Summary
هذا البروتوكول تفاصيل الاجراء الذي يتم محول الثقافات العصبية البشرية مع لينتيفيرال ثوابت الترميز لمتحولة تاو الإنسان. الثقافات محوله عرض المجاميع تاو والامراض المرتبطة بها.
Abstract
التراكم الشاذ من البروتين تاو يشارك بشكل مرضي في عدد من الامراض التنكسية ، بما في ذلك مرض الزهايمر (AD). علي الرغم من ان نماذج الفئران من تواعتلال قدمت موردا قيما للتحقيق في أليات العصبية من تاو المجمعة ، فانه أصبح من الواضح علي نحو متزايد انه ، بسبب الاختلافات بين الأنواع في الفيزيولوجيا العصبية ، والدماغ الماوس غير مناسب نمذجة الحالة الانسانيه. التقدم في أساليب ثقافة الخلية جعلت ثقافات الخلايا العصبية البشرية في متناول للاستخدام التجريبي في المختبر وساعدت في تطوير المداواة العصبية. ومع ذلك ، علي الرغم من التكيف مع الثقافات خليه الخلايا العصبية البشرية ، في المختبر نماذج من الاعتلال البشري ليست متاحه علي نطاق واسع حتى الآن. يصف هذا البروتوكول نموذجا خلويا لتجميع تاو الذي يتم فيه توصيل الخلايا العصبية البشرية بالمتجات المشتقة من لينتيفيرال التي تم دمجها بالشفرة المتحولة بشكل باثوجيوكلي مع مراسل البروتين الفلوري الأصفر (YFP). الثقافات المحولة تنتج المجاميع تاو ان وصمه عار إيجابيا لثيوفلافين وعرض علامات السمية العصبية ، مثل انخفاض طول اكسنال وزيادة حجم الليسومال. وقد يكون هذا الاجراء نموذجا مفيدا وفعالا من حيث التكلفة لدراسة الامراض البشرية.
Introduction
التراكم المرضي من البروتين المرتبط بالبولية الصغيرة تاو هو سمه مميزه للعديد من الامراض التنكسية ، بما في ذلك AD ، الخرف الجبهي الامامي (FTD) ، ومرض البيك ، والشلل التقدمي التقدمي (PSP)1. في حاله غير المريضة ، تاو يربط ويستقر خيوط ميكروتوبولي في محاور الخلايا العصبية2. ومع ذلك ، والمرتبطة بالمرض فرط فوسفونات تاو يعزز تجميع تاو ، التفكك من الأنابيب الدقيقة ، وسميه الخلايا العصبية3. الآثار السامة لل تاو المجمعة قد تنطوي علي تفعيل الشاذة من الكوليني4 ومستقبلات جلوتاميلجيك5 مما ادي إلى خلل في الكالسيوم داخل الخلايا و, في نهاية المطاف, موت الخلية. في النماذج الحيوانية ، والحد من الدماغ تاو يحسن علم الامراض في الفئران AD6 وفي نماذج الماوس من المتكررة خفيفه أصابه الدماغ الرضية7.
تثبت الادله المتصاعدة ان البنية والصلة الملزمة لل tau المشتقة من الفاره تختلف عن المشتقة البشرية تاو وان الماوس تاو غير مناسب لنمذجة الإنسان8. ومع ذلك ، فان نماذج اعتلال الخلايا البشرية ليست متاحه تجاريا علي نطاق واسع. الهدف العام لهذا العمل هو وصف نموذج في المختبر من تجميع تاو فيه الخلايا العصبية البشرية محوله مع ناقلات المشتقة من لينتيفيرال التي تحتوي علي متحولة الإنسان تاو يبني9. تاو التجميعية المسببة للينتيفيرال يبني رموز للمجال التكرار تاو إيواء P301L والطفرات الV337Mه تنصهر إلى مراسل YFP (تاو-RDLM-YFP) في حين ان التحكم بإنشاء التعليمات البرمجية للمجال البرية من نوع (Wt) تاو تكرار تنصهر إلى مراسل YFP (تاو-Wt-YFP). الثقافات العصبية محوله باستخدام هذه الطريقة التعبير عن حوالي تسع مرات أكثر تاو من الثقافات غير المحولة. وعلي الرغم من ان مقدار تعبير تاو المعبر عنه يساوي تقريبا بين الخلايا المحولة من تاو-RDLM-YFP-و Tau-Wt-YFP ، فان الخلية العصبية الوحيدة المحولة مع المجاميع العرض تاو-RDLM-YFP. الثقافات محوله مع تاو-rdlm-yfp وصمه عار إيجابيا لثيوفلافين وعرض التخفيضات في طول محواري وكثافة متشابك. ولذلك ، قد يكون هذا النموذج الخلوي أداه مفيده لدراسة تجميع تاو في المختبر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. اعداد وسائل الاعلام والكواشف
- الذوبان في الطابق السفلي غشاء مصفوفة طلاء للوحات الثقافة في 4 درجه مئوية (لا تسمح مصفوفة غشاء الطابق السفلي لتسخين أو انها سوف يصلب). جعل 1 مل قسامات وتخزينها في-20 درجه مئوية أو-70 درجه مئوية.
- أعاده تكوين الخلايا الليفية الاساسيه عامل النمو (bFGF) في معقم الفوسفات-المالحة المخزنة مؤقتا (التلفزيونية الخاصة) في 10 ميكروغرام/مل وجعل 10 μL aliquots. تخزينها في 4 درجه مئوية.
- إلى زجاجه جديده ، غير مفتوحة ، 500 mL من DMEM/F12 مع الجلوتامين ، أضافه B27 (10 مل) ، N2 (5 مل) ، والبنسلين-ستربتوميسين (5 مل). مكان 50 mL من هذه الخلايا الجذعية العصبية (القومي) وسائل الاعلام في أنبوب مخروطي وأضافه 10 μL من 10 ميكروغرام/μL (2 ميكروغرام/مل النهائي) bFGF. تخزين الاعلام القومي (+) bFGF الوسائط في 4 درجه مئوية.
- لجعل (-) bFGF وسائل الاعلام ، واستخدام نفس الوصفة كما هو موضح في الخطوة 1.3 ولكن لا تضيف bFGF. وسوف تستخدم هذه الوسائط لتفريق NSCs إلى الخلايا العصبية والحفاظ علي الثقافات العصبية بعد التمايز.
2. لينتيفيرال يبني
ملاحظه: قبل البدء في العمل مع لينتيفيرال ثوابت ، تاكد من ان المختبر قد تمت الموافقة علي استخدام السلامة الاحيائيه مستوي-2 (BSL-2) وكلاء. وعلاوة علي ذلك ، يجب استخدام أغطيه الثقافات من طراز BSL-2 ، ومعدات الوقاية الشخصية ، وأساليب التخلص عند العمل مع ناقلات لينتيفيرال.
- الحصول علي يبني تاو تعبئتها في لينتيفيروس من مصدر مفضل (انظر ساندرز وآخرون10 لبناء المعلومات).
3. زراعه الخلايا الجذعية العصبية البشرية
ملاحظه: وعاده ما يتم البذر NSCs في 100000-150000 الخلايا/سم2 وتباع معظم nscs المتاحة تجاريا ك 1 × 106 خلايا/قارورة. وقد تم تحسين هذا البروتوكول لاطباق الثقافة خليه 10 سم (علي الرغم من ان الاحجام الأخرى من الاطباق يمكن استخدامها) ؛ ولذلك ، إذا تم استخدام NSCs المتاحة تجاريا ، قد تحتاج إلى توسيع NSCs بالأول يجري مثقف في سته اطباق جيدا من أجل ان يؤدي إلى خلايا كافيه للبذور 10 سم الاطباق. ويمكن بدلا من ذلك تكييف هذا البروتوكول لمجموعه متنوعة من الاحجام طبق ثقافة الخلية (ولكن لا يحتوي علي تعليمات لمرور nscs لان هذه البروتوكولات متوفرة في مكان آخر11,12).
-
لاعداد لوحات ثقافة الخلية ، وأزاله قسامه واحد من طبقه القبو المجمدة طلاء مصفوفة للوحات ثقافة الخلية والسماح لها لذوبان الجليد في 4 درجه مئوية (يمكن وضع الارصفه في 4 درجه مئوية بين عشيه وضحيها اليوم قبل ان يتم البذر الخلايا). أضافه 385 μL من الطابق السفلي غشاء مصفوفة طلاء إلى 5 مل من DMEM/F12 وسائل الاعلام + البنسلين-ستربتوميسين.
ملاحظه: 5 مل من الوسائط DMEM/F12 + البنسلين-ستربتوميسين هو ما يكفي لمعطف واحد 10 سم طبق (1 مل من هذا الطابق السفلي غشاء مصفوفة الحل يكفي لمعطف واحد جيدا من سته طبق جيد). بدلا من ذلك ، إذا كانت الخلايا لتكون ثابته ومناعية ، أو ملطخه لثيوفلافين ، والخلايا الثقافية علي الزجاج coverslips في الاطباق الثقافة 24-حسنا.- الحفاظ علي وسائل الاعلام وطلاء المصفوفة الباردة قبل واثناء اضافتها إلى الاطباق الثقافية. أضافه طلاء مصفوفة غشاء الطابق السفلي إلى الاطباق الثقافية ووضع الاطباق في حاضنه (في 37 درجه مئوية) لمده 1 ساعة. لطلاء الأمثل ، لا احتضان مصفوفة غشاء الطابق السفلي لأكثر من أو اقل من 1 ساعة. بعد 1 ساعة ، يستنشق الطبقة السفلية غشاء طلاء المصفوفة من الثقافات الخلية الاطباق. تاكد من ان هذا يتزامن مع NSCs كونها جاهزه لتكون مطليه.
ملاحظه: إذا لم يتم أذابه الخلايا من المخزونات المجمدة ، تخطي الخطوة 3.2 ومتابعه الخطوة 3.3.
- الحفاظ علي وسائل الاعلام وطلاء المصفوفة الباردة قبل واثناء اضافتها إلى الاطباق الثقافية. أضافه طلاء مصفوفة غشاء الطابق السفلي إلى الاطباق الثقافية ووضع الاطباق في حاضنه (في 37 درجه مئوية) لمده 1 ساعة. لطلاء الأمثل ، لا احتضان مصفوفة غشاء الطابق السفلي لأكثر من أو اقل من 1 ساعة. بعد 1 ساعة ، يستنشق الطبقة السفلية غشاء طلاء المصفوفة من الثقافات الخلية الاطباق. تاكد من ان هذا يتزامن مع NSCs كونها جاهزه لتكون مطليه.
- إذا تم أذابه الخلايا من مخزونات الإنقاذ القومي المجمدة ، خذ قنينة من الخلايا المجمدة وسخنها في حمام مائي يسخن إلى 37 درجه مئوية عن طريق تحريك القارورة ذهابا وإيابا في الماء. مره واحده أذابه ، رش القارورة مع 70 ٪ الايثانول ووضعها في غطاء للثقافة الخلية. نقل الخلايا إلى ~ 10 مل من DMEM/F12 + البنسلين-ستربتوميسين وسائل الاعلام والطرد المركزي أنبوب في درجه حرارة الغرفة في 1,000 x g ل 5 دقيقه. يستنشق وسائل الاعلام وأعاده تعليق الخلايا في وسائل الاعلام القومية.
- تمييع الخلايا في وسائل الاعلام القومية للحصول علي كثافة البذر المناسبة للسفينة ثقافة الخلية التي يتم استخدامها.
ملاحظه: علي سبيل المثال ، إذا كانت NSCs مطليه علي لوحه من سته ابار-واحده جيدا علي طبق ثقافة سته جيدا لديها مساحة السطح من 9 سم2-900,000 إلى 1,350,000 خلايا مطلوبه للبذور. لذلك ، يمكن أعاده تعليق قارورة واحده تحتوي علي خلايا 1,000,000 في 2 مل من وسائل الاعلام ، وأضاف إلى بئر واحد من سته طبق جيدا. - أضافه ما يكفي من الخلايا المعلقة في وسائل الاعلام التابعة لل القومية للبذور الطابق السفلي غشاء مصفوفة المغلفة اطباق الثقافة (100,000 خلايا/سم2) وتغيير وسائل الاعلام كل يوم (إذا كان استخدام الأسهم المجمدة ، وتغيير وسائل الاعلام في اليوم بعد الطلاء وكل يوم بعد ذلك). تنمو الخلايا حتى انها 75 ٪-80 ٪ متموج.
ملاحظه: ومن المرجح ان تصل الخلايا إلى 75 ٪-80 ٪ التقاء بعد الطلاء بوقت قصير ، ولكن هذا قد يستغرق وقتا أطول إذا تم استخدام المخزونات المجمدة. - مره واحده NSCs هي 75 ٪-80 ٪ متموج ، تبدا التمايز العصبية عن طريق أزاله الوسائط الاعلاميه bFGF (+) واستبدالها مع الإنقاذ القومي (-) bFGF وسائل الاعلام. ثقافة الخلايا في هذه الوسائط (استبدال وسائل الاعلام كل يوم) لمده 4 أسابيع علي الأقل.
ملاحظه: وسوف تستمر الخلايا في الانقسام لبضعة أيام بعد انسحاب bFGF; لذلك ، قد تصل الخلايا إلى 90-100% التقاء. بعد الخياطة لمده 4 أسابيع ، ستكون الخلايا قد حققت مصير المخ وسوف تكون جاهزه لعلاج لينتيفيروس.
4. التوصيل والصيانة للثقافات العصبية
- إلى transduce الخلايا العصبية مع لينتيفيروس ، واستخدام عدد عيار من 3.4 x 105 وحدات محوله/خليه (100 ٪ متموج 10 سم طبق سوف تحتوي علي ~ 10,000,000 الخلايا العصبية). تمييع الوحدات محوله إلى التركيز اللازم في الخلية ثقافة الاعلام وأضافها إلى الخلايا (استخدام الحجم العادي للوسائط لطبق ثقافة الخلية). بعد يومين من أضافه لينتيفيروس ، وغسل الخلايا 1x مع الطازجة (-) وسائل الاعلام bFGF (بدون لينتيفيروس) ومواصله الخياطة في (-) وسائل الاعلام bFGF كالمعتاد.
- لعلاج ما بعد اللينتيفيرال, تغذيه الخلايا العصبية محوله عن طريق تغيير وسائل الاعلام الخلية الثقافة ([-] وسائل الاعلام bFGF) كل يومين. الحفاظ علي الخلايا ل ~ 8 أسابيع بعد المحول. تصور الخلايا تحت المجهر الضوئي بشكل روتيني لضمان الاستمرارية.
ملاحظه: العصافير أو الكسور الجذعية هي علامات علي ان الخلايا لم تعد قابله للحياة.
5. تصوير الخلايا
-
تصوير الخلايا الحية
- بعد التوصيل (بعد 4 أيام من أضافه لينتيفيروس) ، راقب إشارات YFP تحت مجهر فلوري قادر علي تصوير الخلايا الحية. تاخذ الاطباق ثقافة الخلية من الحاضنة والتاكد من ان الآبار الثقافة لا تزال عقيمه من خلال الحفاظ علي غطاء علي راس الاطباق الثقافية. تصور الخلايا باستخدام هدف 10x مع الطول الموجي الاثاره من ~ 514 nm وفلتر الانبعاثات من ~ 527 nm.
ملاحظه: المجاميع هي عاده مرئية في الثقافات خليه محوله 6-8 أيام بعد تطبيق لينتيفيروس.
- بعد التوصيل (بعد 4 أيام من أضافه لينتيفيروس) ، راقب إشارات YFP تحت مجهر فلوري قادر علي تصوير الخلايا الحية. تاخذ الاطباق ثقافة الخلية من الحاضنة والتاكد من ان الآبار الثقافة لا تزال عقيمه من خلال الحفاظ علي غطاء علي راس الاطباق الثقافية. تصور الخلايا باستخدام هدف 10x مع الطول الموجي الاثاره من ~ 514 nm وفلتر الانبعاثات من ~ 527 nm.
-
الخلايا الثابتة تلطيخ (β-الأنابيب الثالث وسم وتلطيخ ثيوفلافين)
- لإصلاح الخلايا في بارافورمالدهيد (PFA) ، وأزاله وسائل الاعلام الثقافة من الخلايا العصبية المحولة التي تزرع علي الشفتين الزجاج. غسل الخلايا 1x مع تلفزيوني ، وأزاله الغسيل ، وأضافه 300-500 μL (إذا باستخدام لوحات 24 جيدا) من 4 ٪ PFA (المخفف في الخدمات التلفزيونية العامة) إلى coverslips لمده 20 دقيقه في درجه حرارة الغرفة. أزاله PFA وغسل الشفتين 2x مع تلفزيوني.
- اعداد حل حظر يتالف من تلفزيوني ، 3 ٪ الزلال المصل البقري (جيش الصرب البوسني) ، و 0.3 ٪ تريتون X-100. أضافه 300-500 μL من الحل إلى الآبار واحتضان الشفتين لمده 2 ح في 4 درجه مئوية. بعد 2 ح ، تمييع الأجسام المضادة الاوليه (في تركيز الأجسام المضادة من 1:500) في منع الحل وأضافه 300-500 μL من حل الأجسام المضادة الاساسيه لكل بئر. وضع لوحه علي منصة هزاز أو الدورية (بسرعة منخفضه) بين عشيه وضحيها في 4 درجه مئوية.
- في اليوم التالي ، وأزاله الحل المضادات الاساسيه وغسل الشفتين 3x لمده 5 دقائق لكل منها مع تلفزيوني. تمييع الأجسام المضادة الثانوية في حل العازلة الحاجز (بتركيز 1:1000) وأضافه حل الأجسام المضادة الثانوية لكل بئر. حدد الأجسام المضادة الثانوية المناسبة باستخدام علامة الفلورسنت التي لا تتداخل مع اشاره YFP (CY-3 ، علي سبيل المثال). احتضان الخلايا في درجه حرارة الغرفة لمده 2 ساعة علي منصة هزاز أو الدورية. بعد 2 ح ، وأزاله حل الأجسام المضادة الثانوية وغسل الشفتين 3x لمده 10 دقيقه لكل منهما مع تلفزيوني.
- غسل الشفتين في المياه المزدوجة منزوعة الأيونات (DDW) لمده 10 دقيقه. أزاله DDW وأضافه 300 μL/well من 0.015 ٪ ثيوفلافين المخفف في الايثانول 50 ٪ لمده 10 دقيقه. أزاله الحل ثيوفلافين وغسل الشفتين 2x لمده 4 دقائق لكل منهما مع 50 ٪ الايثانول ، تليها واحد 4 دقيقه يغسل مع الايثانول 30 ٪ واثنين يغسل لمده 5 دقائق لكل منها مع الايثانول 30 ٪. غسل الشفتين 1x مع DDW قبل التركيب.
ملاحظه: تلطيخ ثيوفلافين الموصوفة في الخطوة 5.2.4 اختياريه. - لتركيب الشفتين علي الشرائح الزجاجية ، ضع قطره واحده من الوسائط المتصاعدة علي الجانب "+" من الشريحة الزجاجية. أزاله كل السائل من البئر التي تحتوي علي الزجاج كوفيرسليب ، وذلك باستخدام ملقط غرامه ، وأزاله بعناية الزجاج كوفيرسليب ، والحفاظ علي المسار الذي الجانب لديه خلايا مثقف.
- اضغط برفق علي حافه الشفة المختلطة ضد Kimwipe لأزاله اي رطوبة زائده. لا تزال تجتاح كوفيرسليب مع ملقط غرامه ، وتلمس الحافة (مع الجانب الخلية التي تواجه نحو قطره من وسائل الاعلام المتصاعدة) من كوفيرسليب إلى وسائل الاعلام المتصاعدة ، ومن ثم ، وضع بلطف في كوفيرسليب علي وسائل الاعلام المتصاعدة (وضع الخلايا المستزرعة في تصاعد وسائل الاعلام ويقحمها بين المشبك والشريحة الزجاجية). السماح للوسائط المتصاعدة لتتصلب لمده 30 دقيقه قبل التصوير. يمكن تخزين الشرائح في-20 درجه مئوية للاستخدام في المستقبل.
- صوره الخلايا باستخدام المجهر الفلورسنت والمناسبة الاثاره/الانبعاثات الأطياف (YFP = ~ 514/527 نانومتر ، CY-3 = ~ 555/568 nm ، و ثيوفلافين S = ~ 390/426 nm).
6. الطرق الاختيارية
- كل يومين ، وجمع وسائل الاعلام المكيفة من الثقافات وتخزينها في-20 درجه مئوية للتحليلات في المستقبل من الأنواع تاو التي أطلقتها الثقافات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تم المفتاحية تاو-RDLM-YFP-محول الخلايا العصبية فلوريسسينتلي مع YFP ، والثقافات RDLM-محول عرض المجاميع بعد المحولة. هذه الشوائب الملونة الايجابيه لثيوفلافين (الشكل 1). كما يوضح الشكل 1 ، ينتج هذا البروتوكول ثقافات الخلايا العصبية التي تعرض مجاميع tau الموجبة لثيوفلافين. للتجارب الاوليه ، فمن المستحسن ان يتم تاكيد تمايز الخلايا العصبية عن طريق المناعية علامة الخلايا العصبية الخاصة β-أنابيب الثالث في الثقافات. الأهم من ذلك ، ينبغي ان يكون الأجسام المضادة الثانوية فلوريسسينتلي الموسومة طيف الاثاره/الانبعاثات التي لا تتداخل مع ان من YPF (Cy3 ، علي سبيل المثال). علي الرغم من ان المجاميع الفلورية الصفراء تاو ستكون مرئية في غياب تلطيخ ، وينبغي أيضا ان تستخدم ثيوفلافين للتصوير من أجل التاكد من ان اشاره الفلورسنت يتم تجميعها تاو وليس الحطام الخلوي. بالاضافه إلى ذلك ، لا يتضمن المثال في الشكل 1 تلطيخ dapi لتسميه نوى الخلية كما الاثاره/الانبعاثات من dapi تتداخل مع ان من ثيوفلافين; يجب استخدام البقع النوى البديلة مع ثيوفلافين إذا رغبت في ذلك.
الشكل 1: تلطيخ ثيوفلافين الثقافات المحولة. الخلايا العصبية محوله مع تاو-RDLM-YFP لينتيفيروس كانت ثابته ومناعية مع علامة الخلايا العصبية الخاصة β-أنابيب الثالث (الأحمر). بالاضافه إلى ذلك ، كانت المجاميع تاو (YFP اشاره باللون الأخضر) ملطخه لثيوفلافين (الأزرق). قضبان المقياس = 25 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يصف هذا البروتوكول توليد نموذج في المختبر لاعتلال الأمعاء البشرية الذي يسلك المجاميع الايجابيه للبقع الفضية والتشابك العصبي الليفي ثيوفلافين الإيجابي (NFTs). وعلاوة علي ذلك ، تعرض الخلايا المحولة الامراض التي يسببها تاو مثل العيوب المورفولوجية ، وانخفاض synaptogenesis ، وزيادة حجم الليسومال. والميزة الرئيسية لهذا البروتوكول هو انه يوفر نموذجا يمكن الوصول اليها وفعاله من حيث التكلفة لاعتلال الخلايا العصبية ، والتي يمكن استخدامها لدراسات فحص المخدرات ، وكذلك لتحليل سميه تاو. هذا النموذج يملا حاجه المادية في البحوث العصبية كما خطوط الخلايا البشرية تواعتلال ليست متاحه علي نطاق واسع حتى الآن واستخدام تاو الوراثية من الخلايا العصبية المستمدة من الماوس يتطلب تربيه الماشية ومحدوده بسبب الاختلافات في الخلايا العصبية الخصائص بين الأنواع.
بالاضافه إلى تلك المذكورة أعلاه ، هناك عدد من الخطوات الحاسمة لنجاح هذا الاجراء. أولا ، تاكد من ان يتم استخدام عيار الفيروسية الصحيحة لأنه إذا كان عيار الفيروسية منخفضه جدا ، فان الثقافات لا تشكل المجاميع. ثانيا ، تاكد من ان يتم الحفاظ علي ثقافات السلامة القومية بشكل صحيح ولا تتجاوز ~ 80 ٪ التقاء. فرط نمو NSCs سوف يسبب التمايز المبكر. الماضي, الانتظار 4 أسابيع كامله للثقافات الخلايا العصبية للتمييز بعد سحب وسائل الاعلام bFGF من NSCs. هذه المدة ضرورية لضمان نضوج الخلايا العصبية.
علي الرغم من ان الاجراء الموصوف أعلاه هو وسيله فعاله لإنتاج نموذج الاعتلال في المختبر ، هناك بعض القيود المرتبطة بهذا البروتوكول. أولا ، كما هو موضح سابقا ، ينتج هذا الأسلوب NFTs في الخلايا العصبية المشتقة من الخلية الجذعية مستحث البشرية ولكن ليس في الفئران الجنينية (E18) المشتقة من الخلايا العصبية. حتى بعد استخدام ثلاث مرات أكثر من الفيروسات إلى الخلايا العصبية الفئران transduce من كان يستخدم للخلايا العصبية البشرية ، ظلت الثقافات خليه القوارض السلبية لتلطيخ ثيوفلافين ، مما يوحي بان هذه الطريقة لا يمكن تكييفها للثقافات القوارض. قد تكون الاختلافات بين خلايا الماوس محوله والخلية العصبية البشرية بسبب زيادة ميل الإنسان تاو نحو التجميع13. الحد الثاني من هذا الاجراء هو انه علي الرغم من ان تتشكل المجاميع تاو في الثقافات ، والتغيرات في الفوسفات تاو بين الخلايا تاو-RDLM-محوله والثقافات تاو-Wt-YFP-محوله كانت غير قابله للكشف باستخدام البروتين PHF-1 (الذي يكتشف تاو الفوسفارلاتيد في السير 396/Ser 404) و CP13 الأجسام المضادة (التي تكشف تاو فوسفريلاتيد في السير 202). وتشير هذه الاستنتاجات إلى ان التجميع تاو في الثقافات تاو-RDLM-YFP بسبب P301L و V337M ينطوي علي اليه مستقله عن فرط فوسفورويليشن ، أو مستوي الذاتية تاو فوسفرويليشن هو تحت المستوي القابل للكشف عن طريق المناعة. بسبب عدم وجود اختلافات في PHF-1 و CP13 النشاط المناعي بين الثقافات تاو-RDLM-YFP و تاو-Wt-YFP ، فمن غير الواضح ما إذا كان هذا النموذج سيكون مفيدا للدراسات تحليل اثار تاو كيناز/الفوسفاتيز النشاط علي علم الامراض. ومع ذلك, كلا PHF-1 و CP13 الأجسام المضادة تعترف المناطق خارج المجال تكرار إيواء الطفرات; ولذلك ، قد تكون الأجسام المضادة الاضافيه المرفوعة ضد مختلف مواقع الفوسفات تاو مفيده للدراسات المستقبلية.
بالاضافه إلى اختبارات ثقافة الخلية ، قد يكون هذا النموذج أداه قيمه للدراسات خارج نموذج ثقافة الخلية. وعلي سبيل المثال ، فان التماثيل المعزولة عن وسائط الخلايا المحولة تحتوي علي أنواع سامه من المواد. Exosomes هي حويصلات سيكريتوري الصغيرة التي صدرت من تقريبا كل نوع الخلية ، وقد تورطت exosomes في نشر تاو14. التماثيل العصبية تاو-RDLM تحتوي علي الإنسان تاو الذي هو قابل للكشف عن طريق وصمه عار الغربية9، وهذه التماثيل كافيه لإنتاج شوائب تاو في الدماغ الماوس ساذجه. هذه الشوائب هي مناعية للأجسام المضادة الخاصة بالإنسان تاو (K9JA) ، ولكن من غير الواضح ما إذا كانت تتضمن الشوائب المجمعة الماوس تاو. النتيجة الموصوفة هنا ان الاجراء لا ينتج المجاميع تلطيخ ثيوفلافين الايجابيه في الخلايا العصبية القوارض يوحي بان الشوائب التي لوحظت في الدماغ الماوس تتكون بالبالكامل من تاو الإنسان ، علي الرغم من ان الدراسات المستقبلية مطلوبه لتاكيد تكوين الرواسب المجرية.
النظر إلى الدور الظاهر لل tau المشتقة من exosome في توباثيس ، فان النموذج الموصوف هنا قد يكون موردا مفيدا لفحص دور exosome في التوسط في الضمور العصبي الناجم عن تاو. وفي الختام ، وهذا الاجراء ينتج نموذجا في المختبر من اعتلال الإنسان الذي له مزايا كبيره علي أنظمه الخلايا العصبية الماوس المحورة وراثيا ، ويمكن استخدامها لمجموعه متنوعة من التحاليل قبل السريرية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.
Acknowledgments
ويود المؤلفون ان يشكروا الدكتور بيتر ديفيس في كليه البرت اينشتاين للطب لتوريد الأجسام المضادة PHF-1 و CP13 والدكتور مارك دايموند في جامعه تكساس ، جنوب غرب ، لتوفير ثوابت تاو. وقد دعم هذا العمل بمنح من جمعيه الزهايمر (NIRG-14-322164) إلى S.H.Y. ومن معهد كاليفورنيا للطب التجديدي (TB1-01193) إلى شعبي
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 cm culture dishes | Thermofisher | 12556002 | |
| 15 mL tubes | Biopioneer | CNT-15 | |
| 16% paraformaldehyde | Thermofisher | 50-980-487 | |
| 24 well culture plates | Thermofisher | 930186 | |
| 50 mL tubes | Biopioneer | CNT-50 | |
| 70% ethanol in spray bottle | Various sources | NA | |
| B27 supplement | Thermofisher | 17504044 | |
| Basement membrane matrix (Matrigel) | Corning | 356231 | |
| Basic FGF | Biopioneer | HRP-0011 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A7906 | |
| Cell culture incubator | Various sources | NA | |
| Centrifuge | Various sources | NA | |
| DMEM-F12 culture media with glutamine | Thermofisher | 10565042 | |
| Ethanol (50% concentration or higher) | Various sources | NA | |
| Flourescently labeled secondary antibodies | Various Sources, experiment dependent | NA | |
| Fluorescent microscope | Various sources | NA | |
| Glass coverslips | Thermofisher | 1254581 | |
| Glass slides | Thermofisher | 12-550-15 | |
| Human neural stem cells | Various sources | NA | |
| Lentiviral vectors | Various sources | custom order | |
| Mounting media | Thermofisher | P36934 | |
| N2 supplement | Thermofisher | 17502048 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermofisher | 15140122 | |
| Phosphate buffered saline | Thermofisher | 14190250 | |
| Primary antibodies | Various Sources, experiment dependent | NA | |
| Rocking or rotating platform | Various sources | NA | |
| Sterile cell culture hood | Various sources | NA | |
| Thioflavin S | Sigma | T1892-25G | |
| Triton X-100 | Thermofisher | BP151-100 | |
| Water bath | Various sources | NA |
References
- Rojas, J. C., Boxer, A. L. Neurodegenerative disease in 2015: Targeting tauopathies for therapeutic translation. Nature Reviews Neurology. 12 (2), 74-76 (2016).
- Kadavath, H., et al. Tau stabilizes microtubules by binding at the interface between tubulin heterodimers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (24), 7501-7506 (2015).
- Wang, Y., Mandelkow, E. Tau in physiology and pathology. Nature Reviews Neurology. 17 (1), 5-21 (2016).
- Gomez-Ramos, A., et al. Characteristics and consequences of muscarinic receptor activation by tau protein. European Neuropsychopharmacology. 19 (10), 708-717 (2009).
- Warmus, B. A., et al. Tau-mediated NMDA receptor impairment underlies dysfunction of a selectively vulnerable network in a mouse model of frontotemporal dementia. Journal of Neuroscience. 34 (49), 16482-16495 (2014).
- DeVos, S. L., et al. Tau reduction in the presence of amyloid-beta prevents tau pathology and neuronal death in vivo. Brain. 141 (7), 2194-2212 (2018).
- Cheng, J. S., et al. Tau reduction diminishes spatial learning and memory deficits after mild repetitive traumatic brain injury in mice. PLOS ONE. 9 (12), e115765 (2014).
- Ando, K., et al. Accelerated human mutant tau aggregation by knocking out murine tau in a transgenic mouse model. The American Journal of Pathology. 178 (2), 803-816 (2011).
- Reilly, P., et al. Novel human neuronal tau model exhibiting neurofibrillary tangles and transcellular propagation. Neurobiology of Disease. 106, 222-234 (2017).
- Kfoury, N., Holmes, B. B., Jiang, H., Holtzman, D. M., Diamond, M. I. Trans-cellular Propagation of Tau Aggregation by Fibrillar Species. The Journal of Biological Chemistry. 287 (23), 19440-19451 (2012).
- Yuan, S. H., et al. Cell-surface marker signatures for the isolation of neural stem cells, glia and neurons derived from human pluripotent stem cells. PLOS ONE. 6 (3), e17540 (2011).
- Marchenko, S., Flanagan, L. Passaging human neural stem cells. Journal of Visualized Experiments. (7), e263 (2007).
- Lathuiliere, A., et al. Motifs in the tau protein that control binding to microtubules and aggregation determine pathological effects. Scientific Reports. 7 (1), 13556 (2017).
- Asai, H., et al. Depletion of microglia and inhibition of exosome synthesis halt tau propagation. Nature Neuroscience. 18 (11), 1584-1593 (2015).
