Summary
このプロトコルは、ヒトの神経細胞培養が変異型ヒトタウのためのコーディングをコードするレンチを用いて形質導入される手順を詳述する。形質導入培養物は、タウ凝集体および関連する病理を表示する。
Abstract
タンパク質タウの異常な凝集は、アルツハイマー病 (AD) を含む多数の神経変性疾患に関与する pathogenically である。タウオパチーのマウスモデルは、凝集したタウの神経毒性メカニズムを調査するための貴重な資源を提供しているが、種族間の生理学的差異のために、マウス脳は人間の状態をモデリングします。細胞培養法の進歩は、インビトロでヒトニューロン培養を実験用にアクセス可能にし、neurotherapeutics の開発を支援した。しかしながら、ヒト神経細胞培養物の適応にもかかわらず、ヒトタウオパチーのインビトロモデルは未だ広く利用可能ではない。この議定書は、ヒトニューロンを pathogenically 変異体が黄色蛍光タンパク質 (YFP) レポーターに融合させるコードであるレンチウイルス由来のベクターで形質導入したタウ凝集体の細胞モデルを記述している。形質導入された培養物は、チオフラビンに対してポジティブに染色し、軸索長さの減少およびリソソーム体積の増加などの神経毒性のマーカーを表示するタウ凝集体を生成する。この手順は、人間のタウオパチーを研究するための有用で費用対効果の高いモデルかもしれません。
Introduction
微小管関連タンパクタウの病理学的凝集は、AD、前頭認知症 (FTD)、ピック病、および進行性の神経性麻痺 (PSP)1を含む多くの変性疾患の決定的な特徴である。Nondiseased 状態では、タウは神経軸索2に結合して微小管フィラメントを安定化させる。しかし、タウの疾患関連 hyperphosphorylation は、タウの凝集を促進します, 微小管からの解離, ニューロン毒性3.凝集したタウの毒性作用は、コリン作動性4および glutamatergic 受容体5の異常な活性化を伴うことがあり、細胞内カルシウムの調節不全をもたらし、最終的に、細胞死をもたらす。動物モデルにおいて、脳タウの減少は、AD マウス6における病理を改善し、反復性の軽度トラウマ的脳損傷7のマウスモデルである。
取り付け証拠は、マウス由来タウの構造および結合親和性がヒト由来タウとは異なること、およびマウスタウがヒトタウオパチー8のモデル化に適さないことを実証する。しかしながら、ヒト細胞タウオパチーモデルは、広く市販されていない。本研究の全体的な目的は、ヒトニューロンが変異型ヒトタウ構築物9を含むレンチウイルス由来ベクターで形質導入されるタウ凝集の in vitro モデルを記述することである。YFP レポーターに融合した P301L および V337M 突然変異を保有するタウ繰り返しドメインについてのタウレンチコンストラクトを生じさせるτ凝集体 (τ-RDLM-YFP) に対して、制御構築物は野生型 (Wt) タウのコードを YFP レポーター (タウ− Wt − YFP) に融合させた。この方法を用いて形質導入したニューロン培養は、nontransduced 培養よりも約9倍多くのタウを発現する。タウの発現量は、タウ-RDLM-YFP-YFP 形質細胞との間でほぼ等しいですが、タウ-RDLM-YFP ディスプレイで形質導入されたニューロンのみが凝集します。RDLM-YFP 染色によって形質導入された培養物は、チオフラビンのためにポジティブに、軸索長さおよびシナプス密度の減少を表示する。したがって、この細胞モデルは、インビトロでタウ凝集を研究するための有用なツールとなり得る。
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Protocol
1. 培地および試薬の調製
- 4° c で培養プレート用の基底膜マトリックスコーティングを解凍します (基底膜マトリックスがウォームアップすることを許可しないか、固化します)。1 mL アリコートを作り、-20 ° c または-70 ° c で保存します。
- 塩基性線維芽細胞成長因子 (bFGF) を滅菌リン緩衝生理食塩水 (PBS) に10μ g/mL で再構成し、10μ l のアリコートを作ります。4° c で保管してください。
- 新しい、未開封の 500 mL ボトルの DMEM/F12 をグルタミンで、B27 (10ml)、N2 (5ml)、およびペニシリン-ストレプトマイシン (5ml) を添加する。この神経幹細胞 (NSC) 培地の 50 mL を円錐形のチューブに置き、10μ l (2 μ g/mL の最終) bFGF を加えます。NSC (+) の bFGF 媒体を4° c で保存します。
- (-) BFGF メディアを作るには、ステップ1.3 で説明したのと同じレシピを使用しますが、bFGF は追加しません。このメディアは、ニューロンと NSCs を区別し、分化後のニューロンの文化を維持するために使用されます。.
2. レンチウイルスコンストラクト
注:レンチウイルスコンストラクトの作業を開始する前に、ラボがバイオセーフティレベル 2 (BSL) エージェントを使用することが承認されていることを確認してください。さらに、レンチウイルスベクターを使用する場合は、BSL 培養フード、個人用保護具 (PPE)、および廃棄方法を用いる必要があります。
- 好ましい供給源からレンチウイルスに包装されたタウ構造物を得る (構築情報についてはサンダース et al.10参照)。
3. ヒト神経幹細胞の培養
注:NSCs は通常100000–150000細胞/cm2 で播種され、最も商業的に入手可能な NSCs は 1 x 106 細胞/バイアルとして販売されています。このプロトコルは、10cm の細胞培養皿に最適化されています (ただし、他のサイズの食器を使用することができます)。したがって、市販の NSCs が使用されている場合、NSCs は、10 cm の料理をシードするのに十分な細胞をもたらすために、最初に6ウェルディッシュで培養されることによって拡大される必要があるかもしれません。このプロトコルはまた、様々な細胞培養皿のサイズに適合させることができる (しかし、これらのプロトコルは他の場所で利用可能であるように継代 NSCs のための命令を含まない11,12)。
-
細胞培養プレートの調製のために、細胞培養プレート用の凍結された基底膜マトリクスコーティングの1アリコートを除去し、それが4° c で解凍することを可能にする (アリコートは、細胞が播種される前日に一晩4° c に置くことができる)。385μ l の基底膜マトリックスコーティングを 5ml/F12 培地 + ペニシリン-ストレプトマイシンに添加する。
注: 5 mL の DMEM/F12 メディア + ペニシリン・ストレプトマイシンは、10cm の皿にコートするのに十分である (この基底膜マトリックスコーティング溶液の1ml は、6ウェルディッシュの1つの井戸を被覆するのに十分である)。あるいは、細胞が固定され、用い、またはチオフラビンのために染色する場合、ガラス上の培養細胞は24ウェル培養皿にカバースリップ。- メディアとマトリックスコーティングは、以前と同じように冷たくし、培養皿に加えます。培養皿に基底膜マトリックスコーティングを加えて、1時間のインキュベーター (37 ° c で) に食器を置きます。最適なコーティングのために、1時間以上またはそれ以下のために基底膜マトリクスをインキュベートしないでください。1時間後、細胞培養皿から基底膜マトリックスコーティングを吸引する。これは、メッキの準備ができている NSCs と一致することを確認してください。
注:セルが凍結在庫から解凍されていない場合は、ステップ3.2 をスキップし、ステップ3.3 に進みます。
- メディアとマトリックスコーティングは、以前と同じように冷たくし、培養皿に加えます。培養皿に基底膜マトリックスコーティングを加えて、1時間のインキュベーター (37 ° c で) に食器を置きます。最適なコーティングのために、1時間以上またはそれ以下のために基底膜マトリクスをインキュベートしないでください。1時間後、細胞培養皿から基底膜マトリックスコーティングを吸引する。これは、メッキの準備ができている NSCs と一致することを確認してください。
- 細胞が冷凍 NSC 株から解凍されている場合は、凍結した細胞のバイアルを取り、水の中に前後にバイアルを移動させることにより、37° c に加熱された水浴中で温めます。解凍したら、70% のエタノールでバイアルをスプレーし、細胞培養フードに入れます。細胞を ~ 10ml の DMEM/F12 + ペニシリン-ストレプトマイシン培地に移し、室温で5分間 1000 x gでチューブを遠心分離する。メディアを吸引し、再懸濁でセルを再除去します。
- NSC メディアの細胞を希釈して、使用されている細胞培養容器に適した播種密度を得ます。
注:例えば、NSCs が6ウェルプレートにめっきされている場合、6ウェル培養皿の1つには 9 cm2の表面積があり、90万 ~ 135万の細胞が播種する必要があります。したがって、100万細胞を含む1つのバイアルは、2 mL の培地に再懸濁し、6ウェルディッシュの単一ウェルに添加することができる。 - NSC メディアに懸濁した十分な細胞を加えて、基底膜マトリックスコーティング培養皿 (10万細胞/cm2) を播種し、1日おきにメディアを交換する (凍結したストックを使用する場合は、メッキの翌日から1日おきにメディアを交換する)。彼らは 75% – 80% のコンフルエントになるまで細胞を成長させます。
注:セルは、おそらくめっき後すぐに 75%-80% の合流に達するであろうが、凍結した株が使用される場合、これはより長い時間がかかることがあります。 - NSCs が 75% – 80% のコンフルエントである場合、NSC (+) bFGF 媒体を除去し、NSC (-) bFGF 媒体に置き換えることによってニューロン分化を開始する。この培地中の細胞を培養する (1 日おきにメディアを交換する) 場合は、少なくとも4週間。
注:細胞は、bFGF の撤退の後、数日間分裂し続けます。したがって、細胞は90〜 100% の合流に達する可能性があります。4週間培養した後、細胞はニューロンの運命を達成し、レンチウイルスの治療の準備が整います。
4. ニューロン培養の形質導入と維持
- レンチウイルスでニューロンを形質導入するには、3.4 x 105 transducible 単位/細胞 (100% コンフルエントな 10 cm ディッシュに ~ 1000万ニューロンが含まれる) を使用します。細胞培養培地中で必要な濃度に transducible 単位を希釈し、それらを細胞に加える (細胞培養皿のための通常の培地を使用する)。レンチウイルスを加えた2日後、細胞1x を新鮮な (-) bFGF 培地 (レンチウイルスなし) で洗い、(-) bFGF 培地でいつものように培養を続ける。
- 後レンチウイルス治療のために、細胞培養培地 ([−] bFGF 培地) を1日おきに変化させることによって形質導入ニューロンをフィードする。形質導入後〜8週間の間、細胞を維持する。細胞を光学顕微鏡下で定期的に可視化し、生存率を確保します。
注:Sparseness または樹状破損は、細胞がもはや生存可能でないという兆候である。
5. 細胞のイメージング
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生細胞イメージング
- 形質導入後 (4 日後にレンチウイルスを添加した後)、生細胞画像化が可能な蛍光顕微鏡下で YFP シグナルを観察する。インキュベーターから細胞培養皿を取り出し、培養皿の上に蓋を保つことによって、培養ウェルが無菌のままであることを確認します。~ 514 nm の励起波長と〜 527 nm の発光フィルタを用いて、10倍の対物レンズで細胞を視覚化します。
注:凝集体は、通常、レンチウイルスの適用後6〜8日に形質導入された細胞培養物において可視である。
- 形質導入後 (4 日後にレンチウイルスを添加した後)、生細胞画像化が可能な蛍光顕微鏡下で YFP シグナルを観察する。インキュベーターから細胞培養皿を取り出し、培養皿の上に蓋を保つことによって、培養ウェルが無菌のままであることを確認します。~ 514 nm の励起波長と〜 527 nm の発光フィルタを用いて、10倍の対物レンズで細胞を視覚化します。
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固定細胞染色 (β-チューブリン III 標識およびチオフラビン染色)
- 細胞をパラホルムアルデヒド (PFA) で固定するために、ガラスカバースリップ上で増殖させた形質導入ニューロンから培養培地を除去する。細胞1x を PBS で洗浄し、洗浄を外し、4% PFA (PBS で希釈) を室温にて20分間カバースリップに 300 ~ 500 μ l (24 ウェルプレートを使用する場合) を添加します。PFA を取り外し、カバースリップ2x を PBS で洗浄します。
- PBS、3% ウシ血清アルブミン (BSA)、および 0.3% トリトン X-100 からなるブロッキング溶液を調製します。井戸に 300-500 μ l の溶液を加え、カバースリップを4° c で2時間インキュベートします。2時間後、一次抗体 (1:500 の抗体濃度で) をブロッキング溶液に希釈し、各ウェルに300〜500μ l の一次抗体溶液を加えます。4° c で一晩ロッキングまたは回転プラットフォーム (低速) にプレートを置きます。
- 翌日、一次抗体溶液を除去し、PBS でそれぞれ5分間カバースリップ3x を洗浄する。ブロッキングバッファー溶液 (1: 1000 の濃度) で二次抗体を希釈し、各ウェルに二次抗体溶液を加えます。YFP シグナルと重ならない蛍光タグ (CY-3 など) を使用して、適切な二次抗体を選択します。ロッキングまたは回転プラットフォーム上で、細胞を2時間室温でインキュベートします。2時間後、2次抗体溶液を除去し、カバースリップ3x を PBS でそれぞれ10分間洗浄する。
- カバースリップをダブル脱イオン水 (DDW) で10分間洗浄し、DDW を 50% エタノールで10分間希釈して300μ l/0.015% のチオフラビンを加えます。チオフラビン溶液を除去し、カバースリップ2倍を 50% エタノールで4分間洗浄し、その後に1つ4分間30% のエタノールと2回の洗浄を 30% のエタノールで5分間洗浄します。取り付け前に、カバースリップ1x を DDW で洗ってください。
注:ステップ5.2.4 で説明されるチオフラビン染色は任意である。 - ガラススライドにカバースリップを取り付けるには、ガラススライドの "+" 側にマウントメディアを1滴入れます。ガラスカバースリップを含むウェルからすべての液体を除去し、微細な鉗子を使用して慎重にガラスカバースリップを除去し、どの側が培養細胞を持っているかを追跡します。
- 余分な水分を除去するために、キムワイプに対してカバースリップの端をそっと押します。それでも細かい鉗子でカバースリップをつかんで、カバースリップの端を取り付けメディアに (マウントメディアのドロップの方に向いているセル側で) タッチしてから、マウントメディアにカバースリップをそっと置きます (培養細胞を取付けに入れるカバースリップとガラススライドの間に挟むように、メディアを挟みます)。マウントメディアをイメージング前に30分間硬化させます。スライドは、将来の使用のために-20 ° c で保存することができます。
- 蛍光顕微鏡と適切な励起/発光スペクトル (YFP = ~ 514/527 nm、CY-3 = ~ 555/568 nm、およびチオフラビン S = ~ 390/426 nm) を用いて細胞を画像する。
6. オプションの方法
- 2日ごとに、文化から条件付きメディアを収集し、-20 ° c でそれを保存して、培養物によって放出されたタウ種を分析します。
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Representative Results
タウ-RDLM-YFP に形質導入されたニューロンを YFP で蛍光タグ付けし、RDLM 形質導入培養後に凝集体を表示した。これらの介在物はチオフラビンに対して陽性に染まった (図 1)。図 1に示すように、このプロトコルはチオフラビン陽性タウ凝集体を表示するニューロン培養を生成する。初期実験では、ニューロン特異的マーカーβ-チューブリン III を培養液に付加ことによってニューロン分化を確認することが推奨される。重要なことに、蛍光タグ付き二次抗体は、YPF (Cy3 など) とオーバーラップしない励起/発光スペクトルを持っている必要があります。黄色蛍光タウ凝集体は染色がない状態で可視になりますが、蛍光シグナルが細胞破片ではなく、凝集していることを確認するために、チオフラビンをイメージングにも使用する必要があります。さらに、図 1の例には、dapi の励起/発光がチオフラビンのそれと重なるように細胞核を標識する DAPI 染色は含まれていない。代替核染色剤は、必要に応じてチオフラビンで使用する必要があります。
図 1: 形質導入培養物のチオフラビン染色。タウ-RDLM-YFP レンチウイルスで形質導入されたニューロンを固定し、ニューロン特異的マーカーβ-チューブリン III (赤) と immunolabeled した。さらに、タウ凝集体 (緑色の YFP シグナル) をチオフラビン (青色) について染色した。スケールバー = 25 μ m。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
このプロトコルは、銀染色陽性凝集体およびチオフラビン陽性脱落もつれ (NFTs) を呈するヒトタウオパチーの in vitro モデルの生成を記述する。さらに、形質導入細胞は、形態学的欠陥、減少したシナプス形成、および増加したリソソーム容積のようなタウ誘発病理を表示する。このプロトコルの主な利点は、薬物スクリーニング研究のためだけでなく、タウ毒性の分析のために使用することができる神経タウオパチーのアクセス可能で費用対効果の高いモデルを提供することです。このモデルは、ヒトタウオパチー細胞株がまだ広く利用可能ではなく、マウス由来ニューロンからのトランスジェニックタウの使用は、動物の繁殖を必要とし、ニューロンの違いにより制限されているように、神経変性研究の材料の必要性を満たします種間の特性。
上記に加え、この手順を成功させるための重要な手順がいくつかあります。まず、ウイルス力価が低すぎる場合、培養物が凝集体を形成しないため、正しいウイルス力価が使用されていることを確認します。第2に、NSC 培養物が適切に維持され、かつ約 80% の合流点を超えないことを確認してください。NSCs の過剰増殖は、早期の分化を引き起こす.最後に、神経細胞培養物が NSCs から bFGF メディアを取り出した後に分化するのを完全に4週間待つ。この期間は、ニューロンの成熟を確保するために必要です.
上記の手順は in vitro タウオパチーモデルを製造するための効率的な方法ですが、このプロトコルに関連するいくつかの制限があります。まず、前述したように、この方法は、ヒト誘導多能性幹細胞由来ニューロンにおいて NFTs を生成するが、ラット胚 (E18) 由来のニューロンではない。ヒトニューロンに使用されたよりも形質導入ラットニューロンに3倍以上のウイルスを使用した後も、げっ歯類細胞培養はチオフラビン染色のため陰性であり、この方法はげっ歯類の培養に適応できないことを示唆している。形質導入マウス細胞とヒトニューロンとの差異は、凝集体13に向けたヒトタウの傾向の増加によるものであり得る。この手順の2番目の制限は、タウ凝集体が培養物中で形成されるが、タウ− RDLM 形質細胞とタウ− YFP 形質導入培養物の間のタウリン酸化の変化は、タンパク質 PHF を使用して検出不可能であった (タウサー 396/Ser 404) および CP13 抗体 (Ser 202 でタウリン酸化を検出する) でリン酸化した。これらの知見は、P301L および V337M によるタウ・ RDLM ・ YFP 培養におけるタウ凝集が hyperphosphorylation に依存しない機構を含むこと、または内因性タウリン酸化のレベルがイムノブロットによって検出可能なレベルにあることを示唆している。RDLM-YFP およびタウ Wt-YFP 培養間の PHF および CP13 免疫反応性の差異の欠如のため、このモデルが病理に対するタウキナーゼ/ホスファターゼ活性の影響を分析する研究に有用であるかどうかは不明である。しかし、PHF-1 および CP13 抗体は両方とも、突然変異を抱えている反復ドメインの外側の領域を認識する。したがって、様々なタウリン酸化部位に対して発生する追加の抗体は、将来の研究に有用であり得る。
細胞培養アッセイに加えて、このモデルは、細胞培養パラダイムを超えた研究のための貴重なツールである可能性があります。例えば、形質導入細胞の培地から単離されたエキソソームは、有毒なタウ種を含む。エキソソームは、ほぼすべての細胞型から放出される小さな分泌小胞であり、エキソソームはタウ伝播14に関与している。タウ− RDLM ニューロンエキソソームは、ウェスタンブロット9によって検出可能なヒトタウを含有し、これらのエキソソームは、ナイーブマウス脳におけるタウ内包物を生成するのに十分である。これらの介在物は、ヒトτ (K9JA) に特異的な抗体に対して免疫反応性であるが、介在物が凝集マウスタウを含むかどうかは不明である。この手順は、げっ歯類ニューロンにおけるチオフラビン陽性染色凝集体を産生しないという発見は、マウス脳において観察される介在物は、ヒトタウから完全に構成しているが、将来の研究が確認する必要があることを示唆するin vivo 預金の組成。
タウオパチーにおけるエキソソーム由来タウの明らかな役割を考えると、ここで説明するモデルは、タウ誘導性神経変性におけるエキソソームの役割を調べるための有用なリソースであり得る。結論として、この手順は、トランスジェニックマウス神経系に対して重要な利点を有するヒトタウオパチーの in vitro モデルを生成し、様々な前臨床分析のために用いることができる。
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Disclosures
作者は何も開示することはありません。
Acknowledgments
著者たちは、タウコンストラクトを提供するために、テキサス大学南西部で PHF と CP13 抗体とマルク・ダイヤモンドを供給するために、アルバート・アインシュタイン医科大学のピーター・デイビス博士に感謝したいと思います。この研究は、アルツハイマー病協会 (NIRG-14-322164) から S.H.Y. とカリフォルニア再生医療研究所 (TB1-01193) からの助成金によって支持されました P.R.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 cm culture dishes | Thermofisher | 12556002 | |
| 15 mL tubes | Biopioneer | CNT-15 | |
| 16% paraformaldehyde | Thermofisher | 50-980-487 | |
| 24 well culture plates | Thermofisher | 930186 | |
| 50 mL tubes | Biopioneer | CNT-50 | |
| 70% ethanol in spray bottle | Various sources | NA | |
| B27 supplement | Thermofisher | 17504044 | |
| Basement membrane matrix (Matrigel) | Corning | 356231 | |
| Basic FGF | Biopioneer | HRP-0011 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A7906 | |
| Cell culture incubator | Various sources | NA | |
| Centrifuge | Various sources | NA | |
| DMEM-F12 culture media with glutamine | Thermofisher | 10565042 | |
| Ethanol (50% concentration or higher) | Various sources | NA | |
| Flourescently labeled secondary antibodies | Various Sources, experiment dependent | NA | |
| Fluorescent microscope | Various sources | NA | |
| Glass coverslips | Thermofisher | 1254581 | |
| Glass slides | Thermofisher | 12-550-15 | |
| Human neural stem cells | Various sources | NA | |
| Lentiviral vectors | Various sources | custom order | |
| Mounting media | Thermofisher | P36934 | |
| N2 supplement | Thermofisher | 17502048 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermofisher | 15140122 | |
| Phosphate buffered saline | Thermofisher | 14190250 | |
| Primary antibodies | Various Sources, experiment dependent | NA | |
| Rocking or rotating platform | Various sources | NA | |
| Sterile cell culture hood | Various sources | NA | |
| Thioflavin S | Sigma | T1892-25G | |
| Triton X-100 | Thermofisher | BP151-100 | |
| Water bath | Various sources | NA |
References
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