Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

تعزيز مراقبة داء الكلب باستخدام اختبار سريع مباشر للمناعة الكيميائية

Published: April 30, 2019 doi: 10.3791/59416
Automatic Translation
1, 2, 3, 4, 4, 5
1Animal and Plant Health Inspection Service (APHIS), Wildlife Services, Knoxville, TN, United States Department of Agriculture (USDA), 2Animal and Plant Health Inspection Service (APHIS), Wildlife Services, Sutton, MA, United States Department of Agriculture (USDA), 3Animal and Plant Health Inspection Service (APHIS), Wildlife Services, Milton, FL, United States Department of Agriculture (USDA), 4Animal and Plant Health Inspection Service (APHIS), Wildlife Services, Concord, NH, United States Department of Agriculture (USDA), 5Lyssa LLC

Summary

يوفر الاختبار المناعي المناعي السريع المباشر (DRIT) بديلاً معترفاً به من قبل المنظمة العالمية لصحة الحيوان ومنظمة الصحة العالمية (OIE/WHO) لاختبار الأجسام المضادة الفلورية المباشرة (DFA) لتشخيص داء الكلب. يسمح هذا الاختبار للتطبيقات الميدانية التي يمكن تنفيذها في حوالي 1 ساعة على انطباعات الدماغ باستخدام الفحص المجهري الخفيف.

Abstract

والمراقبة المختبرية جزء لا يتجزأ من جهود الوقاية من داء الكلب ومكافحته وإدارته. وفي حين أن وزارة الخارجية هي المعيار الذهبي لتشخيص داء الكلب، فإن هناك حاجة إلى التحقق من صحة تقنيات التشخيص الإضافية لتحسين مراقبة داء الكلب، ولا سيما في البلدان النامية. هنا، نقدم بروتوكول قياسي لDRIT كخيار اختبار بديل أو مختبري أو ميداني يستخدم الفحص المجهري الخفيف مقارنة بـ DFA. يتم إصلاح انطباعات اللمس من أنسجة الدماغ التي تم جمعها من الحيوانات المشتبه بها في 10٪ رسميا. يستخدم DRIT أجسام مضادة أحادية النسيلة أو متعددة النسيلة خاصة بفيروس الكلب (مترافقة مع البيوتين)، وأنزيم streptavidin-peroxidase، ومراسل كروموجين (مثل أسيتيل 3-أمينو-9-إيثيلكاربازول) للكشف عن التضمينات الفيروسية داخل الأنسجة المصابة. في حوالي 1 ساعة، يمكن اختبار عينة أنسجة الدماغ وتفسيرها من قبل DRIT. وقد أظهر تقييم العقول الحيوانية المشتبه فيها التي تم اختبارها من مجموعة متنوعة من الأنواع في أمريكا الشمالية وآسيا وأفريقيا وأوروبا حساسية عالية وخصوصية من قبل DRIT تقترب 100٪ مع النتائج مقارنة مع DFA. منذ عام 2005، قام برنامج خدمات الحياة البرية التابع لوزارة الزراعة في الولايات المتحدة بجهود معززة واسعة النطاق لمراقبة داء الكلب باستخدام DRIT لاختبار > 94,000 عينة تم جمعها من الحياة البرية في مناطق إدارة داء الكلب الاستراتيجية . يوفر DRIT أداة قوية واقتصادية لتشخيص داء الكلب التي يمكن استخدامها من قبل العاملين وعلماء الأحياء الميدانية لتحسين مراقبة داء الكلب الحالي، وبرامج الوقاية والسيطرة على الصعيد العالمي.

Introduction

في حين أن DFA هو الاختبار الأكثر استخداما لتشخيص داء الكلب الروتيني1،فإن تكلفة شراء وصيانة المجهر الفلورسنت يمكن أن تكون محدودة للدول النامية2،3،4 وعلى نطاق واسع، برامج مراقبة داء الكلب على نطاق واسع3و4. وبالإضافة إلى ذلك، فإن وزارة الخارجية تتطلب القدرة على تبريد العينات أثناء التثبيت واحتضان العينات فوق درجة الحرارة المحيطة أثناء تفاعلات مستضد الأجسام المضادة، والتي يمكن أن تشكل عقبة كبيرة في البلدان التي لا توجد فيها بنية تحتية مناسبة. ويرجع ذلك جزئيا إلى القيود المرتبطة باختبارات DFA الحديثة، وقد تم التقليل من الأثر العالمي لداء الكلب منذ فترة طويلة5.

وفي هذا الصدد، هناك حاجة إلى التحقق من صحة تقنيات التشخيص الإضافية لتحسين مراقبة داء الكلب على الصعيد العالمي، ولا سيما في البلدان النامية. يوفر بروتوكول DRIT المعروض هنا بديلاً مختبرياً أو ميدانياً للاختبار على بروتوكول DFA يستخدم الفحص المجهري الخفيفولا يتطلب التبريد أو الحضانة المختبرية أثناء الاختبار 6. DRIT وDFA متشابهة في أن كلا الأسلوبين استخدام انطباعات اللمس من عينات الدماغ التي تم جمعها من الحيوانات التي يحتمل أن تكون مسعورة. ومع ذلك، فإن الخطوة الأولى من DRIT يستخدم formalin كالمثبت التاريخي للعينات، مما يعطل فيروس داء الكلب. وهذا يوفر تحسنا كبيرا في السلامة الأحيائية على الأسيتون المستخدم لإصلاح العينات في بروتوكول DFA3، وهو أمر مهم ليس فقط في المختبر ولكن ربما أكثر من ذلك في بيئات المختبر الميدانية أو اللامركزية. حتى الآن، يظهر DRIT حساسية وخصوصيةمساوية لDFA 2،7،8،9.

منذ عام 2005، قام برنامج WS التابع لوزارة الزراعة الأميركية بجهود مراقبة داء الكلب المعززة على نطاق واسع في أمريكا الشمالية باستخدام DRIT كجزء من برنامج شامل لإدارة داء الكلب البرية 10. يتم استخدام مراقبة داء الكلب المعززة كتكملة لمراقبة الصحة العامة القائمة على التعرض والاختبارات في المقام الأول أنواع الحيوانات البرية meso-carnivore، بما في ذلك الراكون(Procyon lotor)،الظربان المخطط (mephitismephitis)،الثعالب الرمادية ( Urocyon cinereoargenteus)، الثعالب الحمراء(الفرجالفرج) ، والقيوط (كانيسلاترانس)التي لم تشارك في التعرض للحيوانية البشرية أو المنزلية. وقدمت جثث الحيوانات المستخدمة في الاختبار إلى وزارة الزراعة الأمريكية WS من خلال جهود تعزيز مراقبة داء الكلب وتتألف من أنواع ناقلات داء الكلب التي هي: سوء أو غريب التمثيل; العثور على القتلى ، وقتل على الطرق ، أو مصدر إزعاج ؛ ولا ترتبط بتعرض الحيوانات البشرية أو المنزلية. يوفر DRIT اختبار تشخيص داء الكلب التي يمكن استخدامها من قبل علماء الأحياء الميدانية المدربين مع خبرة مختبرية قليلة أو معدومة لتحسين مراقبة داء الكلب والحد من العبء المالي وعبء العمل من مختبرات تشخيص الصحة العامة10. عادة ما يستغرق التدريب الأساسي لـ DRIT للموظفين الميدانيين في وزارة الزراعة الأميركية من 1.5 إلى 2 يومًا، والذي يتضمن حوالي 4 ساعات من التعليم في الفصول الدراسية الذي يغطي المبادئ الأساسية للسلامة البيولوجية، وطرق جمع العينات وعمليات DRIT، فضلاً عن >8 ساعة من وقت المختبر إجراء الاختبار. وقد أتيحت فرص التدريب لوزارة الزراعة الأميركية والمتعاونين في البرنامج من خلال مراكز مكافحة الأمراض والوقاية منها (CDC)، LYSSA LLC، ومعهد ويستار.

وفي مناطق الإدارة الاستراتيجية، قامت وزارة الزراعة الأمريكية باختبار أكثر من 94,000 عينة من الحيوانات البرية باستخدام DRIT واكتشفت أكثر من 1,850 عينة مسعورة من المرجح أن تكون قد لم يتم اكتشافها بالاعتماد فقط على اختبارات الصحة العامة للالحيوانات المشتبه فيها. تعزيز بيانات مراقبة داء الكلب التي توفرها نتائج DRIT حاسمة لتوفير تمثيل زمني ومكاني أكثر اكتمالا لداء الكلب في المناظر الطبيعية دعما لبرامج التطعيم عن طريق الفم ضد داء الكلب للحياة البرية في جميع أنحاء الولايات المتحدة الأمريكية10، 11. وبالمثل، أدرجت وكالات الحياة البرية الإقليمية في كندا DRIT في جهود مراقبة داءالكلب البري على نطاق واسع جنبا إلى جنب مع برامجها للصحة العامة بنجاح 8. وقد استخدمت كل من وزارة الزراعة الأمريكية WS والكندية DRIT برامج المراقبة المختبرات المرجعية الوطنية لتأكيد داء الكلب من قبل DFA وأداء البديل الفيروسي ة الكتابة حسب الاقتضاء8. وعلاوة على ذلك، يرسل علماء الأحياء الميدانيون التابعون لوزارة الزراعة الأمريكية 10% من العينات السلبية لتأكيد DFA إلى المختبرات المرجعية، ومنذ عام 2008، شاركوا في اختبار الكفاءة نصف السنوي لـ DRIT الذي يقدمه مختبر ولاية ويسكونسن للنظافة الصحية، كجزء من المعايير تدابير ضمان الجودة.

والهدف من هذه الطريقة هو تقديم نهج بديل لاختبار تشخيص داء الكلب الذي يمكن القيام به في المختبرات اللامركزية، في الميدان، أو في المناطق التي لا يمكن الوصول إليها بشكل روتيني إلى المجهر الإلكتروني.

Protocol

وينبغي أن يتلقى كل شخص يجري اختبارات تشخيصية لداء الكلب سلسلة تطعيم قياسية قبل التعرض لداء الكلب وأن يخضع لتقييم منتظم للأجسام المضادة المصلية، مع التحصينات المعززة حسب الحاجة. ولا ينبغي للأفراد الذين لا يُعون عددهم أن يدخلوا المختبرات أو المناطق التي يُضطلع فيها بهذا العمل. وينبغي إجراء جميع أنواع التلاعب بالأنسجة والشرائح لعدم الهباء الجوي للسوائل أو إنتاج جزيئات محمولة جواً. أغطية الدخان ليست مطلوبة ولكن عندما يكون ذلك ممكنا أنها يمكن أن توفر حماية إضافية من الروائح، والطفيليات الخارجية، وشظايا العظام. وينبغي ارتداء الحد الأدنى من معدات الحماية الشخصية، بما في ذلك القفازات وحماية العين، في جميع الأوقات أثناء جمع العينات واختبارها.

1. مجموعة جذع الدماغ

  1. جمع عينات جذع الدماغ إما على الفور عند جمع الذبيحة أو التأكد من أن يتم وضع الذبيحة في الثلاجات للتخزين حتى وقت لاحق اختبار. إذا تم تجميد الذبيحة الحيوانية، ذوبان في درجة الحرارة المحيطة قبل جمع جذع الدماغ لسهولة جمع. في بعض الظروف، يتم جمع العينات مباشرة من الحيوانات المجمدة.
  2. بالنسبة للالحيوانات التي يتم جمعها حديثًا أو التي تم إذابتها إلى درجة الحرارة المحيطة، ضع السوبين الحيواني على سطح مستو مع العمود الفقري العنقي الذي يدور قليلاً نحو الفاحص. Palpate لتحديد المفصل الأكانتو القذالي على الجانب الجانبي للعمود الفقري العنقي.
    1. للجثث التي لا تزال مجمدة تماما، ووضع supine الحيوان كما هو موضح أعلاه، إذا كانت عملية. استخدام المناشير والسكاكين والمقصات العظام أو معدات مماثلة لفصل الرأس تماما من الجسم.
      ملاحظة: وينبغي تنظيف جميع المعدات المستخدمة التي لا تستخدم لمرة واحدة بدقة بين العينات.
  3. باستخدام شفرة مشرط، قم بإجراء شق على مستوى المفصل القذالي الأكانتو في الجانب البطني، وقطع جميع طبقات العضلات والأنسجة الرخوة، بما في ذلك القصبة الهوائية والمريء. استمر حتى تقريب الجانب الأمامي من فقرات العمود الفقري العنقي. للأنسجة المجمدة، استخدم شفرة مشرط لإزالة أي طبقات متبقية من العضلات والأنسجة الرخوة لفضح ماغنوم اللبو.
  4. نقل رأس الحيوان إلى تمديد المدى النهائي حتى جذع الدماغ مرئية. استخدم شفرة مشرط لإزالة جميع أنسجة جذع الدماغ/الجهاز العصبي المركزي المرئية لأخذ العينات. للحصول على عينة مجمدة، استخدم شفرة مشرط لإزالة أكبر قدر ممكن من أنسجة جذع الدماغ/الجهاز العصبي الوطني المجمدة من داخل الجمجمة.
  5. وضع عينات جذع الدماغ في حاوية غير قابلة للكسر (أي القصدير مرهم معدني، القارورة بالتبريد، وما إلى ذلك) والتسمية وفقا لذلك.
  6. تأكد من أن عينات جذع الدماغ يتم اختبارها مباشرة بعد جمعها عن طريق اختبار DRIT، المبردة (4 درجة مئوية) لمدة تصل إلى 24 ساعة قبل الاختبار، أو المجمدة (-20 درجة مئوية) حتى وقت الاختبار إذا كان الاختبار سيتم أكثر من 24 ساعة بعد جمع العينة.

2. إعداد المواد لDRIT

  1. إعداد 10 أطباق تلطيخ الشرائح (الشكل 1)
    ملاحظة: أطباق تلطيخ عميقة بما فيه الكفاية للسماح لغمر كامل من الشريحة (قطرها 96 ملم، وارتفاع 72 ملم، وعمق 42 ملم، وحجم 250 مل). 6
    1. ملء طبق 1 مع 10٪ الفوسفات المخزنة رسميان المخزنة. استبدال الفورماين بعد 2 تشغيل الاختبار أو أسبوعيا.
    2. ملء الأطباق 2، 4، و 5 مع الفوسفات المخزنة المالحة مع 1٪ توين-80 (TPBS). يستعاض عنها بـ TPBS جديدة قبل كل اختبار.
    3. ملء طبق 3 مع بيروكسيد الهيدروجين 3٪. استبدال بيروكسيد الهيدروجين قبل كل اختبار.
    4. ملء الأطباق 6 و 8 و 9 و 10 مع الماء المقطر أو منزوع الأيونات. استبدال الماء قبل كل اختبار.
    5. ملء طبق 7 مع صياغة هيماتوإكسلين جيل #2 المخفف ة في نسبة 1:1 في الماء المقطر6. استبدال هيماتوإكسلين بعد 2 أشواط الاختبار أو أسبوعيا.
      ملاحظة: وفقا لبروتوكول DRIT الأصلي التي وضعتها CDC12، يمكن استخدام نسبة 1:2 من الخلل هيماتوإكسيلين إلى الماء إذا كان التلطيخ المضاد مظلما جدا.
  2. إعداد محلول الأسهم الأمينية-إيثيلكاربازول (AEC)
    1. باستخدام ماصة زجاجية، ضع 5 مل من N، N-dimethylformamide في وعاء زجاجي.
    2. إضافة قرص واحد 20 ملغ من 3-أمينو-9-إيثيلكاربازول ويهز حتى يذوب تماما. تسمية جرة مع "AEC الأسهم" وتاريخ إجراء الأسهم.
      ملاحظة: يمكن تخزين محلول مخزون AEC تحت التبريد (4 درجة مئوية) واستخدامه لمدة 1-2 أشهر.
  3. إعداد تخفيف عمل الجماعة الاقتصادية الأفريقية
    1. إضافة 7 مل من العازلة خلات إلى أنبوب الطرد المركزي 15 مل.
    2. باستخدام ماصة زجاجية، أضف 0.5 مل من محلول مخزون AEC إلى أنبوب الطرد المركزي.
    3. إضافة 0.075 مل من بيروكسيد الهيدروجين 3٪ إلى الأنبوب.
    4. تصفية الحل باستخدام حقنة 10 مل باستخدام فلتر حقنة 0.45 ميكرومتر.
      ملاحظة: يجب إنشاء تخفيف العمل AEC فقط قبل كل اختبار DRIT كما أنها مستقرة فقط لمدة 2-3 ساعة.

3. اختبار الكيمياء المناعية السريعة المباشرة

  1. تسمية الزجاج المجهر الشرائح مع عدد فريد من نوعه لكل عينة باستخدام مسحة واقية، للماء، علامة الحبر الدائم.
    1. باستخدام شفرة مشرط، قم بإزالة جذع الدماغ من الحاوية ومكانه على منشفة ورقية. لطخة بلطف بعيدا أي فائض من السوائل, الدم, أو الفراء مع منشفة ورقية ثانية للكشف عن الأنسجة الجذعية للدماغ فقط13. إذا لزم الأمر، قسم أنسجة جذع الدماغ للكشف عن مقطع عرضي.
    2. لمس بلطف جدا الشريحة المجهر إلى المقطع العرضي من أنسجة جذع الدماغ. لمس الشريحة إلى جذع الدماغ في عدة نقاط دون حركة جانبية للسماح لمناطق متعددة من جذع الدماغ ليتم نقلها إلى الشريحة13. تأكد من نقل 1 أو 2 طبقات فقط من الخلايا من أنسجة الدماغ إلى الشريحة بلمسة لطيفة. لا حاجة إلى عامل تصاعد لتثبيت أنسجة جذع الدماغ إلى الشرائح. تضمين كل من عنصر تحكم إيجابي وسلبي في كل تشغيل DRIT.
  2. اسمحوا الشرائح الهواء الجاف لمدة 5 دقائق تقريبا في درجة حرارة الغرفة.
  3. تزج الشرائح في 10٪ الرسمي المخزنة لمدة 10 دقيقة (طبق 1).
  4. إزالة الشرائح من شكلي وشطف تراجع في حل TPBS (الطبق 2).
  5. تزج الشرائح في بيروكسيد الهيدروجين 3٪ لمدة 10 دقائق (طبق 3).
  6. إزالة الشرائح من بيروكسيد الهيدروجين وتراجع شطف في TPBS الطازجة (الطبق 4). بعد إزالة بيروكسيد الهيدروجين الزائد، ضع الشرائح في TPBS الطازجة (الطبق 5) والعمل مع شريحة واحدة في وقت واحد في حين أن الشرائح الأخرى تبقى مغمورة في TPBS.
  7. تأخذ الشرائح من TPBS (طبق 5) واحد في وقت واحد، ويهز قبالة ووصمة عار العازلة الزائدة، ووضعها على منشفة ورقية مبللة على مقاعد البدلاء المختبر، كأساس ل "غرفة الرطوبة". باستخدام ماصة، إسقاط ما يكفي من الأجسام المضادة لفيروس مكافحة داء الكلب الأولية على كل شريحة لتغطية أنسجة الجهاز العصبي الوطني. احتضان الشرائح لمدة 10 دقيقة في غرفة الرطوبة (أي، تغطي الشرائح مع لوحات جيدة أو غيرها من غطاءبسيط أثناء وضعها على منشفة ورقية مبللة) في درجة حرارة الغرفة (الشكل 2).
  8. إزالة الشرائح من غرفة الرطوبة، يهز ووصمة عار قبالة conjugate الزائدة، وتراجع شطف الشرائح في TPBS (إعادة استخدام نفس TPBS في الطبق 5).
  9. العمل مع شريحة واحدة في وقت واحد، في حين أن آخرين البقاء مغمورة في TPBS - استخدام ماصة لإسقاط ما يكفي من مجمع streptavidin-بيروكسيداز لتغطية أنسجة الجهاز العصبي المركز. حضانة في غرفة الرطوبة لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  10. إزالة الشرائح من غرفة الرطوبة، يهز ووصمة عار قبالة مجمع الزائدة، وتراجع شطف الشرائح في TPBS (الطبق 5).
  11. العمل مع شريحة واحدة في وقت واحد، والتخلص من ووصمة عار المخزن المؤقت الزائد، في حين أن آخرين البقاء مغمورة في TPBS - استخدام ماصة لإسقاط ما يكفي من AEC (يتم شرح التحضير أعلاه، وينبغي أن يتم ذلك مباشرة قبل الاستخدام) لتغطية أنسجة الجهاز العصبي المركز. حضانة في غرفة الرطوبة لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  12. تراجع شطف الشرائح في الماء المقطر (طبق 6).
  13. ضع الشرائح في طبقة مضادة من جيل هيماتوكسيلين (مخفف1:1 مع الماء المقطر) لمدة دقيقتين (الطبق 7).
  14. على الفور تراجع شطف جميع الشرائح في الماء المقطر (طبق 8). كرر مرتين مع المياه العذبة في كل مرة (أطباق 9 و 10).
  15. العمل مع شريحة واحدة في وقت واحد، في حين أن الآخرين البقاء مغمورة في الماء المقطر (الطبق 10) - يهز ووصمة عار من الماء الزائد واستخدام وسيلة تركيب قابلة للذوبان في الماء لتثبيت زلة غطاء.
  16. استخدام المجهر الخفيف مع هدف 20X لعرض الشرائح والهدف 40X إذا كان هناك حاجة إلى فحص أوثق.

Representative Results

تظهر النتائج الإيجابية من DRIT التضمينات الفيروسية الحمراء intracytoplasmic التي يمكن أن تختلف في الشكل والحجم (الشكل 3) داخل السيتوبلازم من أجسام الخلايا المزرقة. تظهر التضمينات ناعمة مع هوامش مشرقة جداً ومنطقة مركزية أقل كثافة. يتم تسجيل الكثافة وتوزيع المستضد عند الكشف عن التضمينات. يتم تقدير الكثافة من +4 إلى +1. يجب أن يكون الشريحة التحكم الإيجابي مكثفة, تألق أرجواني صارخ الذي يشار إليه على أنه +4 كثافة. يمكن أن يحدث فقدان طفيف للون خاصة عندما لم يكن التعامل مع العينة الأمثل (أي أن الأنسجة عينة قد تحللت قليلا) وينبغي تصنيف هذه على أنها +3. يتم تصنيف وصمة عار مملة بشكل ملحوظ على أنها +2 إلى +1، لا تعتبر تشخيصية للعدوى بفيروس داء الكلب ووصفت بأنها غير محددة.

بالإضافة إلى ذلك، يتم تصنيف توزيع المستضد من +4 إلى +1 مع +4 الذي يمثل توزيع المستضد اتّصل بوفرة من التضمينات الكبيرة والصغيرة التي تختلف في الحجم والشكل، وموجودة في كل مجال (أو كل حقل تقريبًا) من العرض داخل أنسجة الجهاز العصبي الوطني لمس الانطباع. يحتوي عنصر التحكم الإيجابي عادةً على توزيع مستضد +4. سيتم تعيين توزيع مستضد +3 عندما تكون هناك تضمينات في مجموعة متنوعة من الأحجام في معظم مجالات العرض وليس كلها. إذا تم العثور على التضمينات في 10٪ -50٪ من حقول المجهر، يتم تعيين توزيع مستضد +2. عند العثور على التضمينات في <10% من حقول المجهر، يتم تعيين توزيع مستضد +1.

معظم أنسجة الجهاز العصبي الوطني مع فيروس داء الكلب الحالية تظهر التضمينات الفيروسية النموذجية التي تم تصنيفها على أنها +3 أو +4 كثافة وتوزيع مستضد. إذا كانت النتائج تشير إلى كثافة +2 أو +1 أو توزيع مستضد +2 أو +1، يتم تعريف العينة "غير محدد" ويكون هناك ما يبرر تكرار الاختبار. إذا كانت نفس العينة لديها نتيجة اختبار غير محددة تكرار، يجب إرسال العينة إلى مختبر مرجعي لDFA أو الاختبارات التأكيدية ذات الصلة.

تعتبر عينة الاختبار التي تستخدم DRIT سلبية لمستضدات فيروس داء الكلب بعد مسح الشريحة التي تحتوي على أنسجة الجهاز العصبي الوطني عندتكبير 200X أو أكثر ولم يتم الكشف عن أي إدراجات فيروس نموذجية (الشكل 4). عينات سلبية تظهر أجسام الخلايا مزرق مع تلطيخ قليلا أو لا محددة.

Figure 1
الشكل 1: إعداد 10 أطباق تلطيخ الشرائح مع الكواشف للاختبار. يتم تسمية الأطباق مع اسم كاشف في الترتيب اللازم لمتابعة البروتوكول. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: غرفة الرطوبة بسيطة تم إنشاؤها باستخدام منشفة ورقية مبللة ولوحات ثقافة الخلية.  غرفة الرطوبة بسيطة باستخدام منشفة ورقية مبللة ولوحات ثقافة الخلية يسمح للتطبيق الميداني.  الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: الشرائح التمثيلية لداء الكلب التضمينات الفيروسية الإيجابية مع +4 كثافة وتوزيع مستضد +4. (A و B)تظهر التضمينات الفيروسية داء الكلب إيجابية في التكبير 200x. (C و D)تظهر التضمينات الفيروسية داء الكلب إيجابية في التكبير 400x. قضبان مقياس = 5 ميكرومتر.

Figure 4
الشكل 4: شرائح تمثيلية من العينات السلبية مع عدم وجود شوائب فيروسية داء الكلب. (A و B)تظهر عينات سلبية لالشموة الفيروسية داء الكلب في التكبير 200x. (C و D)تظهر عينات سلبية لالشموة الفيروسية داء الكلب في التكبير 400x. قضبان مقياس = 5 ميكرومتر.

Figure 5
الشكل 5: الصور التمثيلية لمرافق اختبار DRIT التي تستخدمها وزارة الزراعة الأمريكية WS. (أ) مرفق اختبار متنقل في مقطورة مغلقة للنقل. (ب) مركبة ترفيهية تم تعديلها لاختبار DRIT. (ج) مرفق اختبار DRIT بالتعاون مع مختبر الجامعة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

وDRIT هو طريقة مرنة مناسبة للمراقبة الميدانية للكشف عن وجود فيروس داء الكلب التي يمكن استخدامها في مناطق المختبرات اللامركزية. في حين أنه من الممكن إجراء الاختبار بأكمله في بيئة ميدانية مثل على الباب الخلفي للشاحنة، فمن المثالي أن يكون هناك مساحة داخلية صغيرة مخصصة لDRIT بسبب المواد الكيميائية والمعدات وقضايا تخزين الإمدادات. بالإضافة إلى ذلك، يجب النظر في الالتزام بجميع القوانين الاتحادية وقوانين الولايات والقوانين المحلية المعمول بها، واللوائح الخاصة باستخدام المواد الكيميائية والتخلص منها. حاليا، وزارة الزراعة WS لديها 15 مرافق DRIT لاختبار عينات من 17 ولاية. يتم إنشاء مرافق وزارة الزراعة الأمريكية WS DRIT بالتعاون مع مختبرات الصحة العامة الجامعية والحكومية، في غرف مخصصة داخل مرافق أكبر وفي مقطورات مغلقة تم تعديلها وتحويلها لتكون بمثابة وحدات اختبار متنقلة في حالة الاستجابة لفاشية الطوارئ حيث اختبار مراقبة داء الكلبالمعزز مع وقت التحول الفوري أمر بالغ الأهمية (الشكل 5).

في حين أن الاختبار كان ناجحا باستخدام مادة جذع الدماغ ذات جودة متغيرة، الأنسجة الجذعية الجديدة مع عدم وجود تحلل الأنسجة هو الأمثل. كما يحدث التحلل، والجفاف، أو تسييل، وانخفاض نوعية العينة والاختبار قد الكشف عن تلطيخ أكثر غير محددة التي يمكن أن تخلط بين النتائج. هذه الملاحظة مماثلة بين DFA وDRIT2. وينبغي جمع جذع الدماغ/الجهاز العصبي المركزي في أقرب وقت ممكن ثم تخزينها مجمدة (-20 درجة مئوية) حتى الاختبار.

بشكل عام، معظم USDA WS مرافق عملية من 12 إلى 24 الشرائح في وقت واحد أثناء جلسة DRIT، بما في ذلك عنصر تحكم إيجابي واحد وعنصر تحكم سلبي واحد التي تم تأكيدها عبر DFA. وتوفر الضوابط الإيجابية والسلبية نقطة مرجعية لكل تشغيل DRIT لضمان نجاح الاختبار وللتأكد مما إذا كانت الأسئلة التفسيرية تنشأ على شرائح الاختبار. إذا لم يتم تحديد عينة أن يكون لها نتيجة إيجابية أو سلبية واضحة، يتم وصفها بأنها غير محددة واختبارها مرة ثانية من قبل DRIT. إذا لم تكن هذه العينة إيجابية أو سلبية واضحة بعد اختبارين DRIT، يتم إرسالها إلى مختبر مرجعي لDFA أو الاختبارات ذات الصلة.

كما هو الحال مع أي اختبار تشخيصي، "مشكلة اطلاق النار" مفيد مع نتائج غير متوقعة. على سبيل المثال، إذا كان تشغيل DRIT غير ناجح (أي، لا يعرض عنصر التحكم الإيجابي +3 أو +4 كثافة تلطيخ وتوزيع مستضد)، تأكد من عدم انتهاء صلاحية كافة المواد الكيميائية والكواشف. لقد وجدنا باستخدام زجاجة مفتوحة حديثا من بيروكسيد الهيدروجين في الحد الأدنى مرة واحدة في الأسبوع هو مفيد للمساعدة في منع تلطيخ غير محددة من خلال أكسدة أنسجة الدماغ. بالإضافة إلى ذلك، نوصي استبدال المخزن المؤقت خلات مرة واحدة على الأقل كل عام على الأقل، بغض النظر عن تاريخ انتهاء الصلاحية المسمى.

هناك عدد من المزايا من DRIT على DFA بما في ذلك انخفاض التكاليف، والقدرة على إجراء الاختبار خارج مختبر مركزي، والحاجة إلى مجهرية خفيفة فقط بدلا من المجهر الفلورسنت، وعملية التدريب مباشرة نسبيا ل الناس إدارة وقراءةالاختبار 2،3،4. وقد أثبتت هذه المزايا، إلى جانب حساسية وخصوصية DRIT التي يمكن مقارنتها DFA2و7و8و9 أن الاختبار بمثابة أداة هامة على نطاق واسع تعزيز برامج مراقبة داء الكلب8،10 في أمريكا الشمالية. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تسمح هذه اللجنة بزيادة المراقبة والاختبار الفوري في البلدان النامية أو في مناطق أخرى ذات موارد محدودة، لا سيما بعد التوجيهات الأخيرة التي أصدرتها منظمة الصحة العالمية/منظمة الصحة العالمية كاختبار موصى به.

Disclosures

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

نحن نعترف بجميع موظفي خدمات الحياة البرية في وزارة الزراعة الأمريكية الذين قاموا حاليًا أو سبق لهم بجمع عينات معززة لمراقبة داء الكلب وأجروا DRIT لتشخيص داء الكلب. وبالمثل، نعترف بالعديد من المتعاونين الذين يساعدوننا في جمع مراقبة داء الكلب المعزز. كما نشكر مراكز مكافحة الأمراض والوقاية منها ومعهد ويستار على إمكانية الوصول إلى الكواشف الحرجة اللازمة لإجراء عملية DRIT وعلى توفير فرص التدريب. وبالإضافة إلى ذلك، نقدر التشخيص المؤكد والمساعدة التقنية التي تقدمها مراكز مكافحة الأمراض والوقاية منها ومركز وادسوورث مع وزارة الصحة في ولاية نيويورك. استخدام أي منتجات تجارية هو لأغراض المقارنة فقط ولا يشكل تأييد.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3-Amino-9-Ethylcarbazole (AEC tablets; 50 count) Sigma Aldrich (https://www.sigmaaldrich.com/) A6926
Acetate Buffer, 0.1M, 5.2 pH, 32 oz Poly Scientific R&D Corp. (https://www.polyrnd.com/) s140
Ag Tek MiniScalpel, PN110, Non-sterile #10, 40 per package Patterson Veterinary (https://www.pattersonvet.com/) PN110 Supplemental equipment for sample touch impressions; Also available through Clipper Distributing (http://www.clipperdist.net/)
BD Luer-Lok Disposable Syringe without needle, 10 cc Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) 14-823-2A BD Manufacturer Number 309604
Binocular Light Microscope with Seidentopf Head or equivalent Multiple Vendors
Blue Rectangular UN-rated Disposal Container, 5G Berlin Packaging (https://www.berlinpackaging.com/) 1147T01BLU Supplemental equipment for chemical waste storage/disposal (Gill hematoxylin and AEC solution)
Corning Square and Rectangular Cover Glass, 24x60 Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) 12-553-465 Corning Manufacturer Number 2975246
Corning Universal Fit Pipet Tips: Racked, Nonsterile (1-200ul) Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) 07-200-300 Corning Manufacturer Number 4863
Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes, polypropylene Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) 14-959-70C Corning Manufacturer Number 352097
Falcon 96-Well Assay Plates (Tissue culture plate lids) Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) 08-772-5 Corning Manufacturer Number 353910
Fisher Brand 25mm Syringe Filter, Nylon, 0.45 μm, Sterile Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) 09-719D
Fisher Chemical Gill Method Hematoxylin Stain (Gill-2), 4L Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) CS401-1D
Fisherbrand Sharps-A-Gator Point-of-Use Sharps Containers, 5 qt Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) 14-827-122 Supplemental equipment for proper BSL-2 Laboratory Set-Up
Fluoro-Gel with Tris Buffer (Gel/Mount Media), 20 mL VWR, part of Avantor (https://vwr.com) 102092-122 Fluoro-Gel Substitute for BioMeda™ Gel-Mount, Electron Microscopy Sciences
Formalin, Buffered, 10%, 4L Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) SF100-4 Available each or in case of 4
Gilson Pipetman P200 Pipet, 50-200 μL Daigger Scientific (https://www.daigger.com) EF9930E
Hy-Clone Phosphate Buffered Saline, 1x Solution, 1 L (PBS) Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) SH30256LS Alternative dry powder product can be used
Hydrogen Peroxide, 3% Multiple Vendors Any commercially available source, such as pharmacy or store brands, etc.
Lens Microscope Objective 20x and 40x Multiple Vendors
Lysol IC Quarternary Disinfecting Cleaner, 1G Daigger Scientific (https://www.daigger.com) EF8481 Supplemental materials for proper BSL-2 Laboratory disinfection
Miltex brand Disposable Scalpel Size 22 (alternative size to MiniScalpel) AMD Next (www.amdnext.com) 999112314 Supplemental equipment for sample touch impressions; Alternative size to Ag Tek MiniScalpel
N,N-Dimethylformamide, Amber Glass Packaging, 500 mL Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) D119-500
Peroxidase Labeled Streptavidin, 50 mL SeraCare (https://www.seracare.com/) 5550-0001 KPL Immunoassay and Kits Reference Number 71-00-38
Phosphate Buffered Saline Powder (alternative to Fisher liquid PBS) Sigma Aldrich (https://www.sigmaaldrich.com/) P3813 Must be prepared in 1 L distilled water; Available in quantities of 1, 10 and 50 packs
Primary antibody: Polyclonal anti-nucleoprotein or cocktail of anti-lyssavirus biotinylated antibodies Store at 4 °C
PYREX Disposable Serological Pipets, Glass, Sterile, Plugged, Corning, 1.0 mL VWR, part of Avantor (https://vwr.com) 7078D-1 VWR Manufacturer Number 89091-220
PYREX Disposable Serological Pipets, Glass, Sterile, Plugged, Corning, 10.0 mL VWR, part of Avantor (https://vwr.com) 7078D-10 VWR Manufacturer Number 89091-106
PYREX Disposable Serological Pipets, Glass, Sterile, Plugged, Corning, 5.0 mL VWR, part of Avantor (https://vwr.com) 7078D-5 VWR Manufacturer Number 89091-484
Richard-Allan Scientific Gills Hematoxylin Stain No. 2, 1PT (alternative to above) Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) 22-050-201 Thermo Scientific Manufacturer Number 72504
Slide Holders, 24-place VWR, part of Avantor (https://vwr.com) 25608-868 Sakura®Finetek Supplier Number 4465; Available through multiple vendors
Specimen Tin Boxes, 1/2 oz VWR, part of Avantor (https://vwr.com) 101412-452 Supplemental equipment for storage of brain tissue samples
Taylor 2-Event Digital Timer/Clock Multiple Vendors Supplemental equipment
Tissue-Tek Slide Staining Kit VWR, part of Avantor (https://vwr.com) 25608-902 Sakura®Finetek Supplier Number 4551; Available through multiple vendors
TWEEN 80, Polyethylene glycol, 500 mL Sigma Aldrich (https://www.sigmaaldrich.com/) P1754 Also available in 25 mL, 1 L and 1 G volumes
VWR FLIP Pipette Filler (0.05-100 mL) VWR, part of Avantor (https://vwr.com) 53497-055
VWR Soft Nitrile Examination Gloves, L (100 per box) VWR, part of Avantor (https://vwr.com) 89038-272 Supplemental equipment for proper PPE
Water, Deionized (20 L) VWR, part of Avantor (https://vwr.com) 10806-022
Wheaton Clear Glass Sample Vials, 8 mL Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) 06-408C DWK Life Sciences Manufacturer Number 224884
White Coated, Double Well Pattern Microscope Slides, 14 mm Tekdon Incorporated (https://www.tekdon.com/coated-microscope-slides.html) 2-140
White Rectangular UN-rate Disposal Container, 5G Berlin Packaging (https://www.berlinpackaging.com/) 1147T01WHT Supplemental equipment for chemical waste storage/disposal (Formalin)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dean, D. J., Abelseth, M. K., Atanasiu, P. Laboratory techniques in rabies. Meslin, F. X., Kaplan, M. M., Koprowski, H. 23, World Health Organization. eds 88-89 (1996).
  2. Durr, S., et al. Rabies diagnosis for developing countries. PLOS Neglected Tropical Diseases. 2 (3), e206 (2008).
  3. Rupprecht, C., et al. Progress in the development of a direct rapid immunohistochemical test for diagnosing rabies. , (2014).
  4. Rupprecht, C. E., et al. Additional Progress in the Development and Application of a Direct, Rapid Immunohistochemical Test for Rabies Diagnosis. Journal of Veterinary Science. 5 (2), (2018).
  5. Coleman, P. G., Fevre, E. M., Cleaveland, S. Estimating the public health impact of rabies. Emerging Infectious Diseases. 10 (1), 140-142 (2004).
  6. Standard Operating Procedure for the Direct Rapid Immunohistochemistry Test (DRIT) for the detection of rabies virus antigens. , Centers for Disease Control and Prevention. (2016).
  7. Lembo, T., et al. Evaluation of a direct, rapid immunohistochemical test for rabies diagnosis. Emerging Infectious Diseases. 12 (2), 310-313 (2006).
  8. Middel, K., Fehlner-Gardiner, C., Pulham, N., Buchanan, T. Incorporating Direct Rapid Immunohistochemical Testing into Large-Scale Wildlife Rabies Surveillance. Tropical Medicine and Infectious Disease. 2 (3), 21 (2017).
  9. Coetzer, A., Sabeta, C. T., Markotter, W., Rupprecht, C. E., Nel, L. H. Comparison of biotinylated monoclonal and polyclonal antibodies in an evaluation of a direct rapid immunohistochemical test for the routine diagnosis of rabies in southern Africa. PLOS Neglected Tropical Diseases. 8 (9), e3189 (2014).
  10. Kirby, J., et al. Enhanced Rabies Surveillance to Support Effective Oral Rabies Vaccination of Raccoons in the Eastern United States. Tropical Medicine and Infectious Disease. 2 (3), 34 (2017).
  11. Slate, D., et al. Oral rabies vaccination in north america: opportunities, complexities, and challenges. PLOS Neglected Tropical Diseases. 3 (12), e549 (2009).
  12. Direct Rapid Immunohistochemistry Test (DRIT) protocols. , Available from: https://rabiessurveillanceblueprint.org/Direct-Rapid-Immunohistochemistry?lang=fr (2019).
  13. Khalid, A., Haque, A. Touch Impression Cytology Versus Frozen Section as Intraoperative Consultation Diagnosis. 2, (2004).

Tags

التراجع، العدد 146، التشخيص، الاختبار المناعي السريع المباشر، اختبار الأجسام المضادة الفلورسنت، فيروس ليسا، داء الكلب، داء الحيوان
تعزيز مراقبة داء الكلب باستخدام اختبار سريع مباشر للمناعة الكيميائية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Patrick, E. M., Bjorklund, B. M.,… More

Patrick, E. M., Bjorklund, B. M., Kirby, J. D., Nelson, K. M., Chipman, R. B., Rupprecht, C. E. Enhanced Rabies Surveillance Using a Direct Rapid Immunohistochemical Test. J. Vis. Exp. (146), e59416, doi:10.3791/59416 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter