Den direkta Rapid immunohistokchemical test (DRIT) erbjuder en världsorganisation för djurhälsa och Världshälsoorganisationen (OIE/WHO) erkänt alternativ till den direkta fluorescerande antikropp (DFA) test för rabies diagnos. Detta test gör det möjligt för fältbaserade program som kan utföras i cirka 1 h på hjärnan intryck med hjälp av ljus mikroskopi.
Laboratoriebaserad övervakning är integrerad för att förebygga, kontrollera och förvalta rabies. Medan DFA är guldmynt standard för rabies diagnos, det finns ett behov av att validera ytterligare diagnostiska metoder för att förbättra rabies övervakning, särskilt i utvecklingsländer. Här presenterar vi ett standardprotokoll för DRIT som ett alternativt, laboratorium eller fältbaserat testalternativ som använder ljusmikroskopi jämfört med DFA. Tryck intryck av hjärnvävnad som samlats in från misstänkta djur är fast i 10% buffrad formalin. Den DRIT använder rabies virusspecifika monoklonala eller polyklonala antikroppar (konjugerat till biotin), en streptavidin-peroxidas enzym, och en kromogen reporter (såsom acetyl 3-amino-9-etylkarbazol) att upptäcka viral inneslutningar inom infekterade vävnad. I cirka 1 h, ett hjärnvävnad prov kan testas och tolkas av DRIT. Utvärdering av misstänkta djur hjärnor testas från en mängd olika arter i Nordamerika, Asien, Afrika och Europa har illustrerat hög känslighet och specificitet av DRIT närmar sig 100% med resultat jämfört med DFA. Sedan 2005, Förenta staternas Department of Agriculture ‘ s Wildlife Services (USDA WS) program har genomfört storskaliga förstärkt rabies övervakning insatser med hjälp av DRIT att testa > 94000 prover som samlats in från vilda djur i strategiska områden rabies förvaltning . Den DRIT ger ett kraftfullt, ekonomiskt verktyg för rabies diagnos som kan användas av laboratorierna och fältbiologer att förbättra nuvarande rabies övervakning, förebyggande och kontrollprogram globalt.
Medan DFA är den mest använda test för rutinmässig rabies diagnos1, kostnaden för att köpa och underhålla ett fluorescerande Mikroskop kan vara att begränsa till utvecklingsländer2,3,4 och för breda, storskaliga förbättrade rabies övervakningsprogram3,4. Dessutom kräver DFA förmåga att kyla prover under fixering och att Inkubera prover över omgivningstemperaturen under antikropp-antigenreaktioner, vilket kan vara ett betydande hinder i länder utan lämplig infrastruktur. Delvis på grund av de begränsningar som är förknippade med modern DFA-testning, har den globala effekten av rabies länge underskattats5.
I detta avseende finns det ett behov av att validera ytterligare diagnostiska metoder för att förbättra övervakningen av rabies globalt, särskilt i utvecklingsländerna. Det DRIT-protokoll som presenteras här erbjuder ett laboratorium eller fältbaserat testalternativ till DFA som använder ljusmikroskopi och inte kräver kylning eller laboratorieinkubering under provningen6. Den DRIT och DFA är liknande i att båda teknikerna använder Touch intryck av hjärnan prover som samlats in från potentiellt rabiat djur. Emellertid, det första steget i DRIT använder formalin som en historisk fixativ för prover, som inaktiverar rabiesvirus. Detta ger en betydande biosäkerhet förbättring jämfört med aceton används för att fastställa prover i DFA protokoll3, vilket är viktigt inte bara i laboratoriet, men kanske ännu mer i fält-baserade eller decentraliserade labbmiljöer. Hittills visar Drit känslighet och specificitet lika med DFA2,7,8,9.
Sedan 2005, den USDA WS programmet har genomfört storskaliga förstärkt rabies övervakning insatser i Nordamerika med hjälp av DRIT som en del av ett omfattande djurliv rabies Management program10. Förbättrad rabies övervakning används som ett komplement till exponeringsbaserad folkhälsoövervakning och tester främst djurlivet meso-Carnivore arter, inklusive tvättbjörnar (Procyon lotor), randig skunkar (Mephitis Mephitis), grå rävar ( Urocyon cinereoargenteus), Rödrävar (Vulpes vulpes) och Coyotes (Canis latrans) som inte har varit inblandade i exponering av människor eller husdjur. Djurkroppar som används i tester lämnades in till USDA WS genom förbättrad rabies övervakning insatser och omfattade rabies vektor arter som är: sjuk eller konstig agerar; hittats döda, väg-dödade, eller en olägenhet; och inte är förknippade med exponering av människor eller husdjur. Den DRIT ger en rabies diagnostiska test som kan användas av utbildad fältbiologer med liten eller ingen laboratorie erfarenhet för att förbättra rabies övervakning och minska den ekonomiska bördan och arbetsbördan för folkhälso diagnostiska laboratorier10. Den grundläggande DRIT utbildning för USDA WS fält anställda tar vanligtvis 1,5 till 2 dagar, vilket inkluderar cirka 4 h av klassrummet undervisning som omfattar grundläggande principer för biosäkerhet, metoder för provtagning och DRIT processer samt > 8 h av laboratorie tid som utför provet. Utbildningsmöjligheter har varit tillgängliga för USDA WS och program samarbetsvilliga genom centra för sjukdomskontroll och prevention (CDC), Lyssa LLC, och Wistar Institute.
Inom strategisk ledning områdena, USDA WS har provat över 94 000 Wildlife proverna användande den DRIT och har upptäckt mer än 1 850 rabiat proverna så pass skulle har sannolik bort oupptäckt förlitande bara på exponeringsbaserat allmänhet hälsa provande av misstänkt djuren. Enhanced rabies övervakningsdata från DRIT resultat är avgörande för att ge en mer komplett tidsmässiga och rumsliga representation av rabies på landskapet till stöd för muntliga rabies vaccinationsprogram för vilda djur i hela USA10, 11. Likaså Provincial Wildlife byråer i Kanada har införlivat DRIT i storskaliga djurlivet rabies övervakning insatser tillsammans med sina folkhälsoprogram med framgång8. Både USDA WS och kanadensiska DRIT övervakningsprogram har använt nationella referenslaboratorier för att bekräfta rabies av DFA och utföra viral variant skriva som lämpligt8. Dessutom USDA WS fältbiologer skicka 10% av negativa prover för DFA bekräftelse till referenslaboratorier och sedan 2008, har deltagit i halvårsvis DRIT kompetenstest som tillhandahålls av Wisconsin State Laboratory of hygien, som en del av standard kvalitetssäkringsåtgärder.
Målet med denna metod är att erbjuda en alternativ metod för testning av rabies diagnostiska tester som kan göras i decentraliserade laboratorier, på fältet, eller i områden utan rutinmässig tillgång till elektronmikroskopi.
DRIT är en flexibel metod lämpad för fältbaserad övervakning för att upptäcka förekomst av rabiesvirus som kan användas i decentraliserade laboratorie områden. Även om det är möjligt att genomföra hela testet i en fältbaserad inställning som på bakluckan på en lastbil, är det idealiskt att ha en liten, inomhus utrymme dedikerad för DRIT på grund av kemisk, utrustning och leverans lagring frågor. Dessutom måste efterlevnad av alla tillämpliga federala, statliga och lokala lagar, och förordningar för kemisk användning och bortskaffande beaktas. För närvarande USDA WS har 15 DRIT anläggningar för att testa prover från 17 stater. Den USDA WS DRIT anläggningar är etablerade i samband med universitet och statliga folkhälso laboratorier, i utsedda rum inom större anläggningar och i slutna släpvagnar som har eftermonteras och konverteras för att fungera som mobila provnings enheter i händelse av ett akut utbrott svar där förstärkt rabies övervakning tester med omedelbar handläggningstid är kritisk (figur 5).
Medan testet har varit framgångsrik med hjälp av hjärnstammen material av varierande kvalitet, färsk hjärnstammen vävnad utan vävnadsnedbrytning är optimal. Som nedbrytning, uttorkning, eller kondensering inträffar, prov kvalitet minskar och testet kan upptäcka mer ospecifik färgning som kan förvirra resultat. Denna observation är likartad mellan DFA och DRIT2. Hjärnstammen/CNS ska samlas in så snart som möjligt och därefter förvaras fryst (-20 ° c) tills det testas.
Typiskt, mest USDA WS anläggningar process från 12 till 24 bilder på en gång under en DRIT session, inklusive en positiv kontroll och en negativ kontroll som har bekräftats via DFA. Positiva och negativa kontroller ger en referenspunkt för varje DRIT-körning för att säkerställa att testet lyckades och för att bekräfta om tolkningsfrågor uppstår på test bilderna. Om ett prov inte är fastställt att ha ett klart positivt eller negativt resultat, är det märkt som en obestämd och testas en andra gång av DRIT. Om detta prov inte är en klar positiv eller negativ efter två DRIT-tester, skickas det till ett referenslaboratorium för DFA eller liknande tester.
Som med alla diagnostiska test, “Trouble skytte” är användbart med oväntade fynd. Till exempel, om en DRIT Run är misslyckad (dvs, den positiva kontrollen inte uppvisar + 3 eller + 4 Färgnings intensitet och antigen distribution), se till att alla kemikalier och reagenser inte har löpt ut. Vi har funnit att använda en nyligen öppnad flaska väteperoxid på minst en gång per vecka är till hjälp för att förhindra icke-specifik färgning genom oxidation av hjärnvävnaden. Dessutom rekommenderar vi att ersätta acetat buffert minst en gång per år minst, oavsett det angivna utgångsdatumet.
Det finns ett antal fördelar med DRIT över DFA inklusive lägre kostnader, förmåga att utföra testet utanför ett centraliserat laboratorium, behöver endast ljus mikroskopi i stället för ett fluorescerande Mikroskop, och den relativt enkla träningsprocessen för personer som administrerar och läser provet2,3,4. Dessa fördelar, tillsammans med känslighet och specificitet av Drit som är jämförbara med DFA2,7,8,9 har redan bevisat att testet fungerar som ett viktigt verktyg i stor skala förbättrad rabies övervakningsprogram8,10 i Nordamerika. Dessutom har DRIT potential att möjliggöra ökad övervakning och mer snabba tester i utvecklingsländer eller andra områden med begränsade resurser, särskilt efter senaste OIE/WHO vägledning som ett rekommenderat test.
The authors have nothing to disclose.
Vi erkänner alla USDA Wildlife Services personal som för närvarande eller har tidigare samlat Enhanced rabies övervakning prover och har genomfört DRIT för rabies diagnos. Likaså erkänner vi de många samarbetsvilliga som hjälper oss med förbättrad rabies övervakning insamling. Vi tackar också centra för sjukdomskontroll och förebyggande och Wistar Institute för tillgång till kritiska reagenser som krävs för att genomföra DRIT och för att tillhandahålla utbildningsmöjligheter. Dessutom uppskattar vi bekräftande diagnostik och tekniskt stöd som tillhandahålls av centra för sjukdomskontroll och förebyggande och av Wadsworth Center med New York State Department of Health. Användning av kommersiella produkter är endast i jämförelsesyfte och utgör inte stöd.
3-Amino-9-Ethylcarbazole (AEC tablets; 50 count) | Sigma Aldrich (https://www.sigmaaldrich.com/) | A6926 | |
Acetate Buffer, 0.1M, 5.2 pH, 32oz | Poly Scientific R&D Corp. (https://www.polyrnd.com/) | s140 | |
Ag Tek MiniScalpel, PN110, Non-sterile #10, 40 per package | Patterson Veterinary (https://www.pattersonvet.com/) | PN110 | Supplemental equipment for sample touch impressions; Also available through Clipper Distributing (http://www.clipperdist.net/) |
BD Luer-Lok Disposable Syringe without needle, 10cc | Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) | 14-823-2A | BD Manufacturer Number 309604 |
Binocular Light Microscope with Seidentopf Head or equivalent | Multiple Vendors | ||
Blue Rectangular UN-rated Disposal Container, 5G | Berlin Packaging (https://www.berlinpackaging.com/) | 1147T01BLU | Supplemental equipment for chemical waste storage/disposal (Gill hematoxylin and AEC solution) |
Corning Square and Rectangular Cover Glass, 24×60 | Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) | 12-553-465 | Corning Manufacturer Number 2975246 |
Corning Universal Fit Pipet Tips: Racked, Nonsterile (1-200ul) | Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) | 07-200-300 | Corning Manufacturer Number 4863 |
Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes, polypropylene | Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) | 14-959-70C | Corning Manufacturer Number 352097 |
Falcon 96-Well Assay Plates (Tissue culture plate lids) | Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) | 08-772-5 | Corning Manufacturer Number 353910 |
Fisher Brand 25mm Syringe Filter, Nylon, 0.45um, Sterile | Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) | 09-719D | |
Fisher Chemical Gill Method Hematoxylin Stain (Gill-2), 4L | Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) | CS401-1D | |
Fisherbrand Sharps-A-Gator Point-of-Use Sharps Containers, 5qt | Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) | 14-827-122 | Supplemental equipment for proper BSL-2 Laboratory Set-Up |
Fluoro-Gel with Tris Buffer (Gel/Mount Media), 20mL | VWR, part of Avantor (https://vwr.com) | 102092-122 | Fluoro-Gel Substitute for BioMeda™ Gel-Mount, Electron Microscopy Sciences |
Formalin, Buffered, 10%, 4L | Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) | SF100-4 | Available each or in case of 4 |
Gilson Pipetman P200 Pipet, 50-200uL | Daigger Scientific (https://www.daigger.com) | EF9930E | |
Hy-Clone Phosphate Buffered Saline, 1X Solution, 1L (PBS) | Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) | SH30256LS | Alternative dry powder product can be used |
Hydrogen Peroxide, 3% | Multiple Vendors | Any commercially available source, such as pharmacy or store brands, etc. | |
Lens Microscope Objective 20X and 40X | Multiple Vendors | ||
Lysol IC Quarternary Disinfecting Cleaner, 1G | Daigger Scientific (https://www.daigger.com) | EF8481 | Supplemental materials for proper BSL-2 Laboratory disinfection |
Miltex brand Disposable Scalpel Size 22 (alternative size to MiniScalpel) | AMD Next (www.amdnext.com) | 999112314 | Supplemental equipment for sample touch impressions; Alternative size to Ag Tek MiniScalpel |
N,N-Dimethylformamide, Amber Glass Packaging, 500mL | Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) | D119-500 | |
Peroxidase Labeled Streptavidin, 50mL | SeraCare (https://www.seracare.com/) | 5550-0001 | KPL Immunoassay and Kits Reference Number 71-00-38 |
Phosphate Buffered Saline Powder (alternative to Fisher liquid PBS) | Sigma Aldrich (https://www.sigmaaldrich.com/) | P3813 | Must be prepared in 1L distilled water; Available in quantities of 1, 10 and 50 packs |
Primary antibody: Polyclonal anti-nucleoprotein or cocktail of anti-lyssavirus biotinylated antibodies | Store at 4 degrees C | ||
PYREX Disposable Serological Pipets, Glass, Sterile, Plugged, Corning, 1.0mL | VWR, part of Avantor (https://vwr.com) | 7078D-1 | VWR Manufacturer Number 89091-220 |
PYREX Disposable Serological Pipets, Glass, Sterile, Plugged, Corning, 10.0mL | VWR, part of Avantor (https://vwr.com) | 7078D-10 | VWR Manufacturer Number 89091-106 |
PYREX Disposable Serological Pipets, Glass, Sterile, Plugged, Corning, 5.0mL | VWR, part of Avantor (https://vwr.com) | 7078D-5 | VWR Manufacturer Number 89091-484 |
Richard-Allan Scientific Gills Hematoxylin Stain No. 2, 1PT (alternative to above) | Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) | 22-050-201 | Thermo Scientific Manufacturer Number 72504 |
Slide Holders, 24-place | VWR, part of Avantor (https://vwr.com) | 25608-868 | Sakura®Finetek Supplier Number 4465; Available through multiple vendors |
Specimen Tin Boxes, 1/2oz | VWR, part of Avantor (https://vwr.com) | 101412-452 | Supplemental equipment for storage of brain tissue samples |
Taylor 2-Event Digital Timer/Clock | Multiple Vendors | Supplemental equipment | |
Tissue-Tek Slide Staining Kit | VWR, part of Avantor (https://vwr.com) | 25608-902 | Sakura®Finetek Supplier Number 4551; Available through multiple vendors |
TWEEN 80, Polyethylene glycol, 500mL | Sigma Aldrich (https://www.sigmaaldrich.com/) | P1754 | Also available in 25mL, 1L and 1G volumes |
VWR FLIP Pipette Filler (0.05-100mL) | VWR, part of Avantor (https://vwr.com) | 53497-055 | |
VWR Soft Nitrile Examination Gloves, L (100 per box) | VWR, part of Avantor (https://vwr.com) | 89038-272 | Supplemental equipment for proper PPE |
Water, Deionized (20L) | VWR, part of Avantor (https://vwr.com) | 10806-022 | |
Wheaton Clear Glass Sample Vials, 8mL | Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) | 06-408C | DWK Life Sciences Manufacturer Number 224884 |
White Coated, Double Well Pattern Microscope Slides, 14mm | Tekdon Incorporated (https://www.tekdon.com/coated-microscope-slides.html) | 2-140 | |
White Rectangular UN-rate Disposal Container, 5G | Berlin Packaging (https://www.berlinpackaging.com/) | 1147T01WHT | Supplemental equipment for chemical waste storage/disposal (Formalin) |