Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Doğrudan hızlı Immünhistokimyasal testi kullanarak gelişmiş kuduz gözetimi

Published: April 30, 2019 doi: 10.3791/59416
Automatic Translation
1, 2, 3, 4, 4, 5
1Animal and Plant Health Inspection Service (APHIS), Wildlife Services, Knoxville, TN, United States Department of Agriculture (USDA), 2Animal and Plant Health Inspection Service (APHIS), Wildlife Services, Sutton, MA, United States Department of Agriculture (USDA), 3Animal and Plant Health Inspection Service (APHIS), Wildlife Services, Milton, FL, United States Department of Agriculture (USDA), 4Animal and Plant Health Inspection Service (APHIS), Wildlife Services, Concord, NH, United States Department of Agriculture (USDA), 5Lyssa LLC

Summary

Doğrudan hızlı immünhistokimyasal test (DRIT), kuduz tanısı için doğrudan floresan antikor (DFA) testine alternatif olarak tanınan hayvan sağlığı ve Dünya Sağlık Örgütü (OIS/WHO) için bir dünya organizasyonu sunmaktadır. Bu test, ışık mikroskobu kullanarak beyin gösterimleri üzerine yaklaşık 1 saat içinde gerçekleştirilebilecek alan tabanlı uygulamalar için izin verir.

Abstract

Laboratuvar bazlı gözetim, kuduz önleme, kontrol ve yönetim çabalarının ayrılmaz bir parçasıdır. DFA kuduz tanısı için altın standart iken, özellikle gelişmekte olan ülkelerde, kuduz gözetimi geliştirmek için ek tanı teknikleri doğrulamak için bir ihtiyaç vardır. Burada, DFA 'ya kıyasla ışık mikroskobu kullanan alternatif, laboratuvar veya alan tabanlı test seçeneği olarak DRIT için standart bir protokol sunuyoruz. Şüpheli hayvanlardan toplanan beyin dokusunun dokunmatik gösterimleri% 10 tamponlu formalin içinde sabitlenir. Drit kuduz virüs özgü monoklonal veya poliklonal antikorlar kullanır (biotin için konjuyum), bir streptavidin-peroksidaz enzim, ve bir Kromojen muhabiri (Asetil 3-amino-9-etilcarbazol gibi) enfekte doku içinde viral kapanımlar tespit etmek. Yaklaşık 1 saat içinde, bir beyin dokusu örneği test edilebilir ve DRIT tarafından yorumlanır. Kuzey Amerika, Asya, Afrika ve Avrupa 'daki türlerin çeşitli test şüpheli hayvan beyni değerlendirilmesi DFA kıyasla sonuçları ile% 100 yaklaşıyor DRIT tarafından yüksek hassasiyet ve özgüllük resimli var. 2005 yılından bu yana, ABD Tarım Bölümü yaban hayatı Hizmetleri (USDA WS) programı, stratejik kuduz yönetim alanlarında yaban hayatı toplanan > 94000 örnekleri test etmek için DRIT kullanarak büyük ölçekli gelişmiş kuduz gözetim çabaları gerçekleştirdi . DRıT, laboratuvarlar ve alan biyologlar tarafından mevcut kuduz gözetimi, önleme ve kontrol programlarını küresel olarak iyileştirmek için kullanılabilecek kuduz tanısı için güçlü ve ekonomik bir araç sağlar.

Introduction

DFA rutin kuduz tanı1için en yaygın olarak kullanılan test iken, satın alma ve floresan mikroskop Bakımı maliyeti gelişmekte olan Milletler2,3,4 ve geniş için sınırlandırılabilir, büyük ölçekli gelişmiş kuduz gözetim programları3,4. Buna ek olarak, DFA sabitleme sırasında numunelerin soğutulmasını ve antikor-antijen reaksiyonları sırasında ortam sıcaklığının üstündeki numunelerin inkübasyon yapılmasını gerektirir, bu da uygun altyapı olmaksızın ülkelerde önemli bir engel olabilir. Modern DFA testi ile ilişkili sınırlamalar kısmen nedeniyle, kuduz küresel etkisi uzun5hafife edilmiştir.

Bu bağlamda, özellikle gelişmekte olan ülkelerde, küresel kuduz gözetimi geliştirmek için ek tanı teknikleri doğrulamak için bir ihtiyaç vardır. Burada sunulan DRıT protokolü, ışık mikroskobu kullanan DFA 'ya bir laboratuar veya alan bazlı test alternatifi sunar ve test6' da soğutma veya laboratuar kuluçarı gerektirmez. DRIT ve DFA her iki teknikleri potansiyel kuduz hayvanların toplanan beyin örnekleri dokunmatik Gösterim kullanmak benzer. Ancak, DRıT ilk adımı örnekleri için tarihsel bir fiktatif olarak formalin kullanır, hangi kuduz virüsü inaktive. Bu DFA protokolünde örnekleri düzeltmek için kullanılan aseton üzerinde önemli bir Biyogüvenlik iyileştirme sağlar3, hangi sadece Laboratuar ama belki de daha çok alan tabanlı veya merkezi olmayan laboratuar ortamlarında önemlidir. Bugüne kadar, drit hassasiyet ve özgüllüğü DFA2,7,8,9eşit gösterir.

2005 yılından bu yana, USDA WS programı kapsamlı bir yaban hayatı kuduz yönetim programı10bir parçası olarak drıt kullanarak Kuzey Amerika 'da büyük ölçekli gelişmiş kuduz gözetim çabaları gerçekleştirdi. Gelişmiş kuduz gözetim pozlama tabanlı kamu sağlığı gözetim ve testler öncelikle yaban hayatı meso-etobur türler, rakunlar (Procyon rakun), çizgili skunks (kokarca kokarca), gri tilki (dahil olmak üzere tamamlayıcı olarak kullanılır Urocyon cinereoargenteus), kırmızı tilki (Vulpes vulpes), ve (Canis Latrans) Bu bir insan veya yerli hayvan maruz yer olmamıştır. Test kullanılan hayvan karkas gelişmiş kuduz gözetim çabaları ve oluşan kuduz vektör türleri ile USDA WS gönderildi: hasta veya garip oyunculuk; ölü, yol öldürüldü, ya da bir sıkıntı bulundu; ve bir insan veya yerli hayvan maruz kalma ile ilişkili değildir. DRıT kuduz gözetimi geliştirmek ve kamu sağlığı tanı laboratuvarlarının10mali yükü ve iş yükünü azaltmak için az veya hiç laboratuar deneyimi ile eğitimli alan biyologlar tarafından istihdam edilebilir bir kuduz teşhis testi sağlar. USDA WS alan çalışanları için temel DRıTT eğitim genellikle 1,5 alır 2 gün, yaklaşık içerir 4 biyalik temel ilkelerini kapsayan sınıf öğretim h, örnek toplama ve DRIT süreçleri için yöntemler yanı sıra > 8 h testi yürüten laboratuar süresi. Eğitim fırsatları USDA WS ve program kooperatörler için hastalık kontrol ve önleme (CDC), LYSSA LLC ve Wistar Enstitüsü merkezleri aracılığıyla kullanılabilir olmuştur.

Stratejik yönetim alanlarında, USDA WS üzerinde test edilmiştir 94.000 yaban hayatı örnekleri DRıTT kullanarak ve büyük olasılıkla sadece pozlama dayalı kamu sağlığı test şüpheli hayvanların dayanarak tespit edilmemiş gitti 1.850 kuduz örnekleri tespit etti. DRıT sonuçları tarafından sağlanan gelişmiş kuduz gözetim verileri ABD 'de yaban hayatı için oral kuduz aşılama programlarının destek peyzaj üzerinde kuduz daha tam temporal ve uzamsal temsili sağlamak için önemlidir10, 11' den itibaren. Benzer şekilde, Kanada 'da Il yaban hayatı kurumları başarı ile kendi kamu sağlığı programları ile tandem büyük ölçekli yaban hayatı kuduz gözetim çabaları içine DRIT dahil var8. Hem USDA WS ve Kanada DRIT gözetim programları DFA tarafından kuduz onaylamak ve uygun8olarak viral varyant yazarak gerçekleştirmek için Ulusal referans laboratuvarları kullandık. Dahası, USDA WS alan biyologlar, DFA onayı için negatif numunelerin% 10 ' unun referans laboratuvarlara göndermesi ve 2008 yılından bu yana, Wisconsin Devlet hijyen Laboratuvarı tarafından sağlanan yıllık DRIT yeterlilik testine, standart bir parçası olarak katıldı kalite güvencesi önlemleri.

Bu yöntemin amacı, merkezi olmayan laboratuvarlarda yapılabilir kuduz teşhis testi için alternatif bir yaklaşım sunacaktır, alanda, veya elektron mikroskobu rutin erişim olmaksızın alanlarda.

Protocol

Kuduz teşhis testi yapan her kişi, standart bir ön pozlama kuduz aşılama serisi almak ve gerektiğinde güçlendirici immünizasyon ile düzenli serolojik antikor değerlendirme geçmesi gerekir. Unimmünized bireyler laboratuvarları veya bu tür iş gerçekleştirildiği alanlara girmemelidir. Dokuların ve slaytların tüm manipülasyon sıvılar aerosolize veya havadan parçacıklar üretmek değil yapılmalıdır. Duman davlumbazları gerekli değildir, ancak uygulanabilir olduğunda kokular, ektoparasitler ve kemik parçalarından ekstra koruma sağlayabilir. Eldiven ve göz koruması da dahil olmak üzere minimum kişisel koruyucu ekipman, numune toplama ve test sırasında her zaman giyilmelidir.

1. beyin sapı koleksiyonu

  1. İskelet koleksiyonlarının hemen üzerine beyin sapı örneklerini toplayın ya da daha sonra test edene kadar karcanların depolama için dondurucular yerleştirilmesini sağlayın. Hayvan karkas dondurulduysa, toplama kolaylığı için beyin sapı koleksiyonundan önce ortam sıcaklığında çözüler. Bazı durumlarda, örnekler doğrudan dondurulmuş bir hayvandan toplanır.
  2. Taze toplanan ya da ortam sıcaklığına çözülür hayvanlar için, servikal omurga biraz muayene doğru döndürülmüş ile düz bir yüzey üzerinde hayvan sırtüstü konumlandırın. Servikal omurganın lateral yönü üzerinde atlanto-oksipital eklem tanımlamak için palp.
    1. Hala tamamen dondurulmuş olan karkas için, Eğer pratik, yukarıda açıklandığı gibi hayvan sırtüstü konumlandırın. Gövdenin kafasını tamamen ayırmak için testereler, bıçaklar, kemik makasları veya benzer ekipmanlar kullanın.
      Not: Tek seferlik kullanım olmayan tüm ekipmanlar örnekler arasında iyice temizlenmelidir.
  3. Bir neşter Blade kullanarak, ventral açıdan atlanto-oksipital eklem seviyesinde bir kesi yapmak, kas ve yumuşak doku tüm katmanları ile kesme, trakea ve özofagus dahil. Servikal omurga vertebra anterior yönü yaklaşıncaya kadar devam edin. Dondurulmuş doku için, foramen magnum ortaya çıkarmak için kas ve yumuşak doku kalan tüm katmanları kaldırmak için bir neşter Blade kullanın.
  4. Beyin sapı görünür olana kadar hayvanın kafasını son Aralık uzantısına taşıyın. Örnekleme için tüm görünür beyin sapı/santral sinir sistemi (CNS) dokusunu kaldırmak için bir neşter bıçağı kullanın. Dondurulmuş bir örnek için, kafatası içinde mümkün olduğunca dondurulmuş beyin sapı/CNS dokusu kadar kaldırmak için bir neşter Blade kullanın.
  5. Beyin sapı örneklerini kırılmaz bir kapsayıcıya (örn. metal merhem kalay, Cryo-Vial vb.) yerleştirin ve buna göre etiketleyin.
  6. Test işleminden önce 24 saate kadar soğutucu (4 °C), veya dondurulmuş (-20 °C) test işleminden sonra 24 h 'den daha fazla yer alırsa, beyin sapı numunelerinin DRıTT testi ile toplama işleminden hemen sonra test edildiğinden emin olun.

2. DRIT için malzemelerin hazırlanması

  1. 10 slayt boyama yemekleri kurma (Şekil 1)
    Not: Boyama yemekleri slayt tam daldırma için izin vermek için yeterince derin (çapı 96 mm, yükseklik 72 mm, derinlik 42 mm, hacim 250 mL). 6
    1. Dolgu çanak 1 ile 10% fosfat tamponlu formalin. 2 test çalışır veya haftalık sonra formalin değiştirin.
    2. 1% Tween-80 (TPBS) ile fosfat tamponlu tuzlu yemek 2, 4 ve 5 doldurun. Her testten önce taze TPBS ile değiştirin.
    3. 3% hidrojen peroksit ile çanak 3 doldurun. Her testten önce hidrojen peroksit değiştirin.
    4. Damıtılmış veya deiyonize su ile 6, 8, 9 ve 10 çeşitleri doldurun. Her testten önce suyu değiştirin.
    5. Dolgu çanak 7 solungaçlar hematoksinlin formülasyonu ile #2 distile su içinde 1:1 oranında seyreltilmiş6. 2 test çalışır veya haftalık sonra hematoksilen değiştirin.
      Not: CDC12tarafından geliştirilen orijinal drit protokolüne göre, karşı boyama çok karanlık ise, bir 1:2, solungaçlar hematoksilen suya kullanılabilir.
  2. Amino-ethylcarbazole (AEC) stok çözeltisi hazırlanması
    1. Bir cam pipet kullanarak, bir cam kabında 5 mL N, N-dimethylformamid yerleştirin.
    2. Eklemek 1 20 mg tablet 3-amino-9-etylcarbazole ve Shake tamamen çözünmüş kadar. "AEC hisse senedi" ve stok yapıldı Tarih ile kavanoz etiket.
      Not: AEC stok çözeltisi soğutma (4 °C) altında saklanabilir ve 1-2 ay boyunca kullanılabilir.
  3. AEC çalışma seyreltme hazırlığı
    1. 15 mL santrifüjli tüpe 7 mL asetat tampon ekleyin.
    2. Cam Pipet kullanarak, santrifüj tüpüne AEC stok çözeltisi 0,5 mL ekleyin.
    3. Tüp% 3 hidrojen peroksit 0,075 mL ekleyin.
    4. 0,45 μm şırınga filtresi kullanarak solüsyonu 10 mL şırıngayla filtreleyin.
      Not: Sadece 2-3 h için kararlı olduğu için AEC çalışma seyreltme her DRIT test hemen önce oluşturulmalıdır.

3. doğrudan hızlı Immünhistokimya testi

  1. Etiket cam mikroskop slaytlar her numune için benzersiz bir sayı ile bir smear-Proof, su geçirmez, kalıcı mürekkep marker kullanarak.
    1. Bir neşter Blade kullanarak, kap ve yer kağıt havlu üzerinde beyin kaldırmak. Nazikçe sıvı, kan, ya da sadece beyin dokusu13ortaya çıkarmak için ikinci bir kağıt havlu ile kürk herhangi bir aşırı uzağa leke. Gerekirse, bir kesit ortaya çıkarmak için beyin sapı doku bölümü.
    2. Mikroskop kaydırağı çok nazikçe beyin sapı dokusunun çapraz kısmına dokunun. Birden fazla beyin sapı alanlarının slayt13' e aktarılmasına izin vermek için, lateral hareket olmadan çeşitli noktalarda beyin sapı slaytı dokunun. Sadece 1 veya 2 katman hücrelerin beyin dokusundan slayt için nazik bir dokunuş ile transfer olduğundan emin olun. Beyin sapı dokusunu slaytlara yapıştırmaları için montaj ajanı gerekmez. Her DRIT çalışmasına hem pozitif hem de negatif bir denetim ekleyin.
  2. Slaytlar oda sıcaklığında yaklaşık 5 dakika boyunca hava-kuru edelim.
  3. 10 dakika (çanak 1) için% 10 tampon formalin içinde slaytlar batırın.
  4. Slaytları formalin 'den çıkarın ve TPBS çözümünde daldırma-durulayın (çanak 2).
  5. Slaytları 10 dakika (çanak 3) için% 3 hidrojen peroksit olarak batırın.
  6. Yeni TPBS (yemek 4) içinde hidrojen peroksit ve daldırma-durulama slaytlar çıkarın. Aşırı hidrojen peroksit kaldırdıktan sonra, yeni TPBS (çanak 5) slaytlar yerleştirin ve diğer slaytlar TPBS batırılmış kalırken bir defada bir slayt ile çalışır.
  7. Tpbs (yemek 5) bir defada bir slaytlar alın, kapalı ve leke aşırı tampon sallayın ve bir ' nem Odası ' temeli olarak, laboratuvar tezgah üzerinde bir nemlendirilmiş kağıt havlu üzerine yerleştirin. Bir pipet kullanarak, CNS dokusunu kapsayacak şekilde her slayda yeterli primer Anti-kuduz virüsü antikor bırakın. (Şekil 2) Oda sıcaklığında (yani, nemli kağıt havlu üzerinde döşenirken iyi plakaları veya diğer basit kapak ile kaydırarak kaplama) nem odasında 10 dakika boyunca slaytları inküye.
  8. Nem odasından slaytları çıkarın, aşırı Konjugat kapalı sallamak ve leke, ve daldırma-tpbs içinde slaytlar durulayın (yemek 5 aynı tpbs yeniden).
  9. Bir defada bir slayt ile çalışan, diğerleri TPBS batırılmış kalmak — CNS doku kapsayacak kadar streptavidin-peroksidan kompleks düşürmek için bir pipet kullanın. Oda sıcaklığında 10 dakika nem odasında inkübe.
  10. Nem odasından slaytları çıkarın, aşırı karmaşık kapalı sallamak ve leke, ve daldırma-tpbs (yemek 5) içinde slaytlar durulayın.
  11. Bir defada bir slayt ile çalışma, sallayın ve aşırı tampon leke, diğerleri tpbs batırılmış kalmak — yeterli AEC düşürmek için bir pipet kullanın (hazırlık yukarıda açıklanmıştır ve hemen önce kullanılması gereken) CNS doku kapsayacak şekilde. Oda sıcaklığında 10 dakika nem odasında inkübe.
  12. Daldırma-damıtılmış suda (çanak 6) slaytlar durulayın.
  13. Slaytları, 2 dakika (çanak 7) için (distile su ile seyreltilmiş 1:1) Gills hematoxylin karşı leke yerleştirin.
  14. Tüm slaytları damıtılmış suda hemen daldırma-durulayın (yemek 8). Her seferinde taze su ile iki kez tekrarlayın (yemekler 9 ve 10).
  15. Bir defada bir slayt ile çalışma, diğerleri damıtılmış su (yemek 10) batırılmış kalırken-sallamak ve aşırı su kapalı leke ve bir kapak kayma yapıştırmak için su çözünür montaj ortamı kullanın.
  16. Daha yakından teftiş gerekiyorsa slaytları ve 40X amacı görüntülemek için 20 x objektif bir ışık mikroskop kullanın.

Representative Results

DRıTT 'den olumlu sonuçlar, mavimsi hücre gövdelerini sitoplazmasında şekil ve boyutta (Şekil 3) değişebilir kırmızı intrakytoplasmik viral inlüzyonlar gösterir. Bu kapanımlar çok parlak marjları ve daha az yoğun lekeli merkezi alanı ile pürüzsüz görünür. Yoğunluk ve antijen dağılımı, kapanımlar algılandığında kaydedilir. Yoğunluk + 4 ile + 1 arasında sınıflandırılır. Pozitif kontrol slaytı, + 4 yoğunluğu olarak adlandırılan yoğun, göz kamaştırıcı bir Magenta parlaklığı olmalıdır. Küçük bir renk kaybı özellikle örnek işleme en iyi olmadığı zaman ortaya çıkabilir (örn., örnek doku hafifçe deforme oldu) ve bu olarak not edilmelidir + 3. Dikkat çekecek şekilde mat leke, + 2 ila + 1 olarak değerlendirilmişse, kuduz virüsü enfeksiyonu için teşhis olarak kabul edilmez ve belirsiz olarak etiketlenir.

Ayrıca, antijen dağılımı + 4 ' ten + 1 ' den + 4 ' e kadar boyutu ve şekli değişen büyük ve küçük kapanımlar bir bolluk oluşan antijen dağıtımı temsil eden ve her alanda (ya da hemen her alanda) CNS dokusu içinde görünüm mevcuttur dokunmatik izlenim. Pozitif denetim genellikle bir + 4 antijen dağılımı vardır. Tüm görünüm alanlarının çoğunda değil, çeşitli boyutlarda kapanımlar olduğunda + 3 ' ün antijen dağılımı atanır. Mikroskop alanlarının% 10-50 ' inde kapanımlar bulunursa, bir + 2 antijen dağılımı atanır. Mikroskop alanlarının <% 10 ' unda kapanımlar bulunduğunda, bir + 1 antijen dağılımı atanır.

Çoğu CNS doku kuduz virüsü mevcut sergi tipik viral kapanımlar olarak dereceli + 3 veya + 4 yoğunluk ve antijen dağılımı. Sonuçlar bir + 2 veya + 1 yoğunluğu veya + 2 veya + 1 antijen dağılımı belirtiyorsa, örnek "belirsiz" olarak bildirilir ve tekrar test garantisi verilir. Aynı örnek tekrarlayıcı belirsiz bir test sonucu varsa, örnek DFA veya ilgili onaylayıcı test için bir başvuru laboratuvarına gönderilmelidir.

Drıt kullanan bir test örneği, CNS dokusunu içeren slayt 200x veya daha büyük bir büyütme ve hiçbir tipik virüs kapanımlar (Şekil 4) algılandığında tarandıktan sonra kuduz virüsü antijenleri için negatif olarak kabul edilir. Negatif örnekler, küçük veya hiç spesifik olmayan lekelerle mavimsi hücre gövdeleri sergiler.

Figure 1
Şekil 1: test için reaktifler ile 10 slayt boyama yemekleri kurulumu. Yemekler, protokol takip etmek için gerekli sırada reaktif adı ile etiketlenir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2: ıslak kağıt havlu ve hücre kültürü plakaları ile oluşturulan basit nem odası.  Islak kağıt havlu ve hücre kültürü plakaları kullanarak basit bir nem odası alan tabanlı uygulama için izin verir.  Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: + 4 yoğunluğu ve + 4 antijen dağılımı ile kuduz pozitif viral inlüzyonlar temsilcisi slaytlar. (A ve B) 200x büyütme pozitif kuduz viral kapanımlar göster. (C ve D) 400x büyütme pozitif kuduz viral kapanımlar göster. Ölçek çubukları = 5 μm. Bu rakam daha büyük bir sürümünü görüntülemek Için lütfen buraya tıklayın .

Figure 4
Şekil 4: Hiçbir kuduz viral kapanımlar ile negatif numunelerin temsilcisi slaytlar. (A ve B) 200x büyütme kuduz viral kapanımlar için örnekleri negatif göster. (C ve D) 400x büyütmede kuduz viral inlüzyonlar için örnekleri negatif göster. Ölçek çubukları = 5 μm. Bu rakam daha büyük bir sürümünü görüntülemek Için lütfen buraya tıklayın .

Figure 5
Şekil 5: USDA ws tarafından kullanılan DRIT test olanaklarının temsilcisi fotoğrafları. (A) taşıma için kapalı bir römork içinde mobil test tesisi. (B) drıtt testi için dinlenme aracı tadilat. (C) üniversite Laboratuvarı ile birlikte drit test tesisi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Discussion

DRIT, merkezi olmayan laboratuar alanlarında kullanılabilecek kuduz virüsü varlığını tespit etmek için alan tabanlı gözetim için uygun esnek bir yöntemdir. Bir kamyonun Bagaj Kapısı gibi alan tabanlı bir ortamda tüm testi yapmak mümkün olsa da, kimyasal, ekipman ve tedarik depolama sorunları nedeniyle DRIT için adanmış küçük, kapalı bir alan olması idealdir. Ayrıca, yürürlükteki tüm federal, eyalet ve yerel yasalara ve kimyasal kullanım ve bertaraf yönetmeliklerine bağlılık dikkate alınmalıdır. Şu anda, USDA WS 17 devletten örnekleri test etmek için 15 DRIT tesisleri vardır. USDA WS DRIT tesisleri, üniversite ve devlet kamu sağlığı laboratuvarları ile birlikte, daha büyük tesisler içinde belirlenmiş odalarda ve retrodonatılmış ve mobil test birimleri olarak hizmet etmek için dönüştürülmüş kapalı römork ile kurulmuş Acil bir salgın tepkisi durumunda, hızlı dönüş süresi ile gelişmiş kuduz gözetim testleri önemlidir (Şekil 5).

Test, değişken kalitedeki beyin sapı malzemesi kullanılarak başarılı olurken, doku debileşemesiyle taze beyin sapı dokusu optimum seviyede. Ayrışma, kurutma veya sıvılaşma ortaya çıktığında, numune kalitesi azalır ve test sonuçları karıştırabilecek daha spesifik olmayan lekeyi algılayabilir. Bu gözlem DFA ve DRIT2arasında benzer. Beyin sapı/CNS en kısa sürede toplanmalı ve daha sonra test edene kadar dondurulmuş (-20 °C) depolanmalıdır.

Genellikle, bir pozitif kontrol ve DFA ile teyit edilmiş bir negatif kontrol dahil olmak üzere bir DRIT oturumu sırasında bir kerede 12-24 slaytlar çoğu USDA WS tesisleri işlemi. Pozitif ve negatif denetimler, testin başarılı olduğundan emin olmak için her DRIT çalışması için bir referans noktası sağlar ve test slaytlarında yorumlayıcı sorular ortaya çıkarsa onaylamak için. Bir örnek net bir pozitif veya negatif sonuca sahip olduğu belirlenmişse, bir belirsiz olarak etiketlenmiş ve ikinci kez DRIT tarafından test. Bu örnek iki DRIT testinden sonra net bir pozitif veya negatif değilse, DFA veya ilgili testler için bir başvuru laboratuvarına gönderilir.

Herhangi bir tanılama testinde olduğu gibi, ' sorun giderme ' beklenmeyen bulgularla yararlıdır. Örneğin, bir DRIT çalışması başarısız olursa (yani, pozitif kontrol + 3 veya + 4 boyama yoğunluğu ve antijen dağılımı göstermez), tüm kimyasalların ve reaktiflerin süresi dolmadığından emin olun. Biz haftada bir kez en az bir hidrojen peroksit yeni açılan şişe kullanarak bulduk beyin dokusunun oksidasyonu ile spesifik olmayan boyama önlemeye yardımcı olmak için yararlıdır. Ayrıca, etiketlenmiş son kullanma tarihi ne olursa olsun, asetat tamponunu her yıl en az bir kez değiştirmenizi öneririz.

Düşük maliyetler de dahil olmak üzere DFA üzerinden DRıT avantajları bir dizi vardır, merkezi bir laboratuar dışında test yapmak için yeteneği, bir floresan mikroskop yerine sadece ışık mikroskopisi için ihtiyaç, ve nispeten basit eğitim süreci insanlar test2,3,4yönetmek ve okuma. Bu avantajlar, DFA2,7,8,9 ile karşılaştırılabilir olan drit duyarlılık ve özgüllüğü ile birleştiğinde zaten test geniş ölçekte önemli bir araç olarak hizmet olduğunu kanıtlamıştır Gelişmiş kuduz gözetim programları8,10 Kuzey Amerika 'da. Ayrıca, DRıTT artan gözetim ve daha fazla istem testleri geliştirme ülkeleri veya sınırlı kaynaklara sahip diğer alanlarda, özellikle son OIS/WHO rehberlik önerilen bir test olarak sonra izin olasılığı vardır.

Disclosures

Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.

Acknowledgments

Biz şu anda veya daha önce geliştirilmiş kuduz gözetim örnekleri toplanan tüm USDA Wildlife Services personeli kabul ve kuduz tanı için DRIT gerçekleştirdi. Aynı şekilde, gelişmiş kuduz gözetim koleksiyonu ile bize yardımcı olan birçok koişletmecileri kabul ediyoruz. Ayrıca, DRıT yürütmek ve eğitim fırsatları sağlamak için gerekli kritik reaktiflere erişim için hastalık kontrol ve Önleme Merkezleri ve Wistar Enstitüsü 'ne teşekkür ederiz. Buna ek olarak, hastalık kontrol ve Önleme Merkezleri tarafından ve New York Devlet Sağlık Bakanlığı ile Wadsworth Center tarafından sağlanan teyit edilen teşhis ve teknik yardımları takdir ediyoruz. Herhangi bir ticari ürünün kullanımı sadece karşılaştırma amaçlıdır ve onay teşkil etmez.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3-Amino-9-Ethylcarbazole (AEC tablets; 50 count) Sigma Aldrich (https://www.sigmaaldrich.com/) A6926
Acetate Buffer, 0.1M, 5.2 pH, 32 oz Poly Scientific R&D Corp. (https://www.polyrnd.com/) s140
Ag Tek MiniScalpel, PN110, Non-sterile #10, 40 per package Patterson Veterinary (https://www.pattersonvet.com/) PN110 Supplemental equipment for sample touch impressions; Also available through Clipper Distributing (http://www.clipperdist.net/)
BD Luer-Lok Disposable Syringe without needle, 10 cc Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) 14-823-2A BD Manufacturer Number 309604
Binocular Light Microscope with Seidentopf Head or equivalent Multiple Vendors
Blue Rectangular UN-rated Disposal Container, 5G Berlin Packaging (https://www.berlinpackaging.com/) 1147T01BLU Supplemental equipment for chemical waste storage/disposal (Gill hematoxylin and AEC solution)
Corning Square and Rectangular Cover Glass, 24x60 Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) 12-553-465 Corning Manufacturer Number 2975246
Corning Universal Fit Pipet Tips: Racked, Nonsterile (1-200ul) Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) 07-200-300 Corning Manufacturer Number 4863
Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes, polypropylene Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) 14-959-70C Corning Manufacturer Number 352097
Falcon 96-Well Assay Plates (Tissue culture plate lids) Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) 08-772-5 Corning Manufacturer Number 353910
Fisher Brand 25mm Syringe Filter, Nylon, 0.45 μm, Sterile Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) 09-719D
Fisher Chemical Gill Method Hematoxylin Stain (Gill-2), 4L Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) CS401-1D
Fisherbrand Sharps-A-Gator Point-of-Use Sharps Containers, 5 qt Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) 14-827-122 Supplemental equipment for proper BSL-2 Laboratory Set-Up
Fluoro-Gel with Tris Buffer (Gel/Mount Media), 20 mL VWR, part of Avantor (https://vwr.com) 102092-122 Fluoro-Gel Substitute for BioMeda™ Gel-Mount, Electron Microscopy Sciences
Formalin, Buffered, 10%, 4L Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) SF100-4 Available each or in case of 4
Gilson Pipetman P200 Pipet, 50-200 μL Daigger Scientific (https://www.daigger.com) EF9930E
Hy-Clone Phosphate Buffered Saline, 1x Solution, 1 L (PBS) Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) SH30256LS Alternative dry powder product can be used
Hydrogen Peroxide, 3% Multiple Vendors Any commercially available source, such as pharmacy or store brands, etc.
Lens Microscope Objective 20x and 40x Multiple Vendors
Lysol IC Quarternary Disinfecting Cleaner, 1G Daigger Scientific (https://www.daigger.com) EF8481 Supplemental materials for proper BSL-2 Laboratory disinfection
Miltex brand Disposable Scalpel Size 22 (alternative size to MiniScalpel) AMD Next (www.amdnext.com) 999112314 Supplemental equipment for sample touch impressions; Alternative size to Ag Tek MiniScalpel
N,N-Dimethylformamide, Amber Glass Packaging, 500 mL Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) D119-500
Peroxidase Labeled Streptavidin, 50 mL SeraCare (https://www.seracare.com/) 5550-0001 KPL Immunoassay and Kits Reference Number 71-00-38
Phosphate Buffered Saline Powder (alternative to Fisher liquid PBS) Sigma Aldrich (https://www.sigmaaldrich.com/) P3813 Must be prepared in 1 L distilled water; Available in quantities of 1, 10 and 50 packs
Primary antibody: Polyclonal anti-nucleoprotein or cocktail of anti-lyssavirus biotinylated antibodies Store at 4 °C
PYREX Disposable Serological Pipets, Glass, Sterile, Plugged, Corning, 1.0 mL VWR, part of Avantor (https://vwr.com) 7078D-1 VWR Manufacturer Number 89091-220
PYREX Disposable Serological Pipets, Glass, Sterile, Plugged, Corning, 10.0 mL VWR, part of Avantor (https://vwr.com) 7078D-10 VWR Manufacturer Number 89091-106
PYREX Disposable Serological Pipets, Glass, Sterile, Plugged, Corning, 5.0 mL VWR, part of Avantor (https://vwr.com) 7078D-5 VWR Manufacturer Number 89091-484
Richard-Allan Scientific Gills Hematoxylin Stain No. 2, 1PT (alternative to above) Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) 22-050-201 Thermo Scientific Manufacturer Number 72504
Slide Holders, 24-place VWR, part of Avantor (https://vwr.com) 25608-868 Sakura®Finetek Supplier Number 4465; Available through multiple vendors
Specimen Tin Boxes, 1/2 oz VWR, part of Avantor (https://vwr.com) 101412-452 Supplemental equipment for storage of brain tissue samples
Taylor 2-Event Digital Timer/Clock Multiple Vendors Supplemental equipment
Tissue-Tek Slide Staining Kit VWR, part of Avantor (https://vwr.com) 25608-902 Sakura®Finetek Supplier Number 4551; Available through multiple vendors
TWEEN 80, Polyethylene glycol, 500 mL Sigma Aldrich (https://www.sigmaaldrich.com/) P1754 Also available in 25 mL, 1 L and 1 G volumes
VWR FLIP Pipette Filler (0.05-100 mL) VWR, part of Avantor (https://vwr.com) 53497-055
VWR Soft Nitrile Examination Gloves, L (100 per box) VWR, part of Avantor (https://vwr.com) 89038-272 Supplemental equipment for proper PPE
Water, Deionized (20 L) VWR, part of Avantor (https://vwr.com) 10806-022
Wheaton Clear Glass Sample Vials, 8 mL Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) 06-408C DWK Life Sciences Manufacturer Number 224884
White Coated, Double Well Pattern Microscope Slides, 14 mm Tekdon Incorporated (https://www.tekdon.com/coated-microscope-slides.html) 2-140
White Rectangular UN-rate Disposal Container, 5G Berlin Packaging (https://www.berlinpackaging.com/) 1147T01WHT Supplemental equipment for chemical waste storage/disposal (Formalin)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dean, D. J., Abelseth, M. K., Atanasiu, P. Laboratory techniques in rabies. Meslin, F. X., Kaplan, M. M., Koprowski, H. 23, World Health Organization. eds 88-89 (1996).
  2. Durr, S., et al. Rabies diagnosis for developing countries. PLOS Neglected Tropical Diseases. 2 (3), e206 (2008).
  3. Rupprecht, C., et al. Progress in the development of a direct rapid immunohistochemical test for diagnosing rabies. , (2014).
  4. Rupprecht, C. E., et al. Additional Progress in the Development and Application of a Direct, Rapid Immunohistochemical Test for Rabies Diagnosis. Journal of Veterinary Science. 5 (2), (2018).
  5. Coleman, P. G., Fevre, E. M., Cleaveland, S. Estimating the public health impact of rabies. Emerging Infectious Diseases. 10 (1), 140-142 (2004).
  6. Standard Operating Procedure for the Direct Rapid Immunohistochemistry Test (DRIT) for the detection of rabies virus antigens. , Centers for Disease Control and Prevention. (2016).
  7. Lembo, T., et al. Evaluation of a direct, rapid immunohistochemical test for rabies diagnosis. Emerging Infectious Diseases. 12 (2), 310-313 (2006).
  8. Middel, K., Fehlner-Gardiner, C., Pulham, N., Buchanan, T. Incorporating Direct Rapid Immunohistochemical Testing into Large-Scale Wildlife Rabies Surveillance. Tropical Medicine and Infectious Disease. 2 (3), 21 (2017).
  9. Coetzer, A., Sabeta, C. T., Markotter, W., Rupprecht, C. E., Nel, L. H. Comparison of biotinylated monoclonal and polyclonal antibodies in an evaluation of a direct rapid immunohistochemical test for the routine diagnosis of rabies in southern Africa. PLOS Neglected Tropical Diseases. 8 (9), e3189 (2014).
  10. Kirby, J., et al. Enhanced Rabies Surveillance to Support Effective Oral Rabies Vaccination of Raccoons in the Eastern United States. Tropical Medicine and Infectious Disease. 2 (3), 34 (2017).
  11. Slate, D., et al. Oral rabies vaccination in north america: opportunities, complexities, and challenges. PLOS Neglected Tropical Diseases. 3 (12), e549 (2009).
  12. Direct Rapid Immunohistochemistry Test (DRIT) protocols. , Available from: https://rabiessurveillanceblueprint.org/Direct-Rapid-Immunohistochemistry?lang=fr (2019).
  13. Khalid, A., Haque, A. Touch Impression Cytology Versus Frozen Section as Intraoperative Consultation Diagnosis. 2, (2004).

Tags

Retraksiyon sayı 146 tanı doğrudan hızlı immünhistokimyasal test floresan antikor testi Lyssavirus kuduz zoonozdur
Doğrudan hızlı Immünhistokimyasal testi kullanarak gelişmiş kuduz gözetimi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Patrick, E. M., Bjorklund, B. M.,… More

Patrick, E. M., Bjorklund, B. M., Kirby, J. D., Nelson, K. M., Chipman, R. B., Rupprecht, C. E. Enhanced Rabies Surveillance Using a Direct Rapid Immunohistochemical Test. J. Vis. Exp. (146), e59416, doi:10.3791/59416 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter