Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

ליפידומיקה ותעתיק במחלות נוירולוגיות

Published: March 18, 2022 doi: 10.3791/59423
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Institute of Physiological Chemistry, University Medical Center of the Johannes Gutenberg University Mainz

Summary

מאמר זה מציג פרוטוקול מודולרי עבור ליפידומיקה של רקמות ותעתיק, ושומנים פלזמה במודלים עכבר מחלה נוירולוגית מיקוד שומנים המשמשים דלקת ופעילות עצבית, שומנים ממברנה, שליחים במורד הזרם, ואנזימים קידוד mRNA/קולטנים שבבסיס תפקוד השומנים. הליכי דגימה, עיבוד מדגם, מיצוי וכימות מפורטים.

Abstract

שומנים משמשים כממשק העיקרי לעלבונות מוחיים או לגירויים התורמים למחלות נוירולוגיות והם מאגר לסינתזה של שומנים עם איתותים שונים או תפקוד ליגנד שיכולים להדגיש את הופעתן והתקדמותן של מחלות. לעתים קרובות משתנה ברמה הקדם-סימפטומטית, שומנים הם מקור מתעורר של מטרות סמים וסמנים ביולוגיים. מחלות נוירולוגיות רבות להפגין neuroinflammation, ניוון עצבי, עירור עצבי, כמו סימני היכר נפוצים, בחלקו מווסת על ידי מערכות איתות שומנים ספציפיים. התלות ההדדית והיחסים ההדדיים של סינתזה של שומנים שונים מעוררים ניתוח רב-ליפידי, רב-ליפידי ורב-תפיסתי על מנת להפיק את המשותף והייחודיות של ההקשרים הנוירולוגיים ולזרז את פירוק ההיבטים המכניים של התפתחות המחלה והתקדמותה. רישום תפקידי השומנים לאזורים שונים במוח מקדם את הקביעה של פנוטיפ מולקולרי שומנים בדם ומורפולוגיה הקשורים למחלה נוירולוגית.

מוצג כאן הוא פרוטוקול מודולרי המתאים לניתוח של שומנים ממברנה אותות שומנים במורד הזרם יחד עם mRNA של אנזימים ומתווכים שבבסיס הפונקציונליות שלהם, המופק מאזורי מוח נפרדים הרלוונטיים למחלה נוירולוגית מסוימת ו /או מצב. כדי להבטיח פרופיל ליפידומי השוואתי מדויק, זרימות העבודה וקריטריוני ההפעלה היו ממוטבים ומתוקננים עבור: i) דגימת מוח וחיתוך של אזורי עניין, ii) מיצוי משותף של אותות שומנים מרובים ושומנים ממברנה, iii) מיצוי שומנים כפול / mRNA, iv) כימות על ידי כרומטוגרפיה נוזלית ניטור תגובה מרובה (LC / MRM), ו v) פרופיל mRNA סטנדרטי. זרימת עבודה זו מקובלת על כמויות הרקמות הנמוכות המתקבלות על ידי דגימה של תתי-הקטגוריות המוחיות הנפרדות מבחינה תפקודית (כלומר על ידי אגרוף מוחי), ובכך מונעת הטיה בניתוח רב-מולקולרי עקב הטרוגניות של רקמות ו/או שונות מן החי. כדי לחשוף את ההשלכות ההיקפיות של מחלות נוירולוגיות ולהקים קריאות מולקולריות תרגומיות של מצבי מחלות נוירולוגיות, דגימת איברים היקפיים, עיבוד, וניתוח ליפידומי לאחר מכן, כמו גם ליפידומיקה פלזמה, הם גם נרדפים ומתוארים. הפרוטוקול מוצג על מודל עכבר אפילפסיה חריפה.

Introduction

ההתפתחויות האחרונות בתפקוד של שומנים ותפקידם בהופעה והתקדמות של מחלות נוירולוגיות לפתוח מקומות מחקר ופיתוח חדשים של מטרות טיפוליות חדשות הבהרה מנגנון המחלה1. הבדלים מתועדים בהרכב השומנים באזורים שונים במוח, המודגשים על ידי טכניקות הדמיה מולקולרית מודרניות כגון הדמיית ספקטרומטריית מסה ופרופיל ספקטרומטריית מסה מתקדם, מסיט את הפרדיגמה של חקירת שומנים בדם מכל המוח לכיוון אזורי מוח שונים ודיסקרטיים מבחינה תפקודית. העובדה כי הרכב השומנים משתנה באזורים שונים במוח מעוררת תפיסה חדשה של רגישות השומנים הממברנה ואת איתות השומנים במורד הזרם בתגובה עלבון מוחי או גירויים על פני אזורי המוח ברור מבחינה תפקודית. לפיכך, פרוטוקולי השומנים דורשים פיתוחים חדשים כדי להתמודד עם האתגר של כמויות רקמות נמוכות עבור זיהוי וכימות ברזולוציה מרחבית גבוהה יותר, ובמקביל, ניתוח של רכיבי שומנים מרובים של קרום התא ומסלולי איתות. כמו כן, קביעת אנזימים, ליגנדים שומנים בדם, וקולטנים המעורבים בוויסות רמות ותפקודם היא בעלת חשיבות עליונה כדי להבהיר את מסלולי האיתות המושפעים במחלה נוירולוגית ולהנחות חקירות מכאניסטיות חדשות בהקשר פתופיזיולוגי.

בנוסף לרזולוציה המרחבית המוגברת במוח, ישנם שני קשיים עיקריים המאתגרים את התפתחותן של גישות נוירוליפידומיות חדשות. ראשית, מולקולות איתות השומנים הם בדרך כלל של שפע נמוך מאוד לעומת שומנים המרכיבים את הממברנה. שנית, השומנים מציגים הטרוגניות מבנית גבוהה, קשה לנתח באמצעות גישה אנליטית אחת. לפיכך, שיטות מיצוי ואנליטיות מותאמות לקטגוריות שומנים שונים ומבוצעות בדרך כלל בדגימות רקמות נפרדות2. שיטות ליפידומיות של רובה ציד3 הם כלים מצוינים לחשוף במהירות פרופיל רחב של שומנים ממברנה, בעוד רגישות מוגברת וסלקטיביות הניתנות על ידי גילוי ממוקד ושיטות ספקטרומטריות מסה כימות הם מהוונים לחקירה של שומנים איתותים בשפע נמוך כולל: i) שומנים דלקתיים ii) שומנים מעורבים אפנון של פעילות עצבית, כגון אנדוקנבינואידים (eCBs), שומנים הקשורים חומצות אמינו, שומנים הקשורים, וכו.4,5. כדי להקיף שינויים בשומנים הן בקרום התא והן ברמת האיתות המתרחשים באזורי המוח של מודלים של מחלות נוירולוגיות, בדרך כלל מיצוי השומנים וניתוח מתבצעים בדגימות רקמות נפרדות, המתקבלות מקבוצות בעלי חיים נפרדות או מחצי הכדור השונים, או על ידי ניתוח אזור רקמה גדול יותר לחתיכות מרובות. כאשר רמות mRNA של קולטני אנזימים הם גם עניין, החקירה שלהם בדרך כלל דורשת רכישה של דגימת רקמה ברורה. לדוגמה, החקירה של שומנים ממברנה, קנבינואידים אנדוגני, ו- mRNA ידרוש שלוש דגימות רקמות שונות, (למשל, שתי דגימות עבור שתי שיטות מיצוי שומנים - שומנים ממברנה ואיתות שומנים - ושתי שיטות ניתוח שומנים לאחר מכן - ודגימה אחת לניתוח mRNA). חקירה של שומנים דלקתיים וקנבינואידים אנדוגני דורשים שתי דגימות רקמות נפרדות, שיטות מיצוי, ושיטות ניתוח, בהתאמה. דוגמה נוספת היא חקירת mRNA ושל כל קטגוריית שומנים בדם בדגימת אגרוף למוח או מיקרודיסקציה לייזר אשר כתוצאה מכך דורש שתי בעלי חיים נפרדים כדי להשיג שתי דגימות לכל המוח (תת)אזור. מידה משמעותית של שונות ו/או רבייה לקויה של התוצאות מתרחשת לעתים קרובות במקרים כאלה, שמקורם שונות ביולוגית ו/או הטרוגניות רקמות. בהנחיית מגבלות מעשיות אלה של ניתוח רב-מולקולרי, המתרחשות במיוחד ברזולוציה מרחבית גבוהה במוח, פרוטוקול נוירוליפידומיקה בן שלושה מודולים תוכנן בהיקף: 1) דו-אופן וניתוח משותף על ידי LC / MRM של שומנים דלקתיים (למשל, איקוסנואידים (eiCs)) ושומנים המעורבים אפנון של פעילות עצבית, כגון eCBs2; 2) חילוץ משותף של פוספוליפידים (PLs) ו- eCBs עם LC / MRM רב-תכליתי עוקב וניתוח סריקת אובדן מבשר / נייטרלי2; ו 3) מיצוי כפול של ממברנה (פוספו)שומנים ו- eCBs, כמו גם mRNA, עם ניתוח LC / MRM ו- qPCR או RNA רצף הבאים6. בהתאם לשאלה הביולוגית שיש לטפל בה במחלה נוירולוגית ובאזור המוח העניין, ניתן ליישם שילוב של הפרוטוקול הראשון והשני, או הפרוטוקול הראשון והשלישי, על אותה דגימת רקמות עבור רקמות במשקל של כ -4 מ"ג. הפרוטוקולים הראשון והשלישי ניתן ליישם באופן עצמאי עבור רקמות סביב 2 מ"ג. הפרוטוקול השני יכול להיות מיושם עבור רקמות במשקל קטן כמו 0.5 מ"ג. ללא קשר למודול הפרוטוקול הנוירוליפידומי שנבחר, דגימת הרקמות ועיבוד טרום אנליטי, בידוד המוח וחיתוך האזור, כמו גם ההליך להקרבת המודל החייתי מתוקננים וזהים לכל שלושת המודולים של הפרוטוקול. בחקירה שלנו של מחלות נוירולוגיות, איברים היקפיים הרלוונטיים לתוצאות הפתולוגיות של המחלה נאספים תמיד גם ונותחים באמצעות פרוטוקולים מודולריים אלה. בנוסף, הדם נדגם באופן קבוע עבור ליפידומיקה פלזמה לשמש ככלי קריאה של מחלות נוירולוגיות עם מבט על יישומים תרגומיים פוטנציאליים. פרוטוקול השומנים המודולריים המוצגים כאן הוא רב-תכליתי מאוד: ניתן לשינוי קנה מידה לכמויות רקמות גדולות יותר וישים בקלות כמעט לכל סוג רקמה ומחלה. ליישום הפרוטוקול המודולרי (איור 1) במחלות נוירולוגיות, כל מודל מכרסמים מתוקנן של התפרצות והתקדמות של הפרעות נוירולוגיות, כגון פגיעה מוחית טראומטית, מחלת פרקינסון, מחלת אלצהיימר או אפילפסיה הם מקובלים.

פרוטוקולים אלה יושמו בהרחבה כדי לחקור שינויים בליפידום הרקמה ו/או transcriptome בשלב החריף של אפילפסיה בחומצה קיינית (KA)-induced מודל העכבר של אפילפסיה2,7, מודל בשימוש נרחב במחקרים פרה-קליניים בשל הדמיון לאפילפסיה האונה הטמפורלית האנושית (TLE)8,9,10,111. באמצעות פרוטוקולים אלה, הפוטנציאל הטיפולי של תרופות כגון Palmitoylethanolamide (PEA)12,13 הוערך באותו מודל עכבר של אפילפסיה. המחקר זיהה שינויים בשומנים וב-mRNA ברזולוציה מרחבית גבוהה ונמוכה במוח ובפריפריה, בנקודת הזמן של עוצמות התקפים חריפות מקסימליות (ב-60 דקות אינדוקציה פוסט-איזיותרת), ובטיפול תת-קרקעי וחריף עם PEA בארבע נקודות זמן שונות (20, 60, 120 ו-180 דקות) לאחר אינדוקציה של התקף KA, חלון זמן המכסה את השלב החריף של אפילפסיה. פלזמה, מוחות ואיברים היקפיים של עכברים לא מטופלים המוזרקים ל-KA, עכברים חריפים ומטופלים בתת-גולגולת PEA, כמו גם עכברי בקרה לרכב ו-PEA-Vehicle, נאספו בכל נקודת זמן 12,13, ונחקרו בניתוח מולקולרי זה. הנתונים המולקולריים היו בקורלציה עם פנוטיפים התנהגותיים שהושגו על ידי ניקוד התקפים, כמו גם עם נתונים שמקורם אימונוהיסטוכימיה על תהליכים ניווניות, על מנת לפענח את ההתקדמות של שלב האפילפסיה החריפה ואת הפוטנציאל של PEA להקל עליו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל ההליכים הניסיוניים המתוארים כאן הם בהתאם להנחיית מועצת הקהילה האירופית מיום 22 בספטמבר 2010 (2010/63EU) ואושרו על ידי ועדת בעלי החיים המקומית של מדינת ריינלנד-פאלץ, גרמניה (התייחסות קובץ: 23 177-07/G16-1-075).

1. מודל בעלי חיים של אפילפסיה חריפה ומטופלת באופן מניעתי

  1. בצע אינדוקציה התקפית, טיפול וניקוד התנהגותי.
    1. עכברים נפרדים (מינימום n = 6 עכברים לקבוצה) בכלובים בודדים.
    2. הכן פתרון הזרקת התקף-אינדוקציה ואת הרכב המתאים (ראה טבלה 1), כמו גם פתרון הזרקת טיפול ואת הרכב המתאים (ראה טבלה 2).
    3. להזריק עכברים תוך-פריטוני (כלומר, כלומר) (10 מ"ל/ק"ג מסת גוף של עכבר) ללא הרדמה על פי הזהות הקבוצתית שלהם: מחלה, מטופלים או רכב מטופלים (כלומר, KA, PEA שטופלו ב- KA, ושתי קבוצות הרכב). ראה איור 2, טבלה 1 וטבלה 2.
    4. לפקח ולניקוד את ההתנהגות על פי סולם עוצמת ההתקף הסטנדרטי הבא: 0 = אין תגובה; 1 = חוסר תנועה ובהייה; 2 = הרחבת חזית ו/או זנב, יציבה נוקשה; 3 = תנועות חוזרות ונשנות, ראש מתנדנד; 4 = גידול ונפילה; 5 = גידול ונפילה מתמשכים; 6 = התקפים קלוניים-טוניים חמורים; 7 = מוות14,15 (איור 3).
  2. בצע הליך הקרבה לניתוח ליפידומי ותעתיק.
    1. בארבע נקודות זמן (כלומר, 20, 60, 120 ו-180 דקות לאחר הזרקת KA או רכב בהתאמה), מקריבים שישה עכברים מכל אחת מהקבוצות הבאות: PEA מטופל, רכב אפילפטי לא מטופל PEA 1 ורכב 2, בעקבות פרוטוקולים שאושרו על ידי IACUC.
    2. עשר שניות לאחר כל נקודת זמן הוא הגיע, להרדים את העכברים באמצעות רקמה ספוגה איזופלוריין בתא זכוכית. אשר הרדמה על ידי אובדן רפלקס התיקון, המצוין על ידי חוסר היכולת לנוע תוך היפוך איטי של תא הזכוכית. לערוף את ראשם של עכברים באמצעות מספריים כירורגיים ולאסוף פלזמה, מוח ואיברים היקפיים (ראה שלבים 2.2.2−2.2.4).
      אזהרה: תקנות אתיות להקרבת הליכים משתנות בין ועדות בעלי חיים מקומיות. הקפידו לבדוק ולפעול בהתאם לתקנות שהונפקו על ידי ועדת בעלי החיים המקומית.
  3. בצע את הליך ההקרבה לניתוח אימונוהיסטוכימיה.
    1. עבור כתמים אימונוהיסטוכימיים13, באופן התנהגותי ציון שלושה עכברים מכל אחת מהקבוצות הבאות: PEA מטופל, אפילפסיה לא מטופלת PEA, וקבוצות רכב, לאורך כל הקורס (180 דקות).
    2. להקריב ולהקריב עכברים 5 ימים מאוחר יותר. עכברים מרדימים עמוק (ראה שלב 1.3.1 עבור קבוצות העכבר) על ידי הזרקת i.p. של פנטוברביטל (100 מ"ג / קילוגרם) ו buprenorphine (0.1 מ"ג / קילוגרם) כמו תרופות נרקוטיות. אשר הרדמה עמוקה על ידי אובדן רפלקס בין הבהונות.
    3. לתקן את העכבר על צלחת פוליסטירן מיד לפתוח את בית החזה באמצעות מספריים עדינים מלקחיים סטנדרטיים. מניחים את הפרפר בחדר הלב השמאלי וחותכים את האטריום הימני באמצעות מספריים עדינים.
    4. התאם את המהירות והלחץ של המשאבה לזרימה פריסטלטית מתמדת עם קצב של 2−3 מ"ל / דקה. יש לפזר עם תמיסת מלח עם פוספט קר כקרח (PBS) למשך כ-5 דקות. במידת הצורך, החלף את הפרפר.
      הערה: עם זלוף נכון, האיברים הפנימיים (למעט הטחול) מתחילים להלבין תוך 1 −2 דקות.
    5. החליפו זלוף לפתרון קר כקרח של 4% פרפורמלדהיד (PFA) למשך כ-5 דקות. לבודד מוחות שלמים כמתואר בשלב 2.2.2 ולתקן עבור 24 שעות ב 4% פתרון PFA ב 4 ° C (4 °F).
    6. מוחות דגירה בתמיסת סוכרוז של 30% ל-48 שעות ב-4 °C (60 °F). מוציאים את שאריות הסוכרית עם נייר טישו יבש ומקפיאים את המוח על צלחת מתכת (-80 מעלות צלזיוס). אחסן את המוח בטמפרטורה של -80 °C (80 °F) להליכי ההכתמה13.

2. נהלי דגימה לניתוח ליפידומי/תמלול

  1. היכונו לדגימה.
    1. פרה קול EDTA-צינורות עבור דגימת פלזמה עד 4 °C (65 °F). Precool את צנטריפוגה ומערבולת מנגנון ל 4 °C (50 °F). Precool צלחת המתכת מכוסה רדיד אלומיניום (כדי לשבור מוח קפוא ו / או רקמות אחרות של עניין) על קרח יבש (-80 °C ((-80 °C ).? Precool את שכותרתו 2 מ"ל ו 5 מ"ל צינורות על קרח יבש (-80 °C ((80 °F) עבור aliquots פלזמה, רקמות קפואות, ואיסוף המוח, בהתאמה. השתמש בצינורות ענבר כדי להגן על מולקולות רגישות לאור, כגון eiCs.
    2. נקו את ציוד דגימת הרקמות והבידוד (מספריים כירורגיים, מספריים עדינים חדים ישרים, מלקחיים סטנדרטיים חלקים ישרים, מלקחיים עדינים בגימור מראה, מלקחיים מעוקלים ומרית, צלחת קצף פוליסטירן ומחטים לקיבעון) עם חומר חיטוי (למשל, 70% אתנול).
  2. פרוטוקולי דגימה
    1. קבע את סדר הדגימה.
      1. לאסוף דם מיד לאחר עריפת ראש בצינורות EDTA 1 מ"ל מראש (ראה שלב 2.2.3).
      2. הסר את כל המוח ולהצמיד להקפיא מיד לאחר ההסרה. שלב זה ייקח 1 −2 דקות. אחסן מוח קפוא בטמפרטורה של -80 °C (80 °F) לעיבוד נוסף (ראה שלב 2.2.2).
      3. הסר איברים היקפיים של עניין (למשל, ריאות, לב, כבד), בתוך 5 דקות לאחר הסרת המוח, ולהצמיד להקפיא ולאחסן ב -80 °C (80 °C ( (80 °F) לעיבוד נוסף (ראה שלב 2.2.4).
    2. הסר את המוח להליכי ניתוח או ניקוב. הליך זה לוקח 1 −2 דקות / מוח.
      1. לאחר עריפת הראש (ראה שלב 1.2), התחל לבצע חתך קו אמצע בעור באמצעות מספריים עדינים. שחרר את הגולגולת על ידי היפוך העור על העיניים. להגיע לחלק העליון של הגולגולת ולעשות חתך caudal קטן החל ברמה של העצם התוך-חודית. הימנע חיתוך דרך המוח.
      2. חותכים בחוזקה דרך החלק הקדמי ביותר של הגולגולת בין העיניים כדי להקל על הסרת המוח. הטה צד אחד של העצם הקודקודית באמצעות מלקחיים צרים מעוקלים ונשבר. חזור על השלב האחרון עבור הצד השני.
      3. הסר את המוח קרום המוח. החלק מרית מתחת לחלק הקדמי של המוח (כלומר, נורת הריח) והטה את המוח בעדינות כלפי מעלה. החלק את המרית עוד יותר למטה כדי לשבור את הראייה ועצבים גולגולתיים אחרים.
      4. הרימו את המוח מהגולגולת והקפיאו את כל המוח מיד על צלחת מתכת מצופה מראש (-80 מעלות צלזיוס) עם הצד הגחוני הפונה לצלחת המתכת (הגב למעלה).
      5. אפשר למוח לקפוא לחלוטין ולעבור לצינורות 5 מ"ל מקוצרים מראש ולאחסן בטמפרטורה של -80 °C (80 °F ) עד לחיתוך אזורי המוח או הליך האגרוף (ראה שלבים 3.1. ו -3.2).
    3. בצע דגימת פלזמה.
      1. ספייק מראש EDTA-tubes עם 10 μL של דילול indomethacin מוכן טרי לריכוז יעד של 10 μM.
      2. לאסוף את הדם בתא המטען מיד לאחר עריפת הראש על ידי לחיצה עדינה של הגוף לתוך צינורות EDTA מראש כדי נפח דם מקסימלי של 1 מ"ל.
        הערה: במקרה של לחץ דם תקין, אין צורך בסחיטה. אם נפח הדם הוא פחות מ 1 מ"ל, להקטין את זמן הדגירה isoflurane כדי לאפשר זרימת דם נכונה.
      3. מיד צנטריפוגות צינורות דם ב 2,000 x g במשך 10 דקות ב 4 °C (60 °F).
      4. הסר את שלב הפלזמה העליונה המתקבלת ולצורך ניתוח multilipid aliquot מוגדר נפחי פלזמה בצינורות 2 מ"ל מראש כדלקמן: 50 μL לניתוח eCBs / eiCs, 30 μL לניתוח PLs, ואת נפח הפלזמה הנותר כדגימת הגיבוי או עבור סוגים אחרים של ניתוח.
      5. לאחסן את דגימות הפלזמה ב -80 °C (80 °F) לחילוץ נוסף (ראה שלבים 4.1.2 ו 4.1.4).
    4. בצע דגימת איברים היקפית.
      הערה: השתמש בהפניות לאנטומיה של העכבר16 ובתיעוד שסופקו לקורסי החובה (FELASA) שבהם השתתפו חוקרי בעלי חיים כדי לזהות את האיברים הבודדים, את רקמות החיבור שלהם ו/או את כלי הדם.
      1. לשתק את פלג הגוף העליון של העכבר כדי להקל על הסרת איברים באמצעות מחטים. בצע חתך קו האמצע הגחוני באמצעות מספריים חד ישר בגובה הערווה. השתמש מלקחיים סטנדרטיים בוטים כדי לקבע את דופן הבטן בעת חיתוך כדי לפתוח את חלל הבטן.
      2. לשתק את העור כדי לאפשר הסרת איברי בטן באמצעות מלקחיים קהים. להסרת לב או ריאות, להמשיך לחתוך בינונית בכיוון של מערת השד. הסר את הריאה ו /או הלב באמצעות מלקחיים עדינים.
      3. פתח את חלל השד בזהירות כדי למנוע דימום. חותכים את רקמות החיבור וכלי הדם המעגנים את האיבר המתאים מבלי לחתוך דרך האיבר.
      4. העבר חתיכות רקמה מיד על לוחות מתכת מקורר מראש (-80 °C ((80 °F)) ולאפשר להקפיא לחלוטין. העבר חתיכות רקמה לצינורות מקוררים מראש ולאחסן ב -80 °C (80 °F) לעיבוד נוסף (ראה שלב 4.1).

3. עיבוד חומר ביולוגי

הערה: להפקה משותפת של eCBs / eiCs להשתמש 2 צינורות ענבר מ"ל כמו צינורות החילוץ ולהוסיף בכל צינור שבעה כדורי פלדה מראש. להפקה משותפת של PLs / eCBs ועבור מיצוי משותף של שומנים כפולים ו- RNA, השתמש ב-2 מ"ל של צינורות מיצוי ללא RNAse עם חרוזים קרמיים (טבלת חומרים).

  1. בצע ניתוח מוח ועיבוד איברים היקפיים.
    הערה: השתמש/י במנורות מגדילות כדי להגביר את הנראות של המוח לצורך ניתוח.
    1. נקו את הכלים הכירורגיים, כולל המלקחיים עם טיפים עדינים במיוחד, 2x עם 70% אתנול.
    2. מעבירים את המוחות הקפואים מ-80 מעלות צלזיוס לצלחת פטרי המכילה חיץ פיזיולוגי מתוכנן מראש (pH 5.5) ודאו שצלחת הפטרי היא בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. אפשר למוחות להפשיר לחלוטין כדי לאפשר ניתוח. בדוק בזהירות באמצעות מלקחיים.
      אזהרה: אין לשמור על המוח בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס יותר מהנדרש להפשרה.
    3. קירור מראש צלחת מתכת על קרח (4 °C (4 °F)) ולכסות אותו עם רקמות רטובות ספוגות חוצץ פיזיולוגי קר כקרח (pH 5.5) ולהעביר את המוח עם צד גחון למעלה בזהירות על צלחת מתכת precooled (4 °C (4 °F) על קרח. מכסים אותו ברקמות רטובות ספוגות במאגר פיזיולוגי קר כקרח (pH 5.5).
    4. לנתח אזורי מוח בתוך מקסימום של 5 דקות באמצעות מלקחיים קצה סופר עדין. התחל עם ההיפותלמוס (HYP) וסובב את הצד הגבי כלפי מעלה כדי להמשיך עם הצד הימני. לבודד את ההיפוקמפוס (HCr), קליפת המוח הקדם-מצחית (PFCr), סטריאטום (STRr) וקליפת המוח (cCTXr). ואז לנתח את הצד השמאלי. לבודד את ההיפוקמפוס (HCl), קליפת המוח הקדם מצחית (PFCl), סטריאטום (STRL) וקליפת המוח (cCTXl). לנתח את המוח הקטן ואת האזור התלמי. השתמש בהפניות אנטומיות שפורסמו16,17 לזיהוי אזור המוח.
    5. מעבירים כל חתיכה מנותחת ישירות על צלחת מתכת מצופה רדיד אלומיניום, מקוררת מראש (-80 מעלות צלזיוס). אפשר הקפאה והעבר את אזורי המוח המבודדים בצינורות 2 מ"ל המסומנים מראש.
    6. לרסק את חתיכות הרקמה באמצעות pulverizer רקמות (ב -80 °C (80 °C (80 °F), הימנעות הפשרת הרקמה. בחדר הקר, אבקת רקמת aliquot בצינורות מיצוי מסומנים מראש המכילים חרוזי קרמיקה או כדורי פלדה. עבור ניתוח שומנים כפול / transcriptomics, לשקול את אבקת הרקמות aliquots בחדר הקר. לניתוח ליפידומיקה בלבד, בחרו בין נורמליזציה למשקל הרקמה או לתכולת החלבון. עבור האחרון, להמשיך עוד יותר ללא שקילה רקמות.
    7. חותכים את רקמות האיברים ההיקפיים לחתיכות עם משקל מרבי של 20 מ"ג. המשך עם ריסוק רקמות כמו בשלב 3.1.6.
    8. המשך עם החילוץ של דגימות רקמה (ראה שלבים 4.1.1,1,1,1,3, או 4.1.5) או לאחסן צינורות ב -80 °C (80 °C (80 °C ) לחילוץ מאוחר יותר.
      הערה: ניתן להשתמש במטריצת המוח גם אם תכנון המחקר מאפשר זאת. עם זאת, השיטה מתאימה יותר למספר נפרד ומוגבל של אזורי מוח, ואין זה מעשי לנתח ולבודד את כל אזורי המוח הנ"ל במסגרת הזמן שנקבעה.
  2. בצע חבטות מוח.
    1. הר את כל המוחות הקפואים על מערכת ההרכבה (טבלת החומרים) בקריוסטט. הגדר את העובי ל-50 מיקרומטר ופרוס במצב חיתוך קרוב לאזור העניין.
    2. נתח מוח כתם (18−20 מיקרומטר) באמצעות טולואידין כחול (0.1%−1%) כהתייחסות לוקליזציה של תת-ערך העניין. בדוק את הפרוסות המוכתמות באמצעות מיקרוסקופ כדי לזהות את אזורי העניין שיש להכות. השתמש אטלס עכבר כהפניה כדי למצוא את האזורים האנטומיים המתאימים במוח16. קח אגרופים עם קוטר 0.8 −1.0 מ"מ באמצעות corers מדגם בצינורות מראש.
    3. שקול אגרופים קפואים בחדר הקר בצינורות מיצוי מסומנים מראש של 2 מ"ל המכילים חרוזי קרמיקה או כדורי פלדה. השתמש צינורות ענבר עבור eCBs ו eiCs חילוץ משותף.
    4. התחל את החילוץ (ראה שלבים 4.1.1, 4.1.3 או 4.1.5) או לאחסן צינורות ב -80 °C (80 °F) לחילוץ נוסף.
  3. בצע עיבוד פלזמה.
    1. מניחים את דגימות הפלזמה הקפואות על קרח (4 מעלות צלזיוס) ומניחים להם להפשיר (~ 20 דקות).
    2. ודא כי הפלזמה היא לגמרי לא קפוא לפני תחילת החילוץ.
    3. המשך עם הליך חילוץ הפלזמה (ראה שלבים 4.1.2 או 4.1.4).
      הערה: דגימות פלזמה צריך להישאר ב -80 °C (80 °F) עד החילוץ. הימנע מחזורים של הפשרה והקפאה.

4. הליכי חילוץ

  1. לבצע נוזלי נוזלי נוזלי (LLE) שומנים co-extraction פרוטוקולים.
    1. בצע חילוץ משותף של eCBs ו- eiCs מחתיכות מוח, אגרופים, או דגימות אבקת רקמות.
      הערה: נדרשת הזרמה מדויקת לאורך כל ההליך.
      1. מניחים את צינורות החילוץ המכילים את דגימות הרקמות ושבעה כדורי פלדה על קרח (4 °F ). הוסף 600 μL של MTBE קר כקרח ו 50 μL של ACN / H2O (1:1; v / v) המכיל את הסטנדרטים הפנימיים. ריכוז היעד של התקנים הפנימיים באמצעי האחסון הסופי לניתוח (50 μL) הוא כדלקמן: 1 ng / mL AEA-d4, 125 ng / mL 2-AG-d5, 3,000 ng / mL AA-d8, 2 ng / mL OEA-d4; PEA-d4, 12.5 ng/mL 1-AG-d5, 2.5 ng/mL PGF2α-d4 ו-5 ננוגרם/מ"ל עבור PGD2-d4; PGE2-d9; 5(S)-HETE-d8; 12(S)-HETE-D8; 20-HETE-d6, ו TXB2-d4, בהתאמה.
      2. מוסיפים 400 μL של 0.1 M חומצה פורמית הומוגניזציה עם ליסר רקמה (30 s-1 min). צנטריפוגה הומוגנית במשך 15 דקות ב 5,000 x g ב 4 °C (60 °F). אפשר הקפאה של השלב התחתון מימי במשך 10 דקות ב -80 °C (80 °F) כדי להקל על העברת השלב האורגני העליון.
      3. העבר את השלב האורגני בצינורות חדשים. להתאדות תחת זרם עדין של N2 ב 37 °C (37 °F) ולשחזר ב 50 μL של ACN / H2O (1:1; v / v) לניתוח נוסף.
      4. יש לאחסן את השלב המימי בטמפרטורה של -20 °C (60 °F) או -80 °C (60 °F) לניתוח נוסף של תכולת החלבון.
    2. בצע חילוץ משותף של eCBs ו- eiCs מדגימות פלזמה.
      1. להפשיר aliquots פלזמה ב 4 °C (50 °F). הוסף 800 μL של MTBE ו 50 μL של ACN / H2O (1:1; v / v) המכיל את הסטנדרטים הפנימיים (מקביל לאלה המשמשים לניתוח רקמות, ראה שלב 5.1.1). מטב את הריכוז הסטנדרטי הפנימי עבור spiking באמצעות דגימות פלזמה ייחוס.
      2. הוסף 600 μL של 0.1 M חומצה פורמית ודגימות מערבולת ב 4 °C (60 °F) במשך 2 דקות. דגימות צנטריפוגה ב 4,000 x g במשך 15 דקות ב 4 °C (65 °F).
      3. העבר את השלב האורגני לצינורות חדשים, התאדה תחת זרם עדין של N2 בטמפרטורה של 37 °C (37 °F), ושחזר ב 50 μL של ACN / H2O (1:1; v / v) לניתוח LC / MRM.
        הערה: במידת האפשר, הימנע מאחסון של תמציות מיובשות של eiCs ולהמשיך מיד לניתוח LC / MRM. אם לא ניתן להימנע מאחסון, יש לפנות לאחסון לזמן קצר למשך 2−3 ימים בלבד ב-4° C עם דגימות בממס הזרקת LC.
    3. בצע חילוץ משותף של PLs ו- eCBs מאזורי המוח, אגרופים או דגימות אבקת רקמות אחרות.
      1. מניחים את צינורות החילוץ המכילים את דגימות הרקמה וחרוזים קרמיים על קרח (4 מעלות צלזיוס). הוסף 800 μL של MTBE / MeOH (10:3; v / v) ו - 10 μL של MeOH המכיל את הסטנדרטים הפנימיים. ריכוז היעד של התקנים הפנימיים באמצעי האחסון הסופי לניתוח (100 μL) הוא כדלקמן: 150 ng/mL עבור PC 17:0/14:1, PE 17:0/14:1, PA 17:0/14:1, 100 ng/mL PG 17:0/14:1; נ.ב. 17:0/14:1; PI 17:0/14:1; LPC 17:0; LPA 17:0; SM d18:1/12: 0,1 ng/mL AEA-d4, 60 ng/mL 2-AG-d5, 4,000 ng/mL AA-d8, 2 ng/mL OEA-d2 ו-3 ננוגרם/מ"ל PEA- d4 בהתאמה.
      2. הוסף 200 μL של 0.1% חומצה פורמית המכילה 25 μM טטרהידרליפסטטין / URB597 ו 50 מיקרוגרם / מ"ל BHT. הומוגניזציה עם הרקמה הומוגניזר (טבלת חומרים) וצנטריפוגה ב 5,000 x g ו 4 °C (66 °F) במשך 15 דקות.
      3. לשחזר את השלב האורגני העליון בצינורות חדשים ולהתאדות תחת זרם עדין של N2 ב 37 °C (37 °F). לשפץ ב 90 μL של MeOH או לאחסן ב -20 °C (60 °F) או -80 °C (80 °F) או להמשיך עם השלב הבא.
      4. הוסף 10% H2O כדי aliquot של תמצית השומנים (4.1.3.3) ולהזריק 10 μL ב LC / MS לניתוח PLs. לניתוח eCB נוסף המשך עם שלב 4.3.5.
      5. קח aliquot של התמצית (4.1.3.3), להתאדות ליובש ולשחזר ACN / H2O (1:1; v / v ). השתמש 20 μL עבור הזרקת LC / MS לניתוח eCB.
    4. בצע חילוץ משותף של PLs ו- eCBs מדגימות פלזמה.
      1. להפשיר aliquots פלזמה ב 4 °C (60 °F), להוסיף 1,000 μL של MTBE / מתנול (10:3; v / v) ו 10 μL MeOH המכיל סטנדרטים פנימיים (מקביל לשלב 4.1.3) ומערבולת ב 4 °C (4 °F ( 4 °F ) במשך 1 דקות.
      2. מוסיפים 250 μL של H2O ומערבולת במשך 45 דקות ב 4 °C (65 °F). דגימות צנטריפוגה במשך 15 דקות ב 5,000 x g ו 4 °C (60 °F). לשחזר את השלב האורגני העליון, להתאדות תחת זרם עדין של N2 ב 37 °C (37 °F), ולשחזר ב 90 μL של מתנול לניתוח נוסף LC / MS. אחסן בטמפרטורה של -20 °C (60 °F) או -80 °C (80 °F) או המשך לשלב הבא.
      3. לניתוח PLs, להוסיף 10% מים aliquot של תמצית השומנים (4.1.2.2).
      4. לניתוח eCB, להוסיף 10% מים aliquot של תמצית השומנים (ראה 4.1.4.3), להתאדות ליובש, ולשחזר ב 50% ACN / H2O (1:1; v / v).
    5. בצע מיצוי כפול של RNA ושומנים (מיצוי משותף של PLs ו- eCBs) מדגימות רקמות.
      אזהרה: ודאו שאתם עובדים בתנאים נטולי RNA כדי למנוע השפלה של RNA.
      1. להפשיר אבקת רקמה aliquots או צרורות המוח (ב 4 °C (ב 4 °C )) ולהוסיף 600 μL של מאגר RLT המכיל 5 מיקרומטר THL / URB597, 10 מיקרוגרם / מ"ל BHT, ו 1% β-mercaptoethanol (עבור אחוזים של הנפח הסופי של מאגר הומוגניזציה, ראה שלב 4.1) יחד עם 200 μL של כלורופורם כדי לחלץ צינורות המכילים אגרופי מוח קפואים וחרוזים קרמיים.
      2. דגימות ספייק עם 10 μL של תערובת סטנדרטית פנימית עבור PLs ו eCB מיצוי משותף (ראה שלב 4.1.3) הומוגניזציה באמצעות homogenizer רקמות (מהירות גבוהה, 20 שניות).
      3. העבר lysates לתוך צינורות צנטריפוגה חדשים צנטריפוגה צנטריפוגה במשך 5 דקות במהירות מלאה ו 4 °C (50 °F) כדי לאפשר את הפרדת הפאזה.
      4. לשחזר ולהשתמש בשלב העליון עבור חילוץ RNA באמצעות ערכות הליך חילוץ RNA סטנדרטי (טבלת חומרים). Elute RNA בנפח כולל של 50 μL של מים ללא RNase ולאחסן ב -80 °C (80 °F).
        הערה: המדגם בשלב 4.1.5.4 מקובל הן על ריצוף RNA והן על qPCR באמצעות השיטות והמכשור המתאימים.
      5. השתמש בשלב המכיל כלורופורם התחתון להפקת שומנים בדם. הוסף 800 μL של MTBE / מתנול (10:3; v / v) ו 200 μL של 0.1% חומצה פורמית ומערבולת במשך 45 דקות ב 4 °C (4 °F). לשחזר את השלב האורגני העליון ולהתאדות תחת זרם עדין של N2 ב 37 °C (50 °F).
      6. תיקון ב 90 μL של מתנול לניתוח נוסף LC / MS. יש לאחסן בטמפרטורה של -20 °C או -80 °C (80 °F) או להמשיך לשלב 5.
      7. הוסף 10% H2O ל aliquot של תמצית שומנים בדם (ראה לעיל שלב 4.1.5.6) ולהזריק 10 μL ב LC / MS לניתוח PLs. לניתוח eCB נוסף המשך עם שלב 5.7.
      8. קח aliquot של התמצית (ראה לעיל שלב 4.1.5.6) להתאדות ליובש ולשחזר ACN / H2O (1:1; v / v ). השתמש 20 μL עבור הזרקת LC / MS לניתוח eCB (מקביל לשלב 4.3.5).

5. פרופיל איכותי וכמותי LC/MRM

  1. הכן מערכות ממס LC, פתרונות כיול ודגימות בקרת איכות.
    1. עבור PLs, להכין שלב נייד A: מתנול / מים (1:1; v / v) המכיל 7.5 מ"מ אמוניום formate ו 0.1% תה. הכן שלב נייד B: מתנול / איזופרופנול (2:8; v / v) המכיל 7.5 מ"מ אמוניום formate ו 0.1% תה. לאחסן ממיסים בבקבוקי LC.
    2. להפרדת eCB ו- eiC, הכן את ממסי ה- LC הבאים: 0.1% חומצה פורמית כשלב A נייד, ו- 100% ACN המכיל 0.1% חומצה פורמית כשלב B נייד.
    3. הכן בקרות איכות באמצעות תקני הכיול והתקנים הפנימיים (טבלה 3) בריכוז אקווימולרי או מוגדר על-ידי המשתמש.
    4. הכן עקומות כיול עם שבע נקודות ריכוז. השתמש באותה אצווה סטנדרטית פנימית כדי לסמן את פתרון עקומת הכיול ובדגימות שיש לנתח.
  2. השתמש בשיטת LC-MRM עבור פרופיל שומנים איכותי וכמותי.
    1. פתח את הכרטיסיה בניית שיטת רכישה בתוכנה המסחרית (לדוגמה, אנליסט) ובחר מצב LC/MRM עם החלפת קוטביות. הגדר בשיטה את מעברי היונים (כפי שניתנו בטבלה 3) ליצירת פרופילים כמותיים. הגדר את זמן ההתיישבות ל-50 אלפיות השנייה.
    2. עבור פרופיל PLs, הגדר את הפרמטרים הבאים של מקור היונים: גז וילון = 40 פסאיי; טמפרטורת תנור מקור = 550 °C (550 °F); מתח תרסיס יון = -4,500 V במצב יון שלילי ו = +5,200 V במצב יון חיובי.
    3. לניתוח משותף של eCBs ו- eiCs, הגדר את הפרמטרים הבאים: גז וילון = 40 פסאיי; טמפרטורת תנור מקור = 550 °C (550 °F); מתח ריסוס יון = -4,500 V במצב יון שלילי ו = +4,500 V במצב יון חיובי.
    4. לניתוח PL, הגדר את חימום העמודות ל- 45 °C וקצב זרימה ל- 200 μL / min והגדר את השיפוע הבא: דקה 0 = 40% B; דקה 3 = 40% B; דקה 42 = 90% B; דקה 43 = 99% B; דקה 50 = 99% B, ודקה 52 = 40% B. הגדר את נפח ההזרקה ל- 10 μL.
    5. לניתוח eCB ו- eiCs, הגדר את טמפרטורת העמודה בטמפרטורת החדר והגדר את שיפוע הלכת הבא: min 0 = 20% B; דקה 1 = 20% B; min 5 = 50% B, min 12 = 50% B; min 13 = 90% B, min 17 = 90% B; דקה 17.5 = 20% B; דקה 20 = 20% B. הגדר את נפח ההזרקה ל 20 μL.
      הערה: תנאי MRM עשויים להשתנות בין פלטפורמות אינסטרומנטליות, ולכן פיצול ותנאי MRM צריכים להיות מוסקים באופן ניסיוני ופרמטרים יינון צריך להיבדק ולהתאים במידת הצורך על מנת לקבל רגישות מקסימלית וסלקטיביות.
  3. בצע ניתוח אצווה.
    1. פתח את אצוות Build Acquisition ומלא את הפרמטרים הנדרשים עבור תיאור לדוגמה, מיקום בארון התקשורת לדוגמה של autosampler ושיטת הרכישה (מוגדר כשלב 5.2).
    2. כלול תמיד בקרות איכות בתחילת הניתוח ובסוף הניתוח ובתוך האצווה. לאחר כל 25−30 דגימות, לכלול לפחות שלוש עקומות כיול בתוך האצווה ולכלול שלב לשטוף עם ממס של בחירה לאחר כל מדגם בקרת איכות, עקומת כיול, ובסוף אצוות המדגם.
    3. העבר דגימות שהושגו בשלב 4 בבקבוקוני LC/MS. מקם את הדגימות במתלי הטעינה של הדגימה האוטומטית LC בהתאם למיקום המוגדר באצווה וטען את מתלה הדגימה בדגימה האוטומטית LC.
    4. שלח ניתוח אצווה ולהתחיל בתור.
  4. כימות שומנים בדם
    1. השתמש בתוכנה המסחרית (לדוגמה, אנליסט) ובמודול הכימות המוטמע עבור eCBs וכימות eiCs ותוכנה מסחרית (לדוגמה, Multiquant) לכימות PLs.
      הערה: התוכנה השנייה יכולה לשמש גם עבור eCBs ו- eiCs, במיוחד כאשר תקן פנימי אחד משמש לכימות של ניתוחים מרובים.
    2. פתח את שיטת כימות הבנייה ומלא את הפרמטרים עבור ניתוחים, תקנים פנימיים, מעברי MRM וייחס את הסטנדרטים הפנימיים לניתוחים שיש לכמת (טבלה 3). הגדר את גובה השיא המינימלי ל- 500 cps.
    3. השתמש בקריטריונים הבאים או שילוב שלהם עבור הקצאת זהות השומנים וכימות הבאים6: התאמת זמן שמירה של ניתוחים אנדוגניים שומנים בדם עם תקני כיול, ו /או סטנדרטים פנימיים deuteated, כאשר זמין; יון קטע התאמת על ידי פיצול מצב יון חיובי ושלילי עבור m / z נתון של ניתוחי שומנים אשר לא מסופקים סטנדרטים; ספרות הסקתה התנהגות התחמקות של שומנים בתנאי LC מועסקים באופן דומה לנתח מבנים איסומריים ו/או איזובריים; וכן, כאשר זמין, ניתוח LC / MS ו- MS / MS עם ספקטרומטריית מסה ברזולוציה גבוהה, תוך שימוש בתנאי LC דומים כמו לניתוח ממוקד (באמצעות LC / MRM), כדי לזהות במדויק את זהות והתנהגות ההמלטה של שומנים אנדוגניים של עניין18,19.
    4. לאימות ניתוח אצווה, השתמש בקריטריונים הבאים: דיוק הכימות ≤ ±20%; מקדם רגרסיה ≥0.97 ≥ (באופן אידיאלי ≥0.99).
      הערה: פעל בהתאם להנחיות לפיתוח ואימות שיטה ביואנליטית כדי להבטיח ניתוח אמין וניתן לשחזור של מולקולות היעד.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ניתן לשלב את מערכת הפרוטוקולים המתוארים ברמות שונות באופן ספציפי למטרה, כגון בחירת מודל בעלי חיים, מסלול דגימה, שיטת מיצוי ופרופיל (איור 1).

על מנת לקבוע שינויים ברמת השומנים במוח ובפריפריה לאורך זמן של מצב התקף אפילפטי חריף ולפענח את ההשפעה האנטי-אפילפטית הפוטנציאלית13 של PEA והשפעתה על שינויים בליפידום במוח ובפריפריה, שלוש קבוצות בעלי חיים ניסיוניות טופלו ברכב, KA כדי לגרום לאפילפסיה חריפה, ו- PEA כמועמד לתרופה אנטי-אפילפטית. PEA ניתן באמצעות i.p. לפני הזרקת KA (למשל, עם הזרקת PEA אחת לטיפול אקוטי ושתי זריקות PEA לטיפול תת-קרקעי). לצורך ניתוח מולקולרי מרובה ו/או כתמי אימונוהיסטוכימיה במשך 5 ימים לאחר הטיפול, הניסויים בבעלי חיים חזרו על עצמם לפי הצורך (איור 2).

KA-אינדוקציה של התקפים אפילפטיים חריפים מובילה לעוצמת התקף מקסימלית 1 שעה לאחר הזרקה15 (איור 3). כדי לפענח את המוח ושינויים ברמת השומנים ההיקפיים במצב של עוצמות התקפים מקסימליות, עכברים הוקרבו ב 1 שעות לאחר KA-הזרקה, ואחריו פלזמה, המוח, ודגימת איברים היקפיים. מוחות קפואים נותחו בשישה אזורי מוח (ראו שלב 3.1). אזורי המוח ורקמות האיברים ההיקפיים (הלב והריאות) נופצו כדי להשיג דגימות רקמות הומוגניות, ולאחר מכן נמחצו עבור שני פרופילים ליפידומיים של eCBs ו- eiCs (איור 4A ושלב 4.1.1) ו- PLs ו- eCBs (איור 4B ושלב 4.1.3).

פרוטוקול החילוץ הכפול (ראה שלב 4.1.5) הוחל כדי לבצע PLs/eCBs ו- RNA ברזולוציה מרחבית גבוהה יותר באמצעות יצירת פרופילים מחבטות מוח באזורים שונים: ההיפותלמוס (HYP), אמיגדלה בזולטרית (BLA) והיפוקמפוס הגחון (vHC) והגב (dHC) (איור 5). אגרופים נדגמו (ראו שלב 3.2) מעכברים אפילפטיים הנגרמים על ידי KA ועכברי בקרה במצב של התקף מקסימלי בהזרקה של שעה אחת לאחר KA (איור 2).

כדי להעריך את מידת ההבחנה הנוירודגנרציה ולייחס שינויים בליפידת השומנים להיקף ההתפתחות העצבית עם אפילפסיה ועם טיפול חדש באפילפסיה עם PEA, הכתמים כפולים אימונוהיסטוכימיים בוצעו בחלקים במוח (ראו שלב 1.3) שנדגמו 5 ימים לאחר התקפים אפילפטיים הנגרמים על ידי KA (איור 2) בעכברים ללא טיפול PEA תת-קרקעי (אמצע), עם טיפול PEA תת-קרקעי (מימין) ובעכברים מוזרקים מלוחים (משמאל) (איור 6) ). אפילפטיקוס מצב המושרה על ידי KA (SE) גרם לאובדן מסיבי של אות NeuN, בעיקר באזור CA1, CA3 והילוס של ההיפוקמפוס, מלווה באירועים אפופטוטיים המצוינים באות כספית-3 (CASP3) (איור 6, תמונה אמצעית) בהשוואה לפקד (איור 6, תמונה שמאלית). טיפול PEA Subchronic (תמונה ימנית) השתמר במיוחד חלבון גרעיני עצבים (NeuN) אות, בעוד אות (CASP3) בקושי ניתן לזיהוי.

פתרון הזרקת KA ו- SAL .
פתרון הזרקת KA (נפח סופי של 8 מ"ל):
1. לשקול 24 מ"ג KA בצינור 15 מ"ל (זהירות: ללבוש glothes ומסכה)
2. מוסיפים 8 מ"ל תמיסת מלח ומערבולת במשך 10 דקות
3. יש לשמור על 4°C לאחסון intermdediate
4. תיקון לטמפרטורת החדר ולמערבולת לפני ההזרקה
פתרון הזרקת רכב 1 (נפח סופי של 8 מ"ל):
דלג על שלב 1 והמשך בשלבים 2-4

טבלה 1: הכנת תרופה הגורמת לתפיסה ויישום רכב 1. שלבים להכנת פתרון הזרקת חומצה קיינית (KA) עבור 24 זריקות תוך-אפריטוניות (10 מ"ל/ק"ג) בריכוז סופי של 30 מ"ג/ק"ג ופתרון הזרקת הרכב המתאים (רכב 1)1.

PEA- ו SAL / DMSO / קרמפור (18:2:1, (v / v / v / v)) פתרון הזרקה.
פתרון הזרקת PEA (נפח סופי של 8 מ"ל):
1. לשקול 32 מ"ג PEA בצינור 15 מ"ל
2. מוסיפים 0.4 מ"ל DMSO ומערבולת במשך 10 דקות
3. מוסיפים 3.4 מ"ל SAL ומערבולת במשך 5 דקות
4. תערובת סוניקאט במשך 5 דקות ב 36°C
5. מוסיפים 0.4 מ"ל קרמפור ומערבולת במשך 5 דקות
6. Sonicate במשך 1 דקה ב 36°C ולהוסיף 3.4 מ"ל SAL
7. מערבולת במשך 30 שניות sonicate במשך 3 דקות ב 36°C
8. שמרו על התמיסה בטמפרטורה של 36°C במהירות נמוכה בשייקר ובמערבולת לפני ההזרקה
פתרון הזרקת רכב 2 (נפח סופי של 8 מ"ל):
דלג על שלב 1 והמשיך בשלבים 2-8

טבלה 2: הכנת תרופה אנטי אפילפטית ויישום רכב 2. צעדים מופתיים להכנת פתרון הזרקת Palmitoylethanolamide (PEA) עבור 24 זריקות תוך-אפריטוניות (10 מ"ל/ק"ג) בריכוז סופי של 40 מ"ג/ק"ג ופתרון הזרקת הרכב המתאים (רכב 2)1.

מצב יון חיובי
תקני כיול נבחרים PLs סטנדרטים פנימיים תואמים
אנליטה יון מבשר יון מוצר m/z אנליטה יון מבשר יון מוצר m/z
שם m/z שם m/z
AEA 348.3 62.1 AEA-d4 352.3 66.1
2-AG 379.1 287.2 2-AG-d5 384.2 287.2
OEA 326.2 62.1 OEA-d2 328.2 62.1
אפונה 300.2 62.1 PEA-d4 304.2 62.1
מחשב 16:0/18:1 760.59 184.07 מחשב 17:0/14:1 718.54 184.07
מחשב 18:2_20:4 806.57 184.07
מחשב 18:0_20:4 810.6 184.07
LPC 18:0 524.37 184.07 LPC 17:0 510.36 184.07
LPC 20:4 544.34 184.07
SM d18:1/18:0 731.61 184.07 SM d18:1/12:0 647.51 184.07
מצב יונים שלילי
תקני כיול נבחרים PLs סטנדרטים פנימיים תואמים
אנליטה סימן מקדים יון m/z יון מוצר m/z אנליטה יון מבשר יון מוצר m/z
שם שם m/z
א.א. 303.05 259.1 AA-d8 311.04 267
5(ים)-HETE 319.48 115 5(ים)-HETE-d8 327.48 116
8(ים)-HETE 319.48 155 12(S)-HETE-d8 327.48 184
12(ים)-HETE 319.48 179
15(ים)-HETE 319.48 219
19(ים)-HETE 319.48 231
20-HETE 319.48 289 20-HETE-D6 325.48 295
LxA4 351.5 115.2 LxA4-d5 356.5 115
PGF2 α 353.48 309.2 PGF2 α-d4 357.5 313.3
TxB2 369 169 TxB2-d4 373 173
PGE2 351.47 315.3 PGE2-d9 360.25 324.3
PGD2 351.47 315.3 PGD2-d4 355.25 319.3
11β-PGF2 α 353.24 193
RvD1 375.22 215.1 RvD1-d5 380.22 180.2
PE 16:0/18:1 716.52 281.25 PE 17:0/14:1 674.48 225.19
PE 38:4 766.54 303.23
PE 40:6 790.54 303.23
PE 40:4 794.57 303.23
הרשות הפלסטינית 16:0/18:1 673.48 255.23 PA 17:0/14:1 631.43 269.25
LPA 16:0 409.24 153 LPA 17:0 423.25 153
LPA 20:4 457.24 153
מדד המחירים לצרכן 20:4 619.29 303.23
פ"ג 16:0/18:1 747.52 281.25 PG 17:0/14:1 705.47 225.19
PG 16:1_20:4 767.49 303.23
פ"ג 18:1_20:4 795.52 303.23
PI 16:0/18:1 835.53 281.25 PI 17:0/14:1 793.49 269.25
נ.ב. 16:0/18:1 760.51 255.23 נ.ב. 17:0/14:1 718.47 269.25
נ.ב. 36:4 782.49 303.23
נ.ב. 38:4 810.53 303.23
PI 16:0/18:1 835.53 281.25 PI 17:0/14:1 793.49 269.25
PI 36:4 857.52 303.23
PI 38:4 885.55 303.23
C1P d18:1/16:0 616.47 78.9 C1P d18:1/12:0 560.41 78.9
S1P d18:1 378.24 78.9 S1P d17:1 364.23 78.9

טבלה 3: תקני שומנים בדם ומעברי MRM לניתוח ליפידומיקה ממוקדת. תוכן הטבלה פורסם במקור ב- Lerner et al.2

Figure 1
איור 1: מבט כולל על מודולי זרימת העבודה. בהתאם למטרת המחקר ומסלולים שונים של דגימה, מיצוי ופרופיל ניתן לשלב כדי לאפשר תוצאה משמעותית למחקר. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: תכנון ניסיוני של מודל התקפים אפילפטיים המושרה בחומצה קיינית חריפה (KA) בעכברים. עכברים מטופלים עם 1) תמיסת מלח (10 מ"ל / קילוגרם i.p.); 2) KA (30 מ"ג /ק"ג i.p.); ו/או 3) (תת) מטופל מראש כרונית (1−2x 40 מ"ג/ק"ג i.p.) עם תרכובת אנטי אפילפטית פוטנציאלית Palmitoylethanolamide (PEA). עשרים וארבעה עכברים לכל קבוצה טופלו כנ"ל והתנהגות הושגה כדי להעריך את עוצמות ההתקפים. שישה עכברים לכל קבוצה הוקרבו בכל אחת מארבע נקודות הזמן השונות (T1−T4) כדי לקבוע שינויים ברמת השומנים לאורך זמן של מצב התקפים אפילפטיים חריפים במוח, איברים היקפיים ופלזמה. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: ניקוד התנהגותי לאורך זמן של חומצה קיינית חריפה (KA) הנגרמת על ידי אפילפסיה לעומת פקדים. הערכה של עוצמות התקפים על פני פרק זמן של 180 דקות לאחר אינדוקציה KA-התקף (n = 24) או הזרקת תמיסת מלח (n = 24) נתון כציונים התנהגותיים ממוצעים. לא נמצאו הבדלים בין הרכב 1 לבין הרכב 2 קבוצות מוזרקות. קווי שגיאה = SEM. מדידה חוזרת של ANOVA הניבה אינטראקציות משמעותיות בין נקודות הזמן של המדידות לבין קבוצות הבדיקה, מה שמצביע על השפעות משמעותיות של טיפול KA על ציונים התנהגותיים. עוצמות ההתקפים של עכברים שטופלו ב- KA פורסמו במקור ב- Post et al.13פלאז לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 4
איור 4: רמות השומנים במוח וברקמות היקפיות במצב של התקף אפילפטי חריף. שינויים ברמת השומנים המוצגים כערך ממוצע ± SEM בעוצמת ההתקפים המרבית (למשל, 1 h לאחר KA הזרקה) על פני שישה אזורי מוח (n = 9): קליפת המוח (cCTX), סטריאטום (STR), אזור תלמי (THL), היפוקמפוס (HC), ההיפותלמוס (HYP), המוח הקטן (CER), כמו גם רקמת הלב והריאה בעכברים אפילפטיים הנגרמים על ידי KA (ערך עליון) ובקרות (ערך נמוך יותר). רמות השומנים הבסיסיים ברקמות מתוארות באפור. הערכים של PLs, 2-AG ו- AA ניתנים ב- nmol/g. והערכים עבור NAEs, eiCs ו- AEA ב- pmol/ g, בהתאמה. כל רמות השומנים מנורמלים למשקל הרקמה. כדי להדגיש את השינויים המולקולריים הספציפיים, רמות השומנים של העכברים שטופלו ב- KA מיוצגים כאחוז של מלוחים מוזרק (KA / sal) במפת חום המציגה ערכים מופחתים בעוצמת התקף חריפה בהשוואה לשליטה מתוארים בכחול בהיר וברמות המוגברות בהשוואה לשליטה באדום, בהתאמה. הם נחשבים משמעותיים בערך p <0.05. נתונים אלה פורסמו במקור ב Lerner et al.2Please לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 5
איור 5: מיצוי כפול של eCBs/PLs ו-RNA ליצירת פרופיל כמותי מחבטות מוח של עכבר. (א) התפלגות כמותית של רשימות PLs ו- eCBs נבחרים לרוחב: 1) תת-ייצוג של ההיפותלמוס (HYP); 2) האמיגדלה הבסולטרלית (BLA); ו-3) תת-הדרגות הגחון (vHC) והגב (dHC) של ההיפוקמפוס, מעכברי ההתקף האפילפטי המושרה על-ידי KA (ערך עליון) לעומת הפקדים (ערך נמוך יותר) (n = 10). רמות מנורמלות למשקל הרקמה (אגרופים תואמים כ 0.5−1.5 מ"ג) ובא לידי ביטוי nmol / g. רק AEA באה לידי ביטוי ב- pmol / g. רמות השומנים מוצגים כערך ממוצע ± SEM. וריאציה ממוצעת לכל אזור מוח מנוקב (SEM כאחוז ממוצע, ממוצע על כל השומנים) הוא: HYP = 7.83%; BLA = 7.80%; vHC = 6.28%; ו- dHC = 7.90%, בהתאמה. (B) רמות ביטוי יחסיות של אנזימים אנדוגניים וקולטנים המעורבים איתות שומנים בדם, כמו גם סמנים לפעילות המוח נחקר ברמת mRNA באזורים שונים במוח/subregions מעכברים הכפופים להתקף אפילפטי שנגרם על ידי KA (אדום) ובקרות (אפור בהיר). ניתוחים סטטיסטיים של ההבדל בין אמצעים קבוצתיים בוצעו באמצעות מבחן t של סטודנט דו-זנבי שלא תוקן ונחשב משמעותי בערך p <0.05 (n = 10). נתונים אלה פורסמו במקור ב Lerner et al.7Please לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 6
איור 6: נוין אימונוהיסטוכימיקלים וכתם כפול CASP3. חמישה ימים לאחר הזרקת KA אימונוהיסטוכימיה בוצעה על קטעים במוח מעכברים מוזרקים מלוחים מטופלים (משמאל), עכברים מטופלים מראש PEA תת-קרקעית (אמצע), ועכברים אפילפטיים ללא טיפול מקדים (מימין). טיפול מקדים PEA מראה השפעות neuroprotective בהשוואה לעכברים אפילפטיים מטופלים (n = 3). נתונים אלה פורסמו במקור ב- Post et. al.13נא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

המתודולוגיה הנוירוליפידומית והתעתיקית המתוארת כאן היא אמצעי מעשי לחקור כל מחלה או התפתחות בריאה ברזולוציה מרחבית גבוהה ונמוכה במוח ובאיברים היקפיים. בשל דגימת פלזמה אופטימלית וטיפול בהליכים, ניתוח ליפידומי פלזמה יכול להתבצע גם מאותם בעלי חיים שהוקרבו עבור ליפידומיקה רקמות תמלול, ובכך לשפר את האמינות של רקמות דם מולקולרי קורלציה וגילוי סמנים ביולוגיים. מתן קבוצה רחבה של נתונים על ידי יישום של אחד משלושת הפרוטוקולים או שילובים שלהם, הוא בעל ערך לחקור לא רק מחלה נוירולוגית בתוך הקשר (ניסוי מודל בעלי חיים) אלא גם על פני ובין הקשרים מודל ניסיוני. יתר על כן, רמה גבוהה של סטנדרטיזציה של דגימה, עיבוד וניתוח מולקולרי מאפשרת רבייה גבוהה של נתונים מולקולריים, ומכאן התייחסות אמינה לשינויים מולקולריים בין ובתוך מחקרים ומעבדות.

עם זאת, כדי להשיג זאת, ההתקנה של עיצוב ניסיוני המציע את פוטנציאל הקריאה המרבי עבור מטרת המחקר המוגדרת היא קריטית. כדי להשיג השוואה אמינה של השינויים המולקולריים בין קבוצות ניסוי, מומלץ להשתמש מינימום של עשרה בעלי חיים כדי לפצות על השתנות בעלי חיים ואת הטווח הביולוגי של רמות השומנים. כאשר רכישת בעלי חיים ו/או לוגיסטיקה של טיפול בבעלי חיים הם מגבילים, שימוש במינימום של שישה בעלי חיים לכל קבוצה הוא הכרחי כדי להרשות לעצמו ניתוח סטטיסטי בטוח. חישובי גודל קבוצה צריכים לפצות על שיעורי התמותה הקשורים למודל (כלומר, מינימום של שישה, באופן אידיאלי עשרה, בעלי חיים לכל קבוצה נדרשים למחקר למרות שיעור התמותה האפשרי של המודל). דרישה קריטית היא להבטיח בעלי חיים מותאמי גיל, מין ומתח לכל קבוצת ניסוי. עבור שלב הגילוי, חיוני להשתמש באותו ספק עבור בעלי חיים ניסיוניים עבור כל המחקרים ואת אותה אצווה בעלי חיים במידת האפשר, על מנת למנוע הטיה של הממצאים בשל הבדלים פנוטיפ התנהגותיים ומולקולריים אפשריים בין קבוצות בעלי חיים. כדי להבטיח אמינות ושחזור של פנוטיפ מולקולרי והתנהגותי שנקבע במחקרים, זה קריטי לבצע ניתוח שכפול ביולוגי במידת האפשר.

צעד מכריע נוסף הוא להקים עבודה ניסיונית סטנדרטית ומתוזמנת עם קבוצות בעלי חיים. חובה לטפל בבעלי החיים באותו חלון זמן של היום כדי לעקוף את השונות המולקולרית הביולוגית. השעה ביום צריכה להיות מוגדרת על פי ההשפעה הידועה של השעון הביולוגי על סינתזה והשפלה של מולקולות היעד או נשמר עקבי עבור כל קבוצות הניסוי כאשר אין מידע על השפעות השעון הביולוגי זמין. באופן דומה, תנאי הדיור וההאכלה לפני הקרבת בעלי חיים חייבים להישמר באופן עקבי ונשלט בקפדנות על פני מודלים ניסיוניים. זה רלוונטי במיוחד עבור פרופיל ליפידומי עקב השפעת תזונה על פלזמה שומנים ומטבוליזם רקמות. ניהול של תרופות טיפוליות או גורמות למחלות צריך להתבצע תמיד במקביל לניהול הרכב בקבוצות ביקורת, לפיהן הרכב חייב להיות זהה לזה המשמש עבור מינהל התרופות. על מנת לבחור את זן המכרסמים המתאים ביותר ו/או substrains לצורך המחקר, אסטרטגיות הטיפול מבוססות התרופה צריכות להתבצע על פי ספציפיות התרופה במונחים של זמן ותדירות של ניהול, מינונים ותוואי הממשל, ואת הרגישות הספציפית לתרופות של זנים שונים להסיק מן הספרות ו / או ניסיון קודם. חקירת קורס זמן של מחלה ותגובה לטיפול מעורבים קבוצות גדולות או קבוצות בעלי חיים מרובות הוא בלתי אפשרי לבצע ביום אחד במונחים של טיפול, הקרבה, ודגימה. במקרים כאלה, עיבוד קבוצת בעלי חיים חייב להיות מתוזמן ובוצע בימים רצופים, אבל שמירה על אותם תנאים במונחים של זמן היום, עיצוב ניסיוני, זמן עיבוד, חוקרים, וכו '. הכנת זריקות כימיות היא צעד קריטי נוסף. תרכובות הגורמות לתרופות או מחלות חייבות להיות מוכנות טריות לפני הממשל ובהתאם למפרט התרופה. השימוש באותה אצווה הייצור של התרופה מומלץ עבור כל cohorts להיות בהשוואה. זה חשוב במיוחד במקרה של ניסוחים תרכובות טבעיות כגון חומצה קיינית (KA) המשמש במחקר זה עבור אינדוקציה אפילפסיה.

כדי לאפשר פרופיל ליפידומי או תמלול אמין, הליך הקרבת בעלי החיים חייב להתבצע באופן עקבי על פני קבוצות בעלי החיים בתוך מסגרת זמן של 5 דקות. אם הדם נאסף לאחר עריפת הראש, חשוב לשמור על כמות קבועה של איזופלוראן בתא הזכוכית. לשם כך, להשרות לעתים קרובות (לאחר חמישה שימושים) עם isoflurane ולא יעלה על 10 s למשך ההרדמה באמצעות isoflurane, על מנת למנוע הופעת הפרעות קצב ודפיקות לב ולהבטיח לחץ דם תקין עבור דגימת פלזמה.

יש להקפיד על תנאים לדגימה וטיפול בחומרים ביולוגיים (למשל, חלון הזמן וסדר הדגימה והטיפול בחומרים ביולוגיים) ולשמור על זהות לכל הקבוצות. כדי למנוע דרגות משתנות של הפשרת רקמות ומכאן שינויים לא עקביים ברקמת ex vivo של רמות השומנים ו/או mRNA, חיוני לשמור על תנאי זמן וטמפרטורה מבוקרים בקפדנות לאחר הדגימה
אחסון. ניתוח רקמות או ניקוב, ועיבוד וניתוח מדגם עוקב (ראה סעיפים 3 ו -4). מוחות שלמים שנדגמו לאחרונה יכולים להיות מנותחים באופן מיידי על צלחת מתכת מקוררת מראש (4 °C (60 °F) ללא snapfreezing מראש, אם הגודל של קבוצות בעלי החיים הניסיוני מאפשר הקרבה של בעלי חיים, הסרה, וחיתוך מבלי לשנות את מסגרת הזמן המצוינת כאן עבור כל אחד מההליכים האלה. אם גודל קבוצות הניסוי אינו מעשי עבור הליכים אלה, מומלץ להקפיא את המוח ואת הניתוח שלאחר מכן כדי לאפשר זמן דומה ומבוקר לעיבוד. כאשר מקפידים על הפרוטוקולים והנחיות ציר הזמן המצוינים כאן, לא נצפו פערים בין רמות מולקולריות שהושגו על ידי הפקה של אזורי מוח שניתחו זה עתה ואזורי מוח שניתחו זה עתה וניתחו ממוחות קפואים.

היבט קריטי להשגת שונות רבייה ומינימלית של רמות השומנים בתוך ובין קבוצות, מלבד עיבוד המדגם בתנאי טמפרטורה מבוקרים בקפדנות, הוא מתן נוגדי חמצון (ראה סעיפים 2 ו -3). הימנעות מכל גורמי מתח (למשל, ריח הדם) של בעלי החיים לפני ההקרבה היא בעלת חשיבות עליונה, שכן שומנים רבים המעורבים בפעילות עצבית כגון eCBs יכולים להשתנות במהירות בתגובה ללחץ.

עבור מיצוי השומנים וניתוח, זה חיוני כדי להכין טרי את הסטנדרטים הפנימיים, פתרונות כיול, ממיסים חילוץ ביום החילוץ. אותו מקור של סטנדרטים פנימיים חייב לשמש הן להכנת עקומת הכיול והן לחילוצים מדגמיים. כמו כן, בעקבות תנאי טמפרטורה מבוקרים בקפדנות עבור מיצוי מדגם, אחסון וניתוח הוא בעל חשיבות עליונה כדי למזער ולשלוט ex vivo enzymatic או שינויים כימיים של מולקולות. עבור ניתוח LC / MRM, קבוצה של שומנים ממוקדים ניתן להתאים את מטרת המחקר על ידי הוספה או הסרה של מטרות ותקנים וכיולים פנימיים בהתאמה, בתנאי הפרדה, זיהוי, ומעברי MRM עבור קבוצה חדשה של שומנים ממוטבים. פרוטוקולי החילוץ המוצגים מאפשרים מתן שני שכפולים של LC/MRM עבור eCBs ו- eiCs, אשר אינסטרומנטלי במקרים של כשל טכני או כאשר ניתוח משוכפל הוא בעל משמעות למחקר. פרוטוקולי חילוץ PL מעבדים כמויות מדגם/חילוץ המתאימות לפחות ל-10 ניתוחים לכל תמצית (לדוגמה, ניסויי סריקה מרובים המבוססים על יון מבשר וסריקת אובדן נייטרלי2, בהתאמה; ניתוחים נוספים של LC/MRM; או LC/MRM משוכפלים כדי לפצות על כשל טכני במהלך ריצה). ניתוח השומנים אינו מוגבל LC / MRM; למעשה תמציות השומנים המתקבלים עם כל הפרוטוקולים האלה הם נוחים לניתוח ספקטרומטריה מסה גבוהה untargteted, high-end. למעט אגרופים במוח או כמות זעירה של רקמות המתקבלות מאזורים נפרדים (פחות מ -3 מ"ג), רקמות מרוסקות קפואות של אזורים הגדולים מ 2 −3 מ"ג ניתן aliquoted ומשמש מודולי חילוץ מרובים כמתואר כאן לניתוח לשכפל ו / או עבור חקירות אחרות מקובל באבקת רקמות.

היתרון הכללי של הפרוטוקולים המתוארים כאן בהשוואה לפרוטוקולים הנפוצים הוא היעילות והרגישות הכוללת המוגברת של זמן רב-תכליתי להפקה וניתוח רב-תכליתית בהוצאה מופחתת של משאבי בעלי חיים, חומרים מתכלים ועלויות ניתוח. חשוב לציין, פרוטוקול החילוץ שומנים כפול/mRNA גם מספק יעילות גבוהה יותר של מיצוי mRNA20,21 ושלמות של mRNA לעומת פרוטוקולים סטנדרטיים זמינים המתאימים, ובו זמנית יעילות מוגברת של מיצוי השומנים7. זה כנראה גם בשל אפקט מטריצה ירד עבור כל אחד של שברי השומנים ו mRNA כאשר חולץ פעמיים. בשל כך, השיטה ישימה בקלות עבור פרופיל ברזולוציה מרחבית גבוהה כגון אגרופים במוח.

עם זאת, מגבלה נוכחית של הפרוטוקול היא כי שומנים דלקתיים אינם מקובלים לניתוח וכימות באמצעות מיצוי שומנים כפול /mRNA. לפיכך, הפרוטוקול כפוף לעידון נוסף. לשם כך, רקמות ופלזמה שומנים דלקתיים אנדוקנבינואידים ניתן לחלץ במשותף וניתוח משותף, שהוא כלי ממוטב לחקור בו זמנית תהליכים neuroinflammatory ופעילות עצבית מאופננת אנדוקנבינואידים (ראה דו-שיח של eiCs ו- eCBs). הכללת פוספוליפידים בבדיקה האחרונה צפויה להיות אפשרית.

לאור גישות מולטי-אומיות פוטנציאליות למחלות נוירולוגיות, הניתוח הפרוטאומי של שברי חלבון המתקבל לאחר פרוטוקול מיצוי השומנים (כלומר, מיצוי משותף של eCBs ו- eiCs, כמו גם מיצוי משותף של PLs ו- eCBs) צפוי להיות אפשרי. עם זאת, זה עדיין לא אפשרי בעת שימוש בפרוטוקול השומנים/mRNA הכפול. עבור האחרון, הסביבה הכימית של החילוץ מונעת אפילו קביעת כמות חלבון באמצעות בדיקות חלבון סטנדרטיות כגון בדיקת חומצה ביצ'נצ'ונינית (BCA). התפתחויות נוספות כדי להתגבר על מגבלה זו ולזרז את הכללת פרופיל פרוטאומי בפרוטוקולים אלה מתוכננים.

באמצעות הפרוטוקול המודולרי המתואר כאן, ניתן היה להשיג מפה אזורית במוח של eiCs, eCBs ו- PLs במודל חייתי של התקפים אפילפטיים חריפים (איור 4). הפרוטוקול הראה אפנון היפוקמפוס של תהליכים דלקתיים על ידי eiCs ושל אפנון פעילות עצבית על ידי eCBs בעכברים מטופלים ולא מטופלים עם התקפים חריפים הנגרמים על ידי KA13. לוקליזציה תת-הכרתית של המוח של פוספוליפידים, אנדוקנבינואידים ו-mRNA במצבי התקפים אפילפטיים חריפים, בהתאמה, נצפו גם הם (איור 5). תוצאות אלה מדגישות את הערך והתחולה של השיטות המתוארות כאן בקידום הידע על ספקטרום רחב של שומנים המעורבים אפנון של מחלות נוירולוגיות מורכבות כגון אפילפסיה באזורי המוח ותת-נתונים. פרוטוקולים אלה הם בעלי ישימות כללית בחקירת מחלות נוירולוגיות ומעבר לה, בעוד פיתוח נוסף של הפרוטוקולים והיישומים לאוכלוסיות תאים נמשך.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים שאין ניגוד אינטרסים.

Acknowledgments

אנו מקדישים מאמר זה לד"ר ארמלינדה לומאצו. במהלך סיום כתב היד נפטרה ד"ר ארמלינדה לומזו. היא התגלמות התשוקה למדע ומעורבות לא אנוכית בעבודת צוות כדי להגשים מטרה מחקרית משמעותית. היא תמיד חלמה לתרום באופן משמעותי לרווחתם הגדולה יותר של בני האדם. טבעה טוב הלב מעולם לא נפגע על ידי הדרכים המאומצות של המדע והחיים. היא תישאר רבת ערך, ולנצח, בליבנו.

ג'וליה מ. פוסט מומנה על ידי תוכנית פוקוס למדעי המוח התרגומיים (FTN) במרכז הרפואי האוניברסיטאי של אוניברסיטת יוהנס גוטנברג מיינץ, וכיום ממומנת על ידי פרויקט היציאה SPP-2225 ל- LB. ראיסה לרנר מומן חלקית על ידי פרויקט DZHK 81X2600250 למתקן הליבה של LB ו- Lipidomics. מימון חלקי למחקרים אלה ניתן על ידי מתקן הליבה ליפידומיקס, המכון לכימיה פיזיולוגית, וקרנות תוך-גולגולתיות (ל- LB) מהמרכז הרפואי האוניברסיטאי של אוניברסיטת יוהנס גוטנברג מיינץ.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12(S)-HETE Biomol Cay10007248-25 Lipid Std
12(S)-HETE-d8 Biomol Cay334570-25 Lipid Std
1200 series LC System Agilent Instrumentation/LCMS
2100 Bioanalyzer Agilent Instrumentation/qPCR
5(S)-HETE-d8 Biomol Cay 334230 Lipid Std
ABI 7300 Real-Time PCR cycler Applied Biosystems Instrumentation/qPCR
Acetonitrile LC-MS Chroma Solv Honeywell 9814920 Solvent/LCMS
amber eppendorf tubes Eppendorf Sample Prep.
Analyst 1.6.2 Software AB SCIEX, Darmstadt Software
Analytical balance Mettler Toledo Instrumentation/Sample prep.
Arachidonic Acid-d8 MS Standard Biomol Cay-10007277 Lipid Std
Bessmann Tissue Pulverizer Spectrum Laboratories, Inc. (Breda, Netherlands) Instrumentation/Sample prep.
Bino Zeiss Microscopy
cleaved Caspase 3 antibody Cellsignaling 9661S Microscopy
Cryostat, Leica CM3050 S Leica Biosystems Instrumentation/Sample prep.
CTC HTC PAL autosampler CTC Analytics AG Instrumentation/LCMS
Dumont Curved Forceps Dumoxel #7 FST 11271-30 Surgical Tools
Dumont Forceps Super fine tip #5SF (x2) FST 11252-00 Surgical Tools
EDTA 1000 A Röhrchen Kabe Labortechnik 078001 Sample Prep.
EP-1 EconoPump BioRAD 700BR07757 Instrumentation/Sample prep.
Fine Forceps Mirror Finish FST 11412-11 Surgical Tools
Fine Iris Scissors straight sharp FST 14094-11 Surgical Tools
Fine Scissor Tungsten Carbide straight FST 14568-09 Surgical Tools
Iris Spatulae FST 10094-13 Surgical Tools
Kainic acid Abcam ab120100 Epileptic drug
Lipid View software AB SCIEX, Darmstadt Software
LPC 17:0 Avanis Polaris 855676P Lipid Std
LPC 18:0 Avanis Polaris 855775P Lipid Std
Luna 2,5µm C18(2)- HAST 100A LC column Phenomenex 00D-4446-B0 Instrumentation/LCMS
Magnifying lamp Maul GmbH Instrumentation/Sample prep.
Methanol LC-MS Chroma Solv 99.9% Honeywell 9814920 Solvent/LCMS
Motic Camara Motic Microscopy
MTBE Honeywell 34875-1L Solvent/LCMS
MultiQuant 3.0 quantitation software package AB SCIEX, Darmstadt Software
NanoDrop 2000c Spectrophotometer Thermo Scientific Instrumentation/qPCR
PA 16:0-18:1 Avanis Polaris 840857P Lipid Std
PA 17:0-14:1 Avanis Polaris LM-1404 Lipid Std
Palmitoyl Ethanolamide Biomol Cay90350-100 Lipid Std
Palmitoyl Ethanolamide-d5 Biomol Cay9000573-5 Lipid Std
PC 16:0-18:1 Avanis Polaris 850457P Lipid Std
PC 16:0-18:1 Avanis Polaris 850457P Lipid Std
PC 17:0-14:1 Avanis Polaris LM-1004 Lipid Std
PE 16:0-18:1 Avanis Polaris 850757P Lipid Std
PE 17:0-14:1 Avanis Polaris LM-1104 Lipid Std
PG 16:0-18:1 Avanis Polaris 840457P Lipid Std
PG 17:0-14:1 Avanis Polaris LM-1204 Lipid Std
PI 17:0-14:1 Avanis Polaris LM-1504 Lipid Std
Precelleys 24 Peqlab Instrumentation/Sample prep.
Precellys Keramik-Kügelchen Peqlab 91-pcs-ck14p Sample Prep.
Precellys Stahlkugeln 2,8mm Peqlab 91-PCS-MK28P Sample Prep.
Precellys-keramik-kit 1,4 mm VWR 91-PCS-CK14 Sample Prep.
Prostaglandin D2 Biomol Cay 12010 Lipid Std
Prostaglandin D2-d4 Biomol Cay 312010 Lipid Std
Prostaglandin E2 Biomol Cay10007211-1 Lipid Std
Prostaglandin E2-d9 Biomol Cay10581-50 Lipid Std
PS 17:0-14:1 Avanis Polaris LM-1304 Lipid Std
Q Trap 5500 triple-quadrupole linear ion trap MS AB SCIEX AU111609004 Instrumentation/LCMS
Real Time PCR System Appliert Biosystem Instrumentation/qPCR
Resolvin D1 Biomol Cay10012554-11 Lipid Std
Rneasy Mini Kit - RNAase-Free DNase Set (50) Qiagen 79254 Sample Prep.
Security Guard precolumn Phenomenex Instrumentation/LCMS
Shandon coverplates Thermo Fisher 72110017 Microscopy
Shandon slide rack and lid Thermo Fisher 73310017 Microscopy
SM 18:0 Avanis Polaris 860586P Lipid Std
SM d18:1/12:0 Avanis Polaris LM-2312 Lipid Std
Standard Forceps straight Smooth FST 11016-17 Surgical Tools
Surgical Scissor ToughCut Standard Pattern FST 14130-17 Surgical Tools
T3000 Thermocycler Biometra Instrumentation/qPCR
Thromboxane B2 Biomol Cay19030-5 Lipid Std
Thromboxane B2-d4 Biomol Cay319030-25 Lipid Std
Tissue Lyser II Qiagen/ Retsch 12120240804 Instrumentation/Sample prep.
Tissue Tek Sakura Finetek 4583 Microscopy
Toluidinblau Roth 0300.2 Microscopy
Vapotherm Barkey 4004734 Instrumentation/Sample prep.
Wasser LC-MS Chroma Solv VWR 9814920 Solvent/LCMS

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Aronica, E., et al. Neuroinflammatory targets and treatments for epilepsy validated in experimental models. Epilepsia. 58, 27-38 (2017).
  2. Lerner, R., Post, J., Loch, S., Lutz, B., Bindila, L. Targeting brain and peripheral plasticity of the lipidome in acute kainic acid-induced epileptic seizures in mice via quantitative mass spectrometry. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (2), 255-267 (2017).
  3. Schuhmann, K., Almeida, R., Baumert, M., Herzog, R., Bornstein, S. R., Shevchenko, A. Shotgun lipidomics on a LTQ Orbitrap mass spectrometer by successive switching between acquisition polarity modes. Journal of Mass Spectrometry. 47 (1), 96-104 (2012).
  4. Puppolo, M., Varma, D., Jansen, S. A. A review of analytical methods for eicosanoids in brain tissue. Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 964, 50-64 (2014).
  5. Blewett, A. J., Varma, D., Gilles, T., Libonati, J. R., Jansen, S. A. Development and validation of a high-performance liquid chromatography-electrospray mass spectrometry method for the simultaneous determination of 23 eicosanoids. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 46 (4), 653-662 (2008).
  6. Lerner, R., et al. Simultaneous lipidomic and transcriptomic profiling in mouse brain punches of acute epileptic seizure model compared to controls. Journal of Lipid Research. 59, 283-297 (2017).
  7. Lerner, R., et al. Simultaneous lipidomic and transcriptomic profiling in mouse brain punches of acute epileptic seizure model compared to controls. Journal of Lipid Research. , 1-48 (2018).
  8. Lévesque, M., Avoli, M., Bernard, C. Animal models of temporal lobe epilepsy following systemic chemoconvulsant administration. Journal of Neuroscience Methods. 260, (2016).
  9. Eyo, U. B., Murugan, M., Wu, L. J. Microglia-Neuron Communication in Epilepsy. Glia. 65 (1), 5-18 (2017).
  10. Zhu, J., Zheng, X. Y., Zhang, H. L., Luo, Q. Kainic acid-induced neurodegenerative model: Potentials and limitations. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2011, 457079 (2011).
  11. Park, S. H., Sim, Y. B., Kim, C. H., Lee, J. K., Lee, J. H., Suh, H. W. Role of α-CGRP in the regulation of neurotoxic responses induced by kainic acid in mice. Peptides. 44, 158-162 (2013).
  12. Lerner, R., Cuadrado, D. P., Post, J. M., Lutz, B., Bindila, L. Broad lipidomic and transcriptional changes of prophylactic PEA administration in control mice. Frontiers in Neuroscience. 13, 527 (2019).
  13. Post, J. M., et al. Antiepileptogenic Effect of Subchronic Palmitoylethanolamide Treatment in a Mouse Model of Acute Epilepsy. Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, (2018).
  14. Schauwecker, P. E., Steward, O. Genetic determinants of susceptibility to excitotoxic cell death: Implications for gene targeting approaches. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94 (8), 4103-4108 (2002).
  15. Monory, K., et al. The Endocannabinoid System Controls Key Epileptogenic Circuits in the Hippocampus. Neuron. 51 (4), 455-466 (2006).
  16. Konsman, J. P. The mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. Psychoneuroendocrinology. 28 (6), (2003).
  17. Spijker, S. Dissection of Rondent Brain Regions. Neuroproteomics. Li, K. W. 57, 13-27 (2011).
  18. Gross, R. W. The evolution of lipidomics through space and time. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (8), 731-739 (2017).
  19. Wang, M., Wang, C., Han, R. H., Han, X. Novel advances in shotgun lipidomics for biology and medicine. Progress in Lipid Research. 61, 83-108 (2016).
  20. Abbott, S. K., et al. An improved high-throughput lipid extraction method for the analysis of human brain lipids. Lipids. 48 (3), 307-318 (2013).
  21. Matyash, V., Liebisch, G., Kurzchalia, T. V., Shevchenko, A., Schwudke, D. Lipid extraction by methyl-tert-butyl ether for high-throughput lipidomics. Journal of Lipid Research. 49 (5), 1137-1146 (2008).

Tags

מדעי המוח גיליון 181 ליפידומיקה תמלול אזורי מוח מודלים של בעלי חיים של מחלות נוירולוגיות רזולוציה מרחבית גבוהה במוח ליפידומיקה כמותית
ליפידומיקה ותעתיק במחלות נוירולוגיות
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Post, J. M., Lerner, R., Schwitter,… More

Post, J. M., Lerner, R., Schwitter, C., Lutz, B., Lomazzo, E., Bindila, L. Lipidomics and Transcriptomics in Neurological Diseases. J. Vis. Exp. (181), e59423, doi:10.3791/59423 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter