Vigilância aumentada da raiva usando um teste Imunoistoquímico rápido direto

Summary

O teste imunoistoquímico rápido direto (DRIT) oferece uma organização mundial para a saúde animal e organização mundial da saúde (OIE/OMS) reconhecida alternativa ao teste de anticorpo fluorescente direto (DFA) para o diagnóstico de raiva. Este teste permite aplicações baseadas em campo que podem ser executadas em aproximadamente 1 h em cima das impressões do cérebro usando a microscopia de luz.

Abstract

A vigilância laboratorial é essencial para os esforços de prevenção, controle e gestão da raiva. Embora o DFA seja o padrão-ouro para o diagnóstico da raiva, há a necessidade de validar técnicas diagnósticas adicionais para melhorar a vigilância da raiva, particularmente nos países em desenvolvimento. Aqui, nós apresentamos um protocolo padrão para o DRIT como uma alternativa, laboratório ou campo-baseou a opção do teste que usa a microscopia de luz em comparação ao DFA. As impressões de toque do tecido cerebral coletadas de animais suspeitos são fixadas em formalina tamponada a 10%. O Drit usa anticorpos monoclonais ou Polyclonal vírus-específicos da raiva (conjugated à biotina), uma enzima da streptavidin-peroxidase, e um repórter do cromogénio (tal como o acetil 3-amino-9-ethylcarbazole) para detectar inclusões virais dentro do tecido contaminado. Em aproximadamente 1 h, uma amostra de tecido cerebral pode ser testada e interpretada pelo DRIT. Avaliação de cérebros de animais suspeitos testados a partir de uma variedade de espécies na América do Norte, Ásia, África e Europa têm ilustrado alta sensibilidade e especificidade pelo DRIT aproximando 100% com resultados em comparação com a DFA. Desde 2005, o programa de serviços de vida selvagem (USDA WS) do departamento de agricultura dos Estados Unidos conduziu esforços de vigilância da raiva em larga escala usando o DRIT para testar > 94000 amostras coletadas da vida selvagem em áreas estratégicas de manejo da raiva . O Drit fornece uma ferramenta poderosa, econômica para o diagnóstico da raiva que pode ser usada por laboratoristas e por biólogos do campo para melhorar programas atuais da fiscalização, da prevenção e de controle da raiva globalmente.

Introduction

Quando o DFA for o teste o mais extensamente usado para o diagnóstico rotineiro¹da raiva, o custo de comprar e de manter um microscópio fluorescente pode ser limitando às nações tornando-se^2,3,4 e para largo, programas melhorados de vigilância da raiva em grande escala^3,4. Além disso, o DFA requer a capacidade de refrigerar amostras durante a fixação e incubar amostras acima da temperatura ambiente durante as reações de anticorpo-antígeno, que pode ser um obstáculo significativo em países sem infra-estrutura adequada. Devido em parte às limitações associadas aos testes modernos de DFA, o impacto global da raiva tem sido subestimado há muito tempo⁵.

A este respeito, há a necessidade de validar técnicas diagnósticas adicionais para melhorar a vigilância da raiva globalmente, particularmente nos países em desenvolvimento. O protocolo DRIT aqui apresentado oferece uma alternativa de testes laboratoriais ou baseados em campo ao DFA que utiliza microscopia de luz e não requer refrigeração ou incubação laboratorial durante o teste⁶. O DRIT e o DFA são similares em que ambas as técnicas usam impressões de toque de amostras de cérebro coletadas de animais potencialmente raioides. No entanto, o primeiro passo do DRIT utiliza formalina como um fixador histórico para as amostras, que inactiva o vírus da raiva. Isto fornece uma melhoria substancial do biossegurança sobre o acetona usado para fixar amostras no protocolo³de DFA, que é importante não somente no laboratório mas talvez mesmo mais assim em ambientes de laboratório campo-baseados ou descentralizados. Até o momento, o Drit mostra sensibilidade e especificidade iguais ao DFA^2,7,8,9.

Desde 2005, o programa USDA WS tem conduzido em grande escala reforçada esforços de vigilância da raiva na América do Norte usando o DRIT como parte de um programa abrangente de gestão da raiva da vida selvagem¹⁰. A vigilância da raiva reforçada é usada como um complemento à vigilância da saúde pública baseada em exposição e testa principalmente espécies de meso-carnívoros de vida selvagem, incluindo guaxinins (Procyon lotor), gambões listrados (MephitisMephitis), raposas cinzentas ( Urocyon cinereoargenteus), raposas vermelhas (Vulpes vulpes), e coiotes (latrans de Canis) que não estiveram envolvidos em uma exposição animal humana ou doméstica. Carcaças de animais usadas em testes foram submetidas ao USDA WS por meio de esforços aprimorados de vigilância da raiva e compostas de espécies de vetor de raiva que são: atuação doente ou estranha; encontrado morto, estrada-morto, ou um incômodo; e não estão associados a uma exposição animal humana ou doméstica. O DRIT fornece um teste de diagnóstico da raiva que pode ser empregado por biólogos treinados do campo com pouca ou nenhuma experiência do laboratório para melhorar a fiscalização da raiva e para reduzir a carga financeira e a carga de trabalho de laboratórios diagnósticos da saúde pública¹⁰. O treinamento básico de DRIT para empregados do campo do USDA WS toma tipicamente 1,5 a 2 dias, que inclui aproximadamente 4 h da instrução da sala de aula que cobre princípios fundamentais da Biossegurança, métodos para a coleção da amostra e os processos de DRIT assim como > 8 h de tempo de laboratório conduzindo o teste. As oportunidades de treinamento estão disponíveis para o USDA WS e cooperadores de programas através dos centros de controle e prevenção de doenças (CDC), LYSSA LLC e do Instituto Wistar.

Dentro de áreas de gestão estratégica, o USDA WS testou mais de 94.000 amostras de vida selvagem usando o DRIT e detectou mais de 1.850 amostras raivas que teriam provavelmente desaparecido sem ser detectado confiando apenas em testes de saúde pública baseados em exposição de animais suspeitos. Os dados melhorados da vigilância da raiva fornecidos por resultados de DRIT são críticos a fornecer uma respresentação temporal e espacial mais completa da raiva na paisagem no apoio de programas orais da vacinação da raiva para animais selvagens durante todo os EUA^10, o ¹¹. Da mesma forma, as agências de vida selvagem provinciais no Canadá incorporaram o DRIT em grandes esforços de vigilância da raiva selvagem em conjunto com seus programas de saúde pública com sucesso⁸. Ambos os programas de vigilância do USDA WS e do Canadian DRIT usaram laboratórios nacionais de referência para confirmar a raiva por DFA e para executar a digitação variante viral conforme apropriado⁸. Além disso, os biólogos do campo do USDA WS enviam 10% de espécimes negativos para a confirmação de DFA aos laboratórios de referência e desde 2008, participaram em testes bianuais da proficiência de DRIT fornecidos pelo laboratório do estado de Wisconsin da higiene, como parte do padrão medidas de garantia de qualidade.

O objetivo deste método é oferecer uma abordagem alternativa para o teste de diagnóstico de raiva que pode ser feito em laboratórios descentralizados, no campo, ou em áreas sem acesso rotineiro à microscopia eletrônica.

Protocol

Cada pessoa que conduz o teste diagnóstico da raiva deve receber uma série padrão da vacinação da raiva da pre-exposição e submeter-se à avaliação sorológicos regular do anticorpo, com imunizações do impulsionador como necessário. Indivíduos não imunizados não devem entrar em laboratórios ou áreas onde esse trabalho é conduzido. Toda a manipulação dos tecidos e das corrediças deve ser conduzida para não aerosolize líquidos ou para produzir partículas transportadas por via aérea. As capas das emanações não são exigidas mas quando praticável podem fornecer a proteção extra dos odores, dos ectoparasitas, e dos fragmentos do osso. Equipamento de proteção individual mínimo, incluindo luvas e proteção ocular, deve ser usado em todos os momentos durante a coleta de amostras e testes.

1. coleção brainstem

1. Colete amostras de tronco cerebral imediatamente após a coleta de carcaça ou assegure-se de que as carcaças sejam colocadas em freezers para armazenamento até um teste posterior. Se as carcaças animais são congeladas, descongelar-se na temperatura ambiental antes da coleção do tronco encefálico para a facilidade da coleção. Em algumas circunstâncias, as amostras são coletadas diretamente de um animal congelado.
2. Para os animais que são recentemente recolhidos ou foram descongelados para a temperatura ambiente, posicione o supino animal em uma superfície plana com a coluna cervical levemente girada para o examinador. Palpar para identificar a articulação atlanto-occipital no aspecto lateral da coluna cervical.
   1. Para carcaças que ainda estão completamente congeladas, posicione o supino animal como descrito acima, se prático. Use serras, facas, tesouras ósseas ou equipamentos similares para separar completamente a cabeça do corpo.
      Nota: Todos os equipamentos utilizados que não sejam de uso único devem ser limpos cuidadosamente entre as amostras.
3. Usando uma lâmina de bisturi, faça uma incisão no nível da articulação atlanto-occipital no aspecto ventral, cortando todas as camadas de tecido muscular e mole, incluindo a traquéia e o esôfago. Continue até aproximar o aspecto anterior das vértebras da coluna cervical. Para o tecido congelado, use uma lâmina do bisturi para remover todas as camadas restantes de músculo e de tecido macio para expor o Magnum do forâmen.
4. Mova a cabeça do animal para a extensão do alcance final até que o tronco cerebral seja visível. Use uma lâmina de bisturi para remover todo o tecido do tronco cerebral/sistema nervoso central (CNS) visível para amostragem. Para uma amostra congelada, use uma lâmina de bisturi para remover tanto do tecido brainstem/CNS congelado quanto possível de dentro do crânio.
5. Coloc as amostras do tronco encefálico em um recipiente inquebrável (isto é, lata da pomada do metal, Cryo-Vial, etc.) e etiqueta conformemente.
6. Assegure-se de que as amostras do tronco cerebral sejam testadas imediatamente após a coleta através do teste de DRIT, refrigerado (4 ° c) para até 24 h antes de testar, ou congelado (-20 ° c) até a época do teste se o teste ocorrerá mais de 24 h após a coleção da amostra.

2. preparação de materiais para DRIT

1. Criação de 10 pratos de coloração deslizante (Figura 1)
   Nota: Os pratos de coloração são suficientemente profundos para permitir a imersão completa da lâmina (diâmetro 96 mm, altura 72 mm, profundidade 42 mm, volume 250 mL). ⁶ anos de
   1. Encha o prato 1 com formalina tamponada de fosfato a 10%. Substitua formalina após 2 ensaios ou semanalmente.
   2. Encha os pratos 2, 4 e 5 com solução salina tamponada com fosfato com 1% de Tween-80 (TPBS). Substitua com TPBS frescos antes de cada teste.
   3. Encha o prato 3 com peróxido de hidrogênio a 3%. Substitua o peróxido de hidrogênio antes de cada teste.
   4. Encha os pratos 6, 8, 9 e 10 com água destilada ou desionizada. Substitua a água antes de cada teste.
   5. Encha o prato 7 com a formulação da hematoxilina de Gills #2 diluída em uma relação 1:1 na água destilada⁶. Substitua a hematoxilina após 2 ensaios ou semanalmente.
      Nota: De acordo com o protocolo original de Drit desenvolvido pelo CDC¹², uma relação 1:2 do hematoxilina de Gills à água pode ser usada se a contrcoloração é demasiado escura.
2. Preparação da solução de ações amino-ethylcarbazole (AEC)
   1. Utilizando uma pipeta de vidro, coloque 5 mL de N, N-dimetilformamida num recipiente de vidro.
   2. Adicionar 1 20 mg comprimido de 3-amino-9-ethylcarbazole e agitar até dissolver completamente. Rotule o pote com "AEC stock" e a data em que o estoque foi feito.
      Nota: A solução de estoque AEC pode ser armazenada refrigeração (4 ° c) e usada por 1-2 meses.
3. Preparação da diluição de trabalho AEC
   1. Adicione 7 mL de tampão de acetato a um tubo de centrifugação de 15 mL.
   2. Usando uma pipeta de vidro, adicione 0,5 mL da solução de estoque AEC ao tubo de centrífuga.
   3. Adicione 0, 75 mL de peróxido de hidrogênio a 3% ao tubo.
   4. Filtre a solução com uma seringa de 10 mL utilizando um filtro de seringa de 0,45 μm.
      Nota: A diluição de trabalho AEC deve ser criada apenas antes de cada teste DRIT, pois é apenas estável para 2-3 h.

3. teste rápido direto de Immunohistochemistry

1. O microscópio de vidro da etiqueta desliza com um número original para cada espécime usando um mancha-prova, waterproof, marcador permanente da tinta.
   1. Usando uma lâmina de bisturi, retire o tronco cerebral do recipiente e coloque na toalha de papel. Limpe delicadamente afastado todo o excesso do líquido, do sangue, ou da pele com uma segunda toalha de papel para revelar apenas o tecido do tronco cerebral¹³. Se necessário, corte o tecido do tronco cerebral para revelar uma seção transversal.
   2. Toque muito suavemente na corrediça do microscópio para a secção transversal do tecido do tronco cerebral. Toque no slide para o tronco cerebral em vários pontos sem movimento lateral para permitir que várias áreas do tronco encefálico sejam transferidas para o slide¹³. Certifique-se de que apenas 1 ou 2 camadas de células são transferidas do tecido cerebral para o slide com um toque suave. Nenhum agente de montagem é necessário para afixar o tecido do tronco cerebral para as lâminas. Inclua um controle positivo e negativo em cada execução do DRIT.
2. Deixe as lâminas secar ao ar por aproximadamente 5 min à temperatura ambiente.
3. Mergulhe as lâminas em formalina tamponada a 10% por 10 min (prato 1).
4. Retire as lâminas da formalina e mergulhe-enxague numa solução de TPBS (prato 2).
5. Mergulhe as lâminas em 3% de peróxido de hidrogênio por 10 min (prato 3).
6. Retire as lâminas do peróxido de hidrogênio e mergulhe-enxague em TPBS frescos (prato 4). Depois de remover o excesso de peróxido de hidrogênio, coloque as lâminas em TPBS frescos (prato 5) e trabalhe com um slide de cada vez enquanto os outros slides ficam imersos em TPBS.
7. Pegue as lâminas de TPBS (prato 5) um de cada vez, sacudir e borrar o excesso de buffer, e coloque em uma toalha de papel umedecido no banco de laboratório, como a base de uma "câmara de umidade". Usando uma pipeta, gota bastante anticorpo preliminar da anti-raiva do vírus em cada corrediça para cobrir o tecido do CNS. Incubar as lâminas durante 10 min na câmara de humidade (ou seja, cobrindo lâminas com placas de poço ou outra tampa simples enquanto estão a colocar na toalha de papel umedecida) à temperatura ambiente (Figura 2).
8. Retire as lâminas da câmara de humidade, agite e desaperte o conjugado em excesso e enxague as lâminas no TPBS (reutilize o mesmo TPBS no prato 5).
9. Trabalhando com um slide de cada vez, enquanto outros ficam imersos em TPBS — use uma pipeta para soltar bastante complexo streptavidin-peroxidase para cobrir o tecido do SNC. Incubar na câmara de humidade durante 10 min à temperatura ambiente.
10. Retire as lâminas da câmara de humidade, agite e desaperte o excesso de complexo e enxague as lâminas em TPBS (prato 5).
11. Trabalhar com um slide de cada vez, sacudir e borrar o excesso de buffer, enquanto outros ficam imersos em TPBS — use uma pipeta para soltar AEC suficiente (a preparação é explicada acima e deve ser feita imediatamente antes do uso) para cobrir o tecido do SNC. Incubar na câmara de humidade durante 10 min à temperatura ambiente.
12. Mergulhe-enxague as lâminas em água destilada (prato 6).
13. Coloque as lâminas em contracoloração de Gills hematoxilina (diluído 1:1 com água destilada) por 2 min (prato 7).
14. Mergulhe imediatamente todas as lâminas em água destilada (prato 8). Repita duas vezes com água fresca cada vez (pratos 9 e 10).
15. Trabalhando com um slide de cada vez, enquanto outros ficam imersos em água destilada (prato 10) — agitar e apagar o excesso de água e usar um meio de montagem solúvel em água para afixar um deslizamento de cobertura.
16. Use um microscópio de luz com um objetivo 20x para ver os slides e um objetivo de 40x se for necessária uma inspeção mais próxima.

Representative Results

Os resultados positivos do Drit mostram inclusões virais intracytoplasmic vermelhas que podem variar na forma e no tamanho (Figura 3) dentro do citoplasma de corpos azulado da pilha. As inclusões parecem lisas com margens muito brilhantes e uma área central menos intensamente manchada. A intensidade e a distribuição do antígeno são registradas quando as inclusões são detectadas. A intensidade é graduada de + 4 a + 1. A corrediça positiva do controle deve ter um brilhantismo magenta intenso, gritante que seja referido como uma intensidade de + 4. Uma ligeira perda de cor pode ocorrer especialmente quando A manipulação da amostra não foi ótima (isto é, o tecido da amostra tem decomposto ligeiramente) e estes devem ser classificados como + 3. A mancha visivelmente maçante é classific como um + 2 a + 1, não é considerada diagnóstica para a infecção do vírus de raiva e é etiquetada como indeterminado.

Adicionalmente, a distribuição do antígeno é graduada de + 4 a + 1 com + 4 que representa a distribuição do antígeno compreendida de uma abundância de inclusões grandes e pequenas que variam no tamanho e na forma, e presente em cada campo (ou quase cada campo) da vista dentro do tecido do CNS impressão de toque. O controle positivo normalmente tem uma distribuição de antígeno + 4. Uma distribuição de antígeno de + 3 seria atribuída quando há inclusões em uma variedade de tamanhos na maioria, mas não todos os campos de visão. Se as inclusões são encontradas em 10%-50% dos campos do microscópio, uma distribuição do antígeno + 2 é atribuída. Quando as inclusões são encontradas em < 10% dos campos do microscópio, uma distribuição do antígeno + 1 é atribuída.

A maioria dos tecidos do SNC com vírus da raiva apresentam inclusões virais típicas classificadas como + 3 ou + 4 de intensidade e distribuição de antígeno. Se os resultados indicarem uma intensidade de + 2 ou + 1 ou uma distribuição de antígeno + 2 ou + 1, a amostra é declarada como um "indeterminado" e o teste de repetição é garantido. Se a mesma amostra tiver um resultado de teste de repetição indeterminado, a amostra deve ser enviada para um laboratório de referência para DFA ou testes confirmatórios relacionados.

Uma amostra de teste usando o DRIT é considerada negativa para antígenos do vírus da raiva depois que o slide contendo o tecido do SNC foi verificado em uma ampliação de 200X ou maior e não são detectadas inclusões de vírus típicas (Figura 4). Amostras negativas exibem corpos de células azuladas com pouca ou nenhuma coloração inespecífica.

Figura 1: configuração de 10 pratos de coloração slide com reagentes para teste. Os pratos são rotulados com o nome do reagente na ordem necessária para seguir o protocolo. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: câmara de humidade simples criada com uma toalha de papel molhado e placas de cultura celular.  Uma câmara de umidade simples usando uma toalha de papel molhado e placas de cultura celular permite a aplicação baseada em campo.  Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: lâminas representativas de inclusões virais positivas de raiva com + 4 de intensidade e distribuição de antígeno + 4. (A e B) mostram inclusões virais da raiva positiva na ampliação de 200x. (C e D) mostram inclusões virais positivas da raiva na ampliação 400x. Barras de escala = 5 μm. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: lâminas representativas de amostras negativas sem inclusões virais da raiva. (A e B) mostram amostras negativas para inclusões virais da raiva na ampliação 200x. (C e D) mostram amostras negativas para inclusões virais da raiva na ampliação 400x. Barras de escala = 5 μm. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: fotografias representativas das instalações de ensaio da DRIT utilizadas pelo USDA WS. A) instalações de ensaio móveis num reboque fechado para transporte. B) veículo recreativo adaptado para testes de Drit. (C) instalação de ensaios de Drit em conjunto com o laboratório universitário. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

O DRIT é um método flexível adequado para vigilância baseada em campo para detectar a presença de vírus da raiva que pode ser usado em áreas de laboratório descentralizadas. Embora seja possível realizar todo o teste em uma configuração baseada em campo, como na porta traseira de um caminhão, é ideal ter um pequeno espaço interno dedicado para DRIT devido a problemas de armazenamento de produtos químicos, equipamentos e suprimentos. Além disso, deve-se considerar a aderência a todas as leis federais, estaduais e locais aplicáveis, bem como regulamentações para uso e descarte de produtos químicos. Atualmente, o USDA WS tem 15 instalações DRIT para testar amostras de 17 Estados. As instalações do USDA WS DRIT são estabelecidas em conjunto com laboratórios de saúde pública da Universidade e do estado, em salas designadas dentro de instalações maiores e em reboques fechados que foram adaptados e convertidos para servir como unidades de teste móveis no evento de resposta de surto de emergência onde o teste aprimorado de vigilância da raiva com tempo de resposta imediato é crítico (Figura 5).

Quando o teste for bem sucedido usando o material do tronco encefálico da qualidade variável, o tecido fresco do tronco encefálico sem a decomposição do tecido é ideal. Como a decomposição, dessecação, ou liquefacção ocorre, a qualidade da amostra diminui e o teste pode detectar uma coloração mais inespecífica que pode confundir resultados. Esta observação é similar entre o DFA e o DRIT². Brainstem/CNS deve ser coletado o mais rapidamente possível e, em seguida, armazenado congelado (-20 ° c) até o teste.

Tipicamente, a maioria de instalações do USDA WS processam de 12 a 24 corrediças imediatamente durante uma sessão de DRIT, incluindo um controle positivo e um controle negativo que foram confirmados através de DFA. Controles positivos e negativos fornecem um ponto de referência para cada execução de DRIT para garantir que o teste foi bem-sucedido e para confirmar se as perguntas interpretativas surgem nos slides de teste. Se uma amostra não é determinada para ter um resultado positivo ou negativo claro, ele é rotulado como um indeterminado e testado uma segunda vez por DRIT. Se esta amostra não é um positivo claro ou negativo após dois testes DRIT, ele é enviado para um laboratório de referência para DFA ou testes relacionados.

Como com qualquer teste de diagnóstico, ' Trouble tiroteio ' é útil com descobertas inesperadas. Por exemplo, se uma execução de DRIT não for bem-sucedida (ou seja, o controle positivo não apresentar + 3 ou + 4 de intensidade de coloração e distribuição de antígeno), assegure-se de que todos os produtos químicos e reagentes não tenham expirado. Nós encontramos usando um frasco recentemente aberto do peróxido de hidrogênio em um mínimo de uma vez por a semana é útil ajudar a impedir a mancha não específica com a oxidação do tecido de cérebro. Além disso, recomendamos substituir o buffer de acetato pelo menos uma vez por ano no mínimo, independentemente da data de expiração rotulada.

Há uma série de vantagens do DRIT sobre DFA, incluindo custos mais baixos, a capacidade de realizar o teste fora de um laboratório centralizado, necessidade de apenas microscopia de luz em vez de um microscópio fluorescente, e o processo de formação relativamente simples para pessoas administrando e lendo o teste^2,3,4. Estas vantagens, juntamente com a sensibilidade e especificidade do Drit que são comparáveis aos DFA^2,7, 8,9 já provaram que o teste serve como uma ferramenta importante em larga escala programas melhorados da vigilância da raiva^8,10 em America do Norte. Além disso, o DRIT tem potencial para permitir um aumento da vigilância e um teste mais rápido em países em desenvolvimento ou em outras áreas com recursos limitados, especialmente após a recente orientação da OIE/OMS como um teste recomendado.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-Amino-9-Ethylcarbazole (AEC tablets; 50 count)	Sigma Aldrich (https://www.sigmaaldrich.com/)	A6926
Acetate Buffer, 0.1M, 5.2 pH, 32 oz	Poly Scientific R&D Corp. (https://www.polyrnd.com/)	s140
Ag Tek MiniScalpel, PN110, Non-sterile #10, 40 per package	Patterson Veterinary (https://www.pattersonvet.com/)	PN110	Supplemental equipment for sample touch impressions; Also available through Clipper Distributing (http://www.clipperdist.net/)
BD Luer-Lok Disposable Syringe without needle, 10 cc	Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)	14-823-2A	BD Manufacturer Number 309604
Binocular Light Microscope with Seidentopf Head or equivalent	Multiple Vendors
Blue Rectangular UN-rated Disposal Container, 5G	Berlin Packaging (https://www.berlinpackaging.com/)	1147T01BLU	Supplemental equipment for chemical waste storage/disposal (Gill hematoxylin and AEC solution)
Corning Square and Rectangular Cover Glass, 24x60	Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)	12-553-465	Corning Manufacturer Number 2975246
Corning Universal Fit Pipet Tips: Racked, Nonsterile (1-200ul)	Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)	07-200-300	Corning Manufacturer Number 4863
Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes, polypropylene	Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)	14-959-70C	Corning Manufacturer Number 352097
Falcon 96-Well Assay Plates (Tissue culture plate lids)	Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)	08-772-5	Corning Manufacturer Number 353910
Fisher Brand 25mm Syringe Filter, Nylon, 0.45 μm, Sterile	Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)	09-719D
Fisher Chemical Gill Method Hematoxylin Stain (Gill-2), 4L	Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)	CS401-1D
Fisherbrand Sharps-A-Gator Point-of-Use Sharps Containers, 5 qt	Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)	14-827-122	Supplemental equipment for proper BSL-2 Laboratory Set-Up
Fluoro-Gel with Tris Buffer (Gel/Mount Media), 20 mL	VWR, part of Avantor (https://vwr.com)	102092-122	Fluoro-Gel Substitute for BioMeda™ Gel-Mount, Electron Microscopy Sciences
Formalin, Buffered, 10%, 4L	Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)	SF100-4	Available each or in case of 4
Gilson Pipetman P200 Pipet, 50-200 μL	Daigger Scientific (https://www.daigger.com)	EF9930E
Hy-Clone Phosphate Buffered Saline, 1x Solution, 1 L (PBS)	Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)	SH30256LS	Alternative dry powder product can be used
Hydrogen Peroxide, 3%	Multiple Vendors		Any commercially available source, such as pharmacy or store brands, etc.
Lens Microscope Objective 20x and 40x	Multiple Vendors
Lysol IC Quarternary Disinfecting Cleaner, 1G	Daigger Scientific (https://www.daigger.com)	EF8481	Supplemental materials for proper BSL-2 Laboratory disinfection
Miltex brand Disposable Scalpel Size 22 (alternative size to MiniScalpel)	AMD Next (www.amdnext.com)	999112314	Supplemental equipment for sample touch impressions; Alternative size to Ag Tek MiniScalpel
N,N-Dimethylformamide, Amber Glass Packaging, 500 mL	Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)	D119-500
Peroxidase Labeled Streptavidin, 50 mL	SeraCare (https://www.seracare.com/)	5550-0001	KPL Immunoassay and Kits Reference Number 71-00-38
Phosphate Buffered Saline Powder (alternative to Fisher liquid PBS)	Sigma Aldrich (https://www.sigmaaldrich.com/)	P3813	Must be prepared in 1 L distilled water; Available in quantities of 1, 10 and 50 packs
Primary antibody: Polyclonal anti-nucleoprotein or cocktail of anti-lyssavirus biotinylated antibodies			Store at 4 °C
PYREX Disposable Serological Pipets, Glass, Sterile, Plugged, Corning, 1.0 mL	VWR, part of Avantor (https://vwr.com)	7078D-1	VWR Manufacturer Number 89091-220
PYREX Disposable Serological Pipets, Glass, Sterile, Plugged, Corning, 10.0 mL	VWR, part of Avantor (https://vwr.com)	7078D-10	VWR Manufacturer Number 89091-106
PYREX Disposable Serological Pipets, Glass, Sterile, Plugged, Corning, 5.0 mL	VWR, part of Avantor (https://vwr.com)	7078D-5	VWR Manufacturer Number 89091-484
Richard-Allan Scientific Gills Hematoxylin Stain No. 2, 1PT (alternative to above)	Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)	22-050-201	Thermo Scientific Manufacturer Number 72504
Slide Holders, 24-place	VWR, part of Avantor (https://vwr.com)	25608-868	Sakura®Finetek Supplier Number 4465; Available through multiple vendors
Specimen Tin Boxes, 1/2 oz	VWR, part of Avantor (https://vwr.com)	101412-452	Supplemental equipment for storage of brain tissue samples
Taylor 2-Event Digital Timer/Clock	Multiple Vendors		Supplemental equipment
Tissue-Tek Slide Staining Kit	VWR, part of Avantor (https://vwr.com)	25608-902	Sakura®Finetek Supplier Number 4551; Available through multiple vendors
TWEEN 80, Polyethylene glycol, 500 mL	Sigma Aldrich (https://www.sigmaaldrich.com/)	P1754	Also available in 25 mL, 1 L and 1 G volumes
VWR FLIP Pipette Filler (0.05-100 mL)	VWR, part of Avantor (https://vwr.com)	53497-055
VWR Soft Nitrile Examination Gloves, L (100 per box)	VWR, part of Avantor (https://vwr.com)	89038-272	Supplemental equipment for proper PPE
Water, Deionized (20 L)	VWR, part of Avantor (https://vwr.com)	10806-022
Wheaton Clear Glass Sample Vials, 8 mL	Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)	06-408C	DWK Life Sciences Manufacturer Number 224884
White Coated, Double Well Pattern Microscope Slides, 14 mm	Tekdon Incorporated (https://www.tekdon.com/coated-microscope-slides.html)	2-140
White Rectangular UN-rate Disposal Container, 5G	Berlin Packaging (https://www.berlinpackaging.com/)	1147T01WHT	Supplemental equipment for chemical waste storage/disposal (Formalin)