Det direkte rask immunhistokjemiske test (DRIT) tilbyder en verden organisasjon for dyr sunnhet og verden sunnhet organisasjon (OIE/WHO) annerkjent alternativ å det direkte fluorescerende antistoff (DFA) test for rabiat diagnosis. Denne testen gjør det mulig for felt-baserte programmer som kan utføres i ca 1 time på hjernen visninger ved hjelp av lys mikroskopi.
Laboratorium-basert avlytting er Integral for rabiat forhindrer, administrere og ledelse anstrengelser. Stund det DFA er gullet målestokk for rabiat diagnosis, det er en nød å godkjenne i tillegg Diagnostic teknikker å gjøre bedre rabiat overvåking, spesielt inne utvikler land. Her presenterer vi en standard protokoll for DRIT som et alternativ, laboratorium eller felt-basert testing alternativ som bruker lys mikroskopi i forhold til DFA. Touch inntrykk av hjernevev innhentet fra mistenkte dyr er løst i 10% bufret formalin. Det DRIT bruker rabiat virus-spesifikk monoklonale eller polyklonale Antistoffene (bøyd å biotin), en streptavidin-peroksidase enzym, og en kromogen reporter (som acetyl 3-amino-9-ethylcarbazole) å merker viral inkluderinger innen infisert tissue. I ca 1 t, en hjernevev prøve kan testes og tolkes av DRIT. Evaluering av mistenkte dyr hjerner testet fra en rekke arter i Nord-Amerika, Asia, Afrika og Europa har illustrert høy følsomhet og spesifisitet av DRIT nærmer 100% med resultater i forhold til DFA. Siden 2005, det Amerika avdeling av landbruk ‘ Wildlife tjenestene (USDA WS) program har gjennomført stor-skalaen forsterket rabiat overvåking anstrengelser benytter det DRIT å test > 94000 eksemplar avhentet fra Wildlife inne strategisk rabiat ledelse arealer . Det DRIT skaffer en kraftfull, økonomisk verktøyet for rabiat diagnosis det kan brukes av laboratorians og åker biologer å gjøre bedre aktuelle rabiat overvåking, forhindrer og administrere planer generelt.
Mens DFA er den mest brukte testen for rutinemessig rabies diagnose1, kan kostnaden ved å kjøpe og vedlikeholde et fluorescerende mikroskop være begrensende til utviklingsland2,3,4 og for bred, stor-skalaen forsterket rabiat overvåking planer3,4. I tillegg krever DFA muligheten til å kjøle prøver under fiksering og å ruge prøvene over omgivelsestemperaturen under antistoff-antigen reaksjoner, som kan være et betydelig hinder i land uten egnet infrastruktur. På grunn delvis til begrensningene forbundet med moderne DFA testing, har den globale effekten av rabies lenge vært undervurdert5.
I denne forbindelse er det behov for å validere ekstra diagnostiske teknikker for å forbedre rabies overvåking globalt, spesielt i utviklingsland. Den DRIT protokollen som presenteres her tilbyr et laboratorium eller felt-basert testing alternativ til DFA som bruker lys mikroskopi og krever ikke kjøling eller laboratorie inkubasjons under testen6. Den DRIT og DFA er like i at begge teknikkene bruker touch visninger av hjernen prøver samlet fra potensielt rabiat dyr. Imidlertid, det for det første steg av det DRIT bruker formalin idet en historisk bindemiddel for eksemplar, hvilke inaktiverer rabiat virus. Dette gir en betydelig biosafety forbedring over aceton brukes til å fikse prøvene i DFA protokollen3, som er viktig ikke bare i laboratoriet, men kanskje enda mer i felt-basert eller desentralisert Lab miljøer. Hittil DRIT viser følsomhet og spesifisitet lik den DFA2,7,8,9.
Siden 2005, det USDA WS program har gjennomført stor-skalaen forsterket rabiat overvåking anstrengelser inne Nord USA benytter det DRIT idet del av en allsidig Wildlife rabiat ledelse program10. Forsterket rabiat overvåking brukes som komplettere å avsøring-basert offentligheten sunnhet overvåking og prøver opprinnelig Wildlife Meso-rovdyr Art, inkluderer vaskebjørn (Procyon lotor), stripete skunks (Mephitis Mephitis), grå rev ( Urocyon cinereoargenteus), rødrev (små små), og Coyotes (Canis latrans) som ikke har vært involvert i en menneskelig eller innenlandsk dyr eksponering. Dyr skrotter anvendt inne tester var innleverte å USDA WS igjennom forsterket rabiat overvåking anstrengelser og danne rabiat vektor art det er: onde eller rart handler; funnet død, vei-drept, eller en ordensforstyrrelser; og er ikke forbundet med en menneskelig eller innenlandsk dyr eksponering. Det DRIT skaffer en rabiat Diagnostic test det kan ansatt av utdannet åker biologer med liten eller nei laboratorium erfaring å gjøre bedre rabiat overvåking og nedskrive det finansiell lasten og arbeidsbyrde av offentligheten sunnhet Diagnostic laboratorium10. Den grunnleggende DRIT trening for USDA WS feltet ansatte vanligvis tar 1,5 til 2 dager, som omfatter ca 4 h av klasserommet instruksjon som dekker fundamentale prinsipper for biosafety, metoder for prøvetaking samling og DRIT prosesser samt > 8 h av laboratorie tid gjennomfører testen. Opplæring muligheter har vært tilgjengelig for USDA WS og program cooperators gjennom Centers for Disease Control og Prevention (CDC), LYSSA LLC, og The Wistar Institute.
Innen strategisk forvaltning områder, har USDA WS testet over 94 000 dyreliv prøver å bruke DRIT og har oppdaget mer enn 1 850 rabiat prøver som ville sannsynligvis gått uoppdaget stole bare på eksponering basert offentlig helse testing av mistenkte dyr. Forsterket rabiat overvåking data forsynt av DRIT resultater er betenkelig å skaffer en flere fullstendig Temporal og romlig representasjon av rabiat på landskap til støtte for muntlig rabiat vaksinasjon planer for Wildlife helt gjennom USA10, 11i. Tilsvarende provinsielle dyreliv etater i Canada har innarbeidet DRIT i stor skala dyreliv rabies overvåking innsats i tandem med sine offentlige helseprogrammer med suksess8. Både USDA WS og kanadiske DRIT overvåkningsprogrammer har brukt nasjonale referanselaboratorier for å bekrefte rabies av DFA og å utføre viral variant skrive som passer8. Videre, USDA WS feltet biologer sende 10% av negative prøver for DFA bekreftelse til referanselaboratorier og siden 2008, har deltatt i halvårlige DRIT ferdighets testing gitt av Wisconsin State Laboratory of hygiene, som en del av standard kvalitetssikrings tiltak.
Målet med denne metoden er å tilby en alternativ tilnærming for rabies diagnostisk testing som kan gjøres i desentralisert laboratorier, i felten, eller i områder uten rutinemessig tilgang til elektron mikroskopi.
Det DRIT er en fleksibel metoden egnet til åker-basert overvåking for oppdager tilstedeværelsen av rabiat virus det kan brukes inne desentralisert laboratorium arealer. Mens det er mulig å gjennomføre hele testen i et felt-basert innstilling som på bakluke av en lastebil, er det ideelt å ha en liten, innendørs plass dedikert til DRIT på grunn av kjemiske, utstyr og forsyning lagring problemer. I tillegg må overholdelse av alle gjeldende føderale, statlige og lokale lover og forskrifter for bruk og avhending av kjemikalier vurderes. Foreløpig USDA WS har 15 DRIT fasiliteter for å teste prøvene fra 17 stater. USDA WS DRIT anlegg er etablert i forbindelse med universitet og statlige offentlige helse laboratorier, i utpekte rom innen større anlegg og i lukkede trailere som har blitt ettermonteres og konvertert til å fungere som mobile testing enheter i hendelse av en nødsituasjonen utbrudd svaret der hvor forsterket rabiat overvåking tester med omgående behandlingstid er betenkelig (skikkelsen 5).
Mens testen har vært vellykket ved hjelp av hjernestammen materiale av variabel kvalitet, fersk hjernestammen vev uten vev nedbryting er optimal. Som nedbryting, uttørking, eller LNG oppstår, sample kvalitet avtar og testen kan oppdage mer uspesifisert farging som kan forvirre resultater. Denne observasjonen er lik mellom DFA og DRIT2. Hjernestammen/CNS skal samles så snart som mulig og deretter oppbevares frosset (-20 ° c) til testing.
Vanligvis, de fleste USDA WS-anlegg prosessen fra 12 til 24 lysbilder samtidig under en DRIT økt, inkludert en positiv kontroll og en negativ kontroll som har blitt bekreftet via DFA. Positive og negative kontroller gir et referansepunkt for hver DRIT-kjøring for å sikre at testen var vellykket, og for å bekrefte om fortolkende-spørsmål oppstår på test lysbildene. Hvis et utvalg ikke er bestemt å ha et klart positivt eller negativt utfall, er det merket som en ubestemt og testet en gang til av DRIT. Hvis dette utvalget ikke er en klar positiv eller negativ etter to DRIT tester, er det sendt til et referanse laboratorium for DFA eller relatert testing.
Som med alle diagnostiske test, er ‘ feilsøking ‘ nyttig med uventede funn. Hvis for eksempel en DRIT-kjøring ikke er vellykket (det vil si at den positive kontrollen ikke viser + 3 eller + 4 farge intensitet og antigen-distribusjon), må du sørge for at alle kjemikalier og reagenser ikke er utløpt. Vi har funnet ved hjelp av en nylig åpnet flaske hydrogen peroxide på et minimum av en gang per uke er nyttig for å hindre ikke-spesifikke flekker gjennom oksidasjon av hjernevevet. I tillegg anbefaler vi å erstatte acetate buffer minst én gang hvert år på et minimum, uavhengig av den merkede utløpsdatoen.
Det finnes en rekke fordeler av DRIT over DFA inkludert lavere kostnader, evne til å utføre testen utenfor et sentralisert laboratorium, behov for bare lys mikroskopi i stedet for et fluorescerende mikroskop, og den relativt enkle treningsprosessen for folk administrere og lese testen2,3,4. Disse fordelene, kombinert med følsomhet og spesifisitet av DRIT som er sammenlignbare med DFA2,7,8,9 har allerede bevist at testen fungerer som et viktig verktøy i bred skala forsterket rabiat overvåking planer8,10 inne Nord USA. I tillegg har DRIT potensial til å tillate økt overvåking og mer rask testing i utviklingsland eller andre områder med begrensede ressurser, spesielt etter siste OIE/WHO veiledning som en anbefalt test.
The authors have nothing to disclose.
Vi anerkjenne alle USDA Wildlife tjenestene stab hvem aktuelle eller ha tidligere avhentet forsterket rabiat overvåking eksemplar og ha gjennomført det DRIT for rabiat diagnosis. Likeledes erkjenner vi de mange cooperators som hjelper oss med Enhanced rabies overvåkning samling. Vi takker også Centers for sykdom kontroll og forebygging og The Wistar Institute for tilgang til kritiske reagenser som kreves for å gjennomføre DRIT og for å gi opplæring muligheter. I tillegg setter vi pris på bekreftende diagnostikk og teknisk assistanse fra sentrene for Disease Control og Prevention og av Wadsworth Center med New York State Department of Health. Bruk av kommersielle produkter er kun til sammenligningsformål og utgjør ikke tilslutning.
3-Amino-9-Ethylcarbazole (AEC tablets; 50 count) | Sigma Aldrich (https://www.sigmaaldrich.com/) | A6926 | |
Acetate Buffer, 0.1M, 5.2 pH, 32oz | Poly Scientific R&D Corp. (https://www.polyrnd.com/) | s140 | |
Ag Tek MiniScalpel, PN110, Non-sterile #10, 40 per package | Patterson Veterinary (https://www.pattersonvet.com/) | PN110 | Supplemental equipment for sample touch impressions; Also available through Clipper Distributing (http://www.clipperdist.net/) |
BD Luer-Lok Disposable Syringe without needle, 10cc | Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) | 14-823-2A | BD Manufacturer Number 309604 |
Binocular Light Microscope with Seidentopf Head or equivalent | Multiple Vendors | ||
Blue Rectangular UN-rated Disposal Container, 5G | Berlin Packaging (https://www.berlinpackaging.com/) | 1147T01BLU | Supplemental equipment for chemical waste storage/disposal (Gill hematoxylin and AEC solution) |
Corning Square and Rectangular Cover Glass, 24×60 | Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) | 12-553-465 | Corning Manufacturer Number 2975246 |
Corning Universal Fit Pipet Tips: Racked, Nonsterile (1-200ul) | Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) | 07-200-300 | Corning Manufacturer Number 4863 |
Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes, polypropylene | Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) | 14-959-70C | Corning Manufacturer Number 352097 |
Falcon 96-Well Assay Plates (Tissue culture plate lids) | Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) | 08-772-5 | Corning Manufacturer Number 353910 |
Fisher Brand 25mm Syringe Filter, Nylon, 0.45um, Sterile | Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) | 09-719D | |
Fisher Chemical Gill Method Hematoxylin Stain (Gill-2), 4L | Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) | CS401-1D | |
Fisherbrand Sharps-A-Gator Point-of-Use Sharps Containers, 5qt | Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) | 14-827-122 | Supplemental equipment for proper BSL-2 Laboratory Set-Up |
Fluoro-Gel with Tris Buffer (Gel/Mount Media), 20mL | VWR, part of Avantor (https://vwr.com) | 102092-122 | Fluoro-Gel Substitute for BioMeda™ Gel-Mount, Electron Microscopy Sciences |
Formalin, Buffered, 10%, 4L | Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) | SF100-4 | Available each or in case of 4 |
Gilson Pipetman P200 Pipet, 50-200uL | Daigger Scientific (https://www.daigger.com) | EF9930E | |
Hy-Clone Phosphate Buffered Saline, 1X Solution, 1L (PBS) | Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) | SH30256LS | Alternative dry powder product can be used |
Hydrogen Peroxide, 3% | Multiple Vendors | Any commercially available source, such as pharmacy or store brands, etc. | |
Lens Microscope Objective 20X and 40X | Multiple Vendors | ||
Lysol IC Quarternary Disinfecting Cleaner, 1G | Daigger Scientific (https://www.daigger.com) | EF8481 | Supplemental materials for proper BSL-2 Laboratory disinfection |
Miltex brand Disposable Scalpel Size 22 (alternative size to MiniScalpel) | AMD Next (www.amdnext.com) | 999112314 | Supplemental equipment for sample touch impressions; Alternative size to Ag Tek MiniScalpel |
N,N-Dimethylformamide, Amber Glass Packaging, 500mL | Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) | D119-500 | |
Peroxidase Labeled Streptavidin, 50mL | SeraCare (https://www.seracare.com/) | 5550-0001 | KPL Immunoassay and Kits Reference Number 71-00-38 |
Phosphate Buffered Saline Powder (alternative to Fisher liquid PBS) | Sigma Aldrich (https://www.sigmaaldrich.com/) | P3813 | Must be prepared in 1L distilled water; Available in quantities of 1, 10 and 50 packs |
Primary antibody: Polyclonal anti-nucleoprotein or cocktail of anti-lyssavirus biotinylated antibodies | Store at 4 degrees C | ||
PYREX Disposable Serological Pipets, Glass, Sterile, Plugged, Corning, 1.0mL | VWR, part of Avantor (https://vwr.com) | 7078D-1 | VWR Manufacturer Number 89091-220 |
PYREX Disposable Serological Pipets, Glass, Sterile, Plugged, Corning, 10.0mL | VWR, part of Avantor (https://vwr.com) | 7078D-10 | VWR Manufacturer Number 89091-106 |
PYREX Disposable Serological Pipets, Glass, Sterile, Plugged, Corning, 5.0mL | VWR, part of Avantor (https://vwr.com) | 7078D-5 | VWR Manufacturer Number 89091-484 |
Richard-Allan Scientific Gills Hematoxylin Stain No. 2, 1PT (alternative to above) | Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) | 22-050-201 | Thermo Scientific Manufacturer Number 72504 |
Slide Holders, 24-place | VWR, part of Avantor (https://vwr.com) | 25608-868 | Sakura®Finetek Supplier Number 4465; Available through multiple vendors |
Specimen Tin Boxes, 1/2oz | VWR, part of Avantor (https://vwr.com) | 101412-452 | Supplemental equipment for storage of brain tissue samples |
Taylor 2-Event Digital Timer/Clock | Multiple Vendors | Supplemental equipment | |
Tissue-Tek Slide Staining Kit | VWR, part of Avantor (https://vwr.com) | 25608-902 | Sakura®Finetek Supplier Number 4551; Available through multiple vendors |
TWEEN 80, Polyethylene glycol, 500mL | Sigma Aldrich (https://www.sigmaaldrich.com/) | P1754 | Also available in 25mL, 1L and 1G volumes |
VWR FLIP Pipette Filler (0.05-100mL) | VWR, part of Avantor (https://vwr.com) | 53497-055 | |
VWR Soft Nitrile Examination Gloves, L (100 per box) | VWR, part of Avantor (https://vwr.com) | 89038-272 | Supplemental equipment for proper PPE |
Water, Deionized (20L) | VWR, part of Avantor (https://vwr.com) | 10806-022 | |
Wheaton Clear Glass Sample Vials, 8mL | Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) | 06-408C | DWK Life Sciences Manufacturer Number 224884 |
White Coated, Double Well Pattern Microscope Slides, 14mm | Tekdon Incorporated (https://www.tekdon.com/coated-microscope-slides.html) | 2-140 | |
White Rectangular UN-rate Disposal Container, 5G | Berlin Packaging (https://www.berlinpackaging.com/) | 1147T01WHT | Supplemental equipment for chemical waste storage/disposal (Formalin) |