaire à E9.0, (H ) Coeur embryonnaire à E10.5, (je) embryonnaire coeur à E13.5 et le coeur embryonnaire (J) à E16.5. Un, atrium ; V, ventricule ; IFT, voies d’entrée ; SOUVENT, les voies de sortie. L’échelle bar (A\u2012F) = 1 mm ; L’échelle bar (G-J) = 500 µm. Ce chiffre a été modifié par référence #12 avec permission. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3. Génotypage du MLC-2v-tdTomato journaliste knock-in embryons. (A) Illustration de la conception d’amorce de génotypage. Génotypage représentatif (B) les résultats à l’aide d’amorces F1 et R1 (à gauche) et amorces F2 et R2 (à droite). + / + : homozygote, +/- : hétérozygote,- / - : type sauvage. Exon : un segment d’un gène qui contient les informations nécessaires à la synthèse des protéines ; IRES : Site d’entrée ribosome interne ; FRT : flippase recombinase -recombinaison cible. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
| Étape | Température ° C | Temps | Remarque |
| 1 | 94 | 3 min | |
| 2 | 94 | 30 s | |
| 3 | 60 | 35 s | |
| 4 | 72 | 35 s | |
| 5 | Répétez les étapes 2 à 4 pour 38 cycles | ||
| 6 | 72 | 5 min | |
| 7 | 10 | Maintenez |
Tableau 1 : Programme PCR avec des amorces F1 et R1
| Étape | Température ° C | Temps | Remarque |
| 1 | 94 | 3 min | |
| 2 | 94 | 30 s | |
| 3 | 61,7 | 35 s | |
| 4 | 72 | 35 s | |
| 5 | Répétez les étapes 2 à 4 pour 38 cycles | ||
| 6 | 72 | 5 min | |
| 7 | 10 | Maintenez |
Tableau 2 : Programme PCR avec des amorces F2 et R2
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Discussion
La méthode décrite ici est relativement simple d’examiner le développement chambre ventriculaire, sans effectuer des expériences à forte main-d'oeuvre pour étiqueter ventriculaires ou cardiaque spécifique des gènes de structure ou de protéines. Ainsi, cette méthode minimise les variabilités techniques qui souvent trouvées dans les sections de cœur immunostained.
Il y a deux étapes cruciales pour réaliser avec succès cette méthode notamment l’évaluation précise de l’âge embryonnaire de souris et dissection du cœur embryonnaire. Pratiquement, nous estimons l’âge embryonnaire des souris en identifiant vaginale bouchons chez les souris femelles. Toutefois, la présence d’un bouchon vaginal n’indique pas nécessairement une grossesse. Il indique seulement que les rapports sexuels ont eu lieu dans un délai approximatif de 8 à 24 h. Même si les bouchons vaginales sont trouvent, il est souvent difficile de déterminer si les souris sont en effet enceintes ou pas jusqu'à 10-11 jours post coitum en examinant l’abdomen de la souris mâle. Plusieurs couples de souris mâles et femelles reproducteurs est une stratégie de sélection sûre d’obtenir l’âge attendu de la souris des embryons. Il est essentiel d’examiner avec précision développement chambre cardiaque durant l’embryogenèse de souris comme illustré à la Figure 1d’isoler coeurs souris sans dommages importants à leurs structures de développement. Une dissection minutieuse sous un binoculaire et la compréhension du développement anatomie cardiaque à chaque stade embryonnaire avant la dissection sont nécessaires pour réaliser avec succès ce protocole.
Étant donné que l’expression du rapporteur MLC-2v-tdTomato on observe tout d’abord à E8.0, il n’est pas possible d’examiner l’antérieure coeur embryonnaire tube ou cardiaque crescent étape12. Les différentes lignes de souris journaliste étiquetage antérieures marqueurs cardiaques (par exemple Mesp1Cre : Rosa26EYFP13, Isl1Cre : Rosa26EYFP13, Hcn4H2BGFP14, Hcn4Cre : Rosa mT/mG14, Nkx2-5Cre : Rosa mT/mG14, Hcn4-eGFP15 Isl1Cre : Rosa mT/mG14et Nkx2.5Cre : Rosa26tdTomato15, souris16 TgMef2c-AHF-GFP) peut être utilisé pour examiner les premiers stades de développement de chambre à l’aide de la méthode décrite dans cet article.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par les NIH R03 HL140264 (Y.-J. N) et Gilead Sciences Research Scholar Program (Y.-J. N).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| dissecting microscope | Leica | MZ125 | |
| DNA ladder (100 bp) | Promega | G2101 | |
| epifluorescence dissecting microscope | Leica | M165 FC | |
| GoTaq Green master Mix | Promega | M712 | |
| PCR machine (master cycler) | Eppendorf | 6336000023 |
References
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