Summary
Här beskriver vi en metod för att minska storleken på zebra fiskar embryon utan att störa normala utvecklings processer. Denna teknik gör det möjligt att studera mönster skalning och utveckling robusthet mot storleks ändring.
Abstract
I utvecklings processen, embryon uppvisar en anmärknings värd förmåga att matcha deras kropps mönster till sin kropps storlek; deras kropps andel bibehålls även i embryon som är större eller mindre, inom vissa gränser. Även om detta fenomen av skalning har uppmärksam Mats i över ett århundrade, att förstå de bakomliggande mekanismerna har begränsats, på grund av en brist på kvantitativ beskrivning av utvecklingsdynamik i embryon av varierande storlek. För att övervinna denna begränsning, vi utvecklat en ny teknik för att kirurgiskt minska storleken på zebra fiskar embryon, som har stora fördelar för in vivo Live Imaging. Vi visar att efter bal anse rad borttagning av celler och äggula på blastula scenen i separata steg, embryon kan snabbt återhämta sig under rätt betingelser och utvecklas till mindre men annars normala embryon. Eftersom denna teknik inte kräver särskild utrustning, är det lätt anpassningsbar, och kan användas för att studera ett brett spektrum av skalnings problem, inklusive robusthet av morfogen medierad mönstrande.
Introduction
Forskarna har länge känt till att embryon har en anmärknings värd förmåga att bilda konstanta kropps proportioner även om embryots storlek kan variera kraftigt både under naturliga och experimentella förhållanden1,2,3. Trots årtionden av teoretiska och experimentella studier är denna robusthet för storleks variation, kallad skalning, och dess bakomliggande mekanismer fortfarande okänd i många vävnader och organ. För att direkt fånga dynamiken i utvecklings systemet, etablerade vi en reproducerbar och enkel storlek reducerings teknik i zebra fiskar4, som har den stora fördelen i in vivo Live Imaging5.
Zebrafish har fungerat som en modell ryggradsdjur att studera flera discipliner av biologi, inklusive utvecklings bio Logi. I synnerhet är zebra fiskar idealisk för in vivo Live Imaging6 eftersom 1) utveckling kan fortsätta normalt utanför mamman och ägget skalet, och 2) embryona är transparenta. Dessutom kan embryona motstå vissa temperatur-och miljö variationer, vilket gör det möjligt att studera dem under laboratorie förhållanden. Dessutom, förutom konventionella gen uttryck störning av morfolino och mRNA injektion7,8, senaste framstegen i crispr/Cas9 Technology har gjort omvänd genetik i zebra fiskar mycket effektiv9. Dessutom kan många klassiska tekniker i embryologi, såsom cell transplantation eller vävnads kirurgi appliceras4,10,11.
Storleks reducerings tekniker utvecklades ursprungligen i groddjur och andra icke-ryggradsdjur12. Till exempel, i Xenopus laevis, en annan populär ryggradsdjur modell, bisektion längs djur-Vegetal axel på blastula Stage kan producera storlek-reducerade embryon12,13. Men i våra händer detta ett steg tillvägagångs sätt resulterar i dorsalized eller ventralized embryon i zebra fisk, förmodligen eftersom rygg determinanter fördelas ojämnt och man kan inte veta deras lokalisering från morfologi av embryon. Här demonstrerar vi en alternativ tvåstegs hacknings teknik för zebra fiskar som producerar normalt utvecklade men mindre embryon. Med denna teknik tas cellerna först bort från djur staven, en region av naiva celler som saknar organisatörsaktivitet. För att balansera mängden äggula och celler, vilket är viktigt för epiboly och efterföljande morfogenes, är äggula sedan bort. Här, vi detalj detta protokoll och ge två exempel på storlek inavvikelse i mönster bildning; somite formation och ventrala neuralrör mönster. Kombinerat med kvantitativ avbildning, utnyttjade vi storleks reducerings tekniken för att undersöka hur storleken på somiter och neuralrör påverkas i storlek reducerade embryon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla fiskrelaterade förfaranden genomfördes med godkännande av den institutionella djur omsorgs-och användnings kommittén (IACUC) vid Harvard Medical School.
1. förberedelse av verktyg och reagens
-
Gör en tråd slinga för att hacka embryon
- Ta 20 cm rost fritt stål tråd som är styv och icke-frätande med en diameter på 40 μm. Slinga tråden genom i glas kapillär (1,0 mm ytterdiameter, 0,5 mm innerdiameter, ingen glöd tråden), vilket gör en liten slinga på toppen (slinga längd är 1,0 mm)
- Sätt en liten droppe av klart nagellack på spetsen av glaset kapillär mellan tråden slingan för att hålla den på plats. Låt torka. Se till att inte få något nagellack på slingan delen, eftersom det kan skada embryona.
- Fäst glaset kapillär med slingan på en trä chopstick (9 "bambu engångspinnar bruten i hälften) med hjälp av Lab tejp. Lämna ca 2,5 cm av glaset kapillär sträcker sig bortom chopstick, så att chopstick del av verktyget inte doppa i vattnet. Justera denna längd till preferens.
-
Alternativt, gör en glasnål för att hugga embryon
- Nyp ena änden av glaset Pasteur pipett med pincett, medan du håller den andra sidan med en hand. Värm upp den tunna delen av pipetten över en sprit lampa eller bunsenbrännare.
- Hand-dra glaspipetten. Den idealiska pipetten som en diameter på ca 30 μm och en mild kurva (krökningsradie = ca 5 mm). Rätt diameter och krökning erhålls med övning och viss chans.
-
Förbered metylcellulosa
- Metylcellulosa används för att hålla embryon medan hugga. Gör 2% metyl cellulosa lösning i 1/3x ringer lösning (116 mM NaCl, 2,9 mM KCl, 1,8 mM CaCl2, och 5 mm 4-(2-hydroxyeyl) -1-piperazineetylsulfonsyra (Hepes, pH 7,2)). Skaka metylcellulosa pulver i 1/3x ringer lösning vid 4 ° c över natten.
- Alternativt, tillsätt ~ 1,5 mL fenolrött (0,5% i DPBS stam lösning) till 10 mL 2% metylcellulosa lösning, tills rött, för att göra lösningen synlig. Skaka den tills färgen blir enhetlig.
2. beredning av Zebrafish embryon för kirurgisk storleks reduktion
-
Samla in embryon
- Placera en eller två manliga och en eller två kvinnliga zebra fiskar i en parnings kammare fylld med mycket vatten. Separera hanar och honor med hjälp av en plast avdelare. Använd AB linje för somite Imaging (avsnitt 4) och en transgena reporter linje neuralrörsmönster (NKX 2,2: mem-GFP, dbx1b: GFP, eller Olig2: dsred) för neuralrör Imaging. Lämna dem i kammaren över natten.
Anmärkning: Valet av vuxna är viktigt för att få ägg som överlever kirurgi väl. Typiskt, unga friska Honor producerar friska ägg. - På nästa morgon, flytta kammaren till grunt vatten och placera kammaren med liten lutning. Ta bort avdelaren så att fisken kan para sig.
- Samla äggen genom att hälla i en te sil. Överför äggen till en petriskål med ägg vatten (för 20x ägg vatten, 6 g omedelbar havssalt, 1,5 g CaSO4 och 1 L H2O; Använd vid 1x). För bättre iscensättning, samla äggen direkt efter leken. Placera embryona i en 28,5 ° c inkubator.
- Vid behov, injicera morpholino, mRNA, etc., vid 1 – 4 cell stadier efter ett gemensamt protokoll7,8. Injicera mRNA för fluorescerande membran etikett (mem-mCherry, mem-mBFP1, eller mem-mcitrin) för neuralrörsavbildning (avsnitt 5).
- Placera en eller två manliga och en eller två kvinnliga zebra fiskar i en parnings kammare fylld med mycket vatten. Separera hanar och honor med hjälp av en plast avdelare. Använd AB linje för somite Imaging (avsnitt 4) och en transgena reporter linje neuralrörsmönster (NKX 2,2: mem-GFP, dbx1b: GFP, eller Olig2: dsred) för neuralrör Imaging. Lämna dem i kammaren över natten.
-
Dekorionat med pronase
- Runt den 128-cell till 256-cell Stadium, överföra hälsosamma embryon till en 35 mm glas mat rätt fylld med ägg vatten. Ta bort så mycket ägg vatten som möjligt från skålen.
- Tillsätt 1 mL 20 mg/mL pronas. Snurra försiktigt embryon runt genom att flytta plattan och försiktigt Pipettera lösningen upp och ner för att hjälpa dechorionation med hjälp av en glaspipett.
- När chorionerna börjar förlora elasticitet (vanligt vis 1-4 min efter tillsats av pronase, beroende på mängden ägg och vatten), tillsätt så mycket ägg vatten som möjligt för att späda pronase. Bedöm elasticitet förlust genom att försiktigt röra chorion med pincett; chorion ska hålla bucklan utan att omedelbart studsa tillbaka. Överför äggen till en annan mat rätt med ägg vatten med hjälp av en glaspipett (vid denna punkt, de flesta av korioner är inte bruten).
- Alternativt, häll försiktigt embryona från skålen i en stor 400 mL glas bägare fylld med ägg vatten utan att utsätta embryon för luft. Låt sedan embryona helt bosätta sig. Luta bägaren för att låta embryon falla åt ena sidan. Samla dessa embryon med hjälp av en glaspipett och överför till en ny 35 mm glas mat rätt fylld med 1/3x ringer lösning.
- Vänta i flera minuter tills de flesta av chorionerna förlorar elasticiteten helt. Ta bort resterande korioner från embryon genom att försiktigt Pipettera äggen. Ta bort skadade embryon och inkubera embryona i en inkubator på 28,5 ° c.
3. kirurgisk storleks reduktion och återhämtning
- Förbered en ren 35 mm glas rätt. Sprid cirka 0,5 mL 2% metylcellulosa (i 1/3x ringer lösning, med fenol röd för att visualisera) nära mitten av botten av den större skålen med hjälp av en plast spatel. Tunt och jämnt spridning av metylcellulosa till en tjocklek av cirka 0,5 mm.
- Häll cirka 30 mL 1/3x ringer lösning på sidan av skålen och låt spridas på resten av skålen, som täcker metylcellulosa.
- Förlägga dechorionated embryon på 256-cell-1k-cell arrangerar på 2% methyl cellulosa. Justera inriktningen av embryon på sidan för att visualisera både cellerna och äggulan. (Figur 1)
- Hacka cirka 30%-40% av cellerna från blastoderm nära djur Polen genom att skära vinkel rätt mot den animaliska-vegetalaxeln med hjälp av tråd slinga (eller glasnålen) (figur 1, övre paneler). När du har tagit bort cellerna, Knacka försiktigt ändarna tillsammans för att hjälpa de återstående cellerna sticka tillbaka. Inom några minuter bör de döda cellerna Slough av när embryot börjar läka.
- Gör ett litet sår till äggulan nära den vegetala Polen i stället för "hugga" äggulan (figur 1 mellersta paneler). Sår äggulan genom att Hack ägget membranet med den monterade tråden. Äggula kommer att sippra ut i några minuter efter sårande, och sedan såret kommer att läka (figur 1 botten paneler).
- När äggulan slutar sippa ut, flytta embryot med ett Pipettera utanför metylcellulosa i samma skål för att tillåta dem att bättre återhämta sig.
- Upprepa steg 3.4-3.6 för alla embryon. Låt skålen stabil i 30 min medan embryona återhämta sig.
-
Överföra embryon till en ny mat rätt med färska 1/3x ringer lösning och lägg dem i 28,5 ° c inkubator så att de kan återhämta sig helt.
- Valfritt Om stadiet av intresse är det tidiga somitestadiet kan embryon inkuberas vid 20 ° c efter att ha inkuberats vid 28,5 ° c till sköld stadiet, för att justera tidpunkten för experiment och avbildning.
4. live Imaging av Zebrafish Somitogenesis
- Förbered 100 ml 1% AGA ros lösning genom att tillsätta 1 g AGA Ros till 100 ml ägg vatten, upphettning tills AGA ros är helt upplöst. Låt svalna för 5-10 min till en temperatur på 62-72 ° c.
-
Förbered ett fäste för avbildning.
Anmärkning: denna guide utvecklades för användning med ett inverterat brett fält Mikroskop.- Häll ~ 15 ml 1% AGA ros i en 100 mm x 15 mm plast petriskål.
- Placera försiktigt en dorsal Mount v1 mögel mall5 på botten av petriskål. Håll formen på botten med hjälp av en vikt, såsom 15 mL tub med vatten.
Anmärkning: Detta är så embryona är så nära botten av petriskål som möjligt, när du använder en inverterad Mikroskop. Även om embryona är monterade i sidled för somite Imaging, här dorsal Mount v15 används eftersom det håller embryon bättre på tidiga somite stadier. - Låt svalna tills AGA ros är helt stelnat. Häll i ~ 30 ml ägg vatten med 0,01% trikain, och försiktigt bort mögel genom att försiktigt nyfikna bort med pincett.
-
Mount embryon för somite Imaging
- Förbered 1% låg smältning agarose i 1/3x ringer lösning (eller ägg vatten) och hålla den vid 42 ° c. Vänta tills temperaturen kommer ner till 42 ° c.
- Under en dissektion Mikroskop, placera ett embryo per brunn. Pipettera cirka 1 μL låg smältande agarose i brunnen för att finjustera den väl storlek till storleken på enskilda embryon som varierar i storlek, särskilt mellan dem med och utan storleks reduktion.
- Snabbt orientera embryon innan låg smältande agarose är stelnat så att embryona ansikte helt i sidled till skålen. Efter montering av embryon, försiktigt placera täckglasen i AGA ros fästet att hålla embryona på plats. Inriktningen är särskilt viktig för den långsiktiga somite Imaging eftersom embryona måste exakt i sidled monteras för alla somite gränser som tydligt avbildas vid senare stadier.
- Dränera bort från monterings området och manipulera en 25 mm x 25 mm täckglas så att det är 45 grader offset från orienteringen av den fyrkantiga streck satsen som gjorts av formen. Skjut täckglasen över formen i denna riktning tills varje hörn vilar på en annan sida av formen.
Anmärkning: Även om detta protokoll är för en inverterad Mikroskop, placera ett täckglas ovanpå formen är fortfarande viktigt så att embryona inte rör sig under överföring till Mikroskop.
-
Avbildning somite formation process
- Värm mikroskopet till 28 ° c i en inkubator byggd med foamcore brädor och en skåp värmare.
- Placera petriskål med de monterade embryona på Mikroskop scenen. Hitta embryot monterad i övre vänstra brunnen av AGA ros montera med lägre förstorings glas, sedan byta mål till 10x.
- Ställ in bild insamling.
Anmärkning: Denna anvisning är för ljust sätter in. - Hitta förutsättningar för ljus styrka, exponerings tid och kondensor så att somitegränsen kan ses tydligt. Med inställningar för z-stack ställer du in det lägsta och högsta önskade bild planet. Ställ in total tid och tidsintervall. Hitta och registrera XY positioner av alla embryon monterade så flera embryon kan Timelapse avbildas på en gång.
- Mät längder PSM och thoraxsegmenten med Fiji16.
5. avbildning av neurala röret Patterning
- Förbered 100 ml 1% AGA ros lösning genom att tillsätta 1 g AGA Ros till 100 ml ägg vatten, upphettning tills AGA ros är helt upplöst. Låt svalna i 5-10 min till 62-72 ° c. Justera trikain till 0,01%.
-
Förbered en dorsalfäste för avbildning.
Anmärkning: denna bruksanvisning är utvecklad för användning med upprätt fluorescensmikroskop. För inverterade Mikroskop täckglas botten rätter är nödvändiga och monterings orientering i steg 3 är vänt.- Häll i ~ 15 ml 1% AGA ros i en 100 mm x 15 mm plast petriskål. Försiktigt flyta en dorsal Mount v1 mögel på ytan av AGA ros att undvika att införa luft bubblor. Låt svalna tills AGA ros är helt stelnat.
- Ta försiktigt bort formen med pincett eller ett rakblad. Fyll skålen med ägg vatten med 0,01% trikainmesilat och täck tills användning.
-
Mount embryon för neuralrörsavbildning.
- Låt transgena eller injiceras fluorescerande storlek-reducerad och kontrol lera embryon att utveckla tills 20-25 somite skede (ungefär 18-22 h efter befruktning). Embryon som uttrycker en fluorescerande membran etikett (mem-mCherry, mem-mBFP1, eller mem-mcitrin) och en transgen reporter på neuralrörsmönster (NKX 2.2: mem-GFP, dbx1b: GFP, eller Olig2: dsred) används för avbildning.
- Byt ut ägg vatten mediet i preparerade dorsala Mount med 0,01% trikainmesilat arbets lösning. Pipettera försiktigt i embryon som ska avbildas till brunnar i dorsalfästet.
- Manipulera embryon i rätt orientering så att huvudet är vänd framåt i fästet och svansen pekar mot den bakre med dorsala delen vänd mot vatten ytan.
- Orientera embryot så att svansen ligger platt och inte pekade nedåt mot botten av skålen. Det är ibland bra att vila den bakre delen av svansen på sido kanten av monteringen väl för att förhindra svansen från att sjunka och oavsiktligt avbildning av hindbrain. Upprepa för varje embryo. Gör vissa med storlek reducerade embryon att de inte faller djupt in i brunnarna för att avbildas.
- Dränera bort från monterings området och manipulera en 25 mm x 25 mm täckglas så att det är 45 ° offset från orienteringen av den fyrkantiga streck satsen som gjorts av formen. Skjut täckglasen över formen i denna riktning tills varje hörn vilar på en annan sida av formen.
- Rotera täckglaset långsamt tills det försiktigt faller på monterings området. Kontrol lera att embryona fortfarande är monterade i rätt positioner och orienteringar. Om för mycket rörelse orsakas av att täckglaset faller, ta försiktigt bort och upprepa monteringen från steg C.
-
Bild i 3-D utveckla ryggmärgen.
- Transportera försiktigt skålen med monterade embryon till konfokalmikroskopet. Se till att använda ett ruinerat Mikroskop vid långvarig liveavbildning. Annars är låga temperaturer tolerabla.
- Under brightfield belysning, navigera till embryot till bild och centrera synfält på önskad främre-posterior position. För att möjliggöra en detaljerad jämförelse mellan embryona måste denna ståndpunkt på varje embryo vara konsekvent.
- Ställ in avbildnings parametrarna för att excitera och fånga signalen från de fluorescerande proteiner som avbildas. Parametrarna kan justeras med ögat för att skapa en önskad bild på det ursprungliga provet. Om du vill aktivera mätning konsekvens, tillämpa dessa inställningar på alla embryon i data uppsättningen. Om många z-stackar krävs optimera inställningar för hastighet.
- Använd z-stackinställningar och Ställ in det lägsta och högsta önskade bild planet. För optimal bild kvalitet i z-stacken ställer du in z-upplösningen till den högsta som är optimal för bländarinställningen. Bra bilder kan genereras med 1 μm z-mellanrum.
- Analysera bild data med valfri metod.
Anmärkning: I det här fallet utfördes analys med egna MATLAB-skript som möjliggör enkel segmentering av neurala delar av en bild och kvantifiering av bild signal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Volym reduktion av äggula är viktig för normal morfologi
Som nyligen beskrivits i Almuedo-Castillo et al.17, storlek minskning av embryon kan uppnås utan att minska äggula volym. Att jämföra med och utan äggula volym reduktion, utförde vi både två-stegs hackning (både blastula och äggula) och blastula-bara hugga (figur 2 och kompletterande film 1). Två steg hackade embryon visade till synes normala övergripande morfologi jämfört med kontroll (endast dechorionation) embryon, andra än storleks skillnad, under hela utvecklingsstadier (se övre och mellersta paneler i figur 2). Å andra sidan, blastula-endast hackade embryon visade en märklig morfologi, särskilt i tidigare stadier. Under epiboly hade embryona en trängd och indragen utseende (se botten panelen för 70% epiboly i figur 2). Vid följande somitstadium konstaterades att mitt linjen strukturer tillplattade (dvs. DV-längd är relativt kortare än ML längd) på många axiella nivåer (se botten paneler för 8 och 20 somite i figur 2). Vid senare stadier, kroppen strukturer intill äggulan, såsom mitten-och hindbrain, och den första ~ 10 somites, fortfarande visade en relativt tillplattad form, möjligen på grund av ökad spänning från den relativt större äggulan.
Somite storlek minskning av storlek reducerade embryon
Somiter är segmentell strukturer som verkar övergående under embryogenes och ger upphov till Kotor och skelett mus kula tur. Från presomitic Mesoderm (PSM), thoraxsegmenten bildas en efter en från den främre till bakre riktningen i ett periodiskt sätt (e.g. 25 min för Zebrafish, 2 h för möss) (figur 3a). Vi utförde time lapse Imaging av somite formation både för kontroll och hackade embryon och mätt storleken på de flesta nybildade somiter (figur 3B). I både kontroll och hackade embryon befanns storleken på somiter som bildades vid senare stadier vara mindre jämfört med dem från tidigare stadier. Även i hela somite bildandet stadier, hackade embryon hade mindre somiter än de i kontroll embryon (figur 3C).
Neuralrörshöjderna reduceras efter storleks reduktion
För att se effekten av embryo storleks minskning på neuralrörsstorlek, utförde vi vår två-stegs hackning teknik på mem-mcherry injiceras embryon och avbildade deras ryggmärgen vid 20 hpf med hjälp av vår konfokalmikroskopi Imaging system (figur 4A, B). I den här data uppsättningen minskades neuralrörshöjder efter storleks minskning med 12,4% ± 3,2%, mätt manuellt med hjälp av anpassad bild analys kod (figur 4C). Sammantaget, dessa data visar att storleks minskning minskar neuralrörshöjd. Denna teknik kan användas för att mäta effekterna av storleks minskning på neurala mönster.
Figur 1 : Storleks reducerings teknik. Cirka 30%-40% av cellerna klipptes från djur staven (övre panelerna). Membranet kring äggulan var noga sårad så att äggulan sippade ut (mitten paneler). För följande några minuter, äggula sipprade ut och sedan såren på både blastoderm och äggula läkt upp (botten paneler). Skalbar = 200 μm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Jämförelse mellan två metoder för storleks reduktion. Kontrol lera embryon (topp paneler, översta embryon för 24 hpf och 30 hpf), storlek reducerade embryon med två-stegs hackning (blastula och äggula, mellersta paneler, mellersta embryon för 24 hpf och 30 hpf) och storlek reducerade embryon med blastula-bara hugga (botten paneler, botten embryon för 24 hpf och 30 hpf) jämförs längs utvecklingsstadier. Observera att i blastula-endast hackade embryon, blastoderm volymen är mycket mindre jämfört med äggulan (på 70% epiboly). Som ett resultat, har embryot en oproportionerligt tillplattad form på somite stadier (dvs, DV-axeln är relativt kortare jämfört med AP-axeln i blastula-endast hackade embryon, jämfört med kontroll eller en två-stegs hackad en). Skala BA = 200 μm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Storleks reduktion minskar längden på somiter. ASchematisk illustration av somitformation. (B) ljusa fält bilder av kontroll och hackade embryon över tiden. Gula pilspetsar indikerar den mest nybildade Somiten vid varje somitestadium. (C) somitlängd (i främre-bakre axel) mätningar över tiden för både kontroll och hackade embryon. Felstaplar representerar standard avvikelse. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : Storleks reduktion minskar höjden på neuralröret. (a-B) Exempel på bilder av normal storlek (a) och storlek reducerade (B) TG (ptch2: Kaede) embryon som injicerades i encellig fas med Mem-mcherry mRNA. Skalbar = 20 μm. (C) neuralrörshöjder extraheras från manuell segmentering av neuralröret i varje z-stack. Statistiskt signifikanta skillnader observeras i genomsnittlig neuralhöjd när värden jämförs med ett oparat t-test (p = 0,0397). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande film 1: jämförelse mellan två steg hackning kontra blastula-bara hugga. Översta raden = kontroll embryon, mellersta raden = storlek reducerade embryon med två steg hackning, nedersta raden = storlek reducerade embryon med blastula bara hugga. Filmer togs var 3 min för 12 h. Scale bar = 1 mm. vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ner.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Historiskt har, bland ryggradsdjur, storleks reduktion huvudsakligen utförts med hjälp av amfibiska embryon, genom att de embryon som finns längs den animaliska vegetala axeln har använts på ett blastula Stadium12. Men det finns främst två skillnader mellan groda och zebra fisk embryon när vi Tudela embryon. Först, vid det skede då zebra fisk embryon blir toleranta av bisecting (blastula skede), är arrangören ligger i ett begränsat område av blastula marginal18,19,20,21. Eftersom man inte kan berätta placeringen av arrangören från morfologin av embryon, slumpmässigt skära embryot längs djur-Vegetal axeln producerar dorsalized eller ventralized embryon. För det andra, till skillnad från groda embryon, zebra fiskar embryon gå igenom en process som kallas epiboly, där cellerna rör sig mot den vegetala Polen runt en separerad äggula tills den är helt omgiven av celler. Om endast en del av blastoderm avlägsnas, färre celler återstår att uppsluka en äggula av relativt större volym, och som ett resultat, morfologi verkar påverkas efter epiboly. Därför använder vi två steg hackning där vi hugga blastulae nära djur Polen, för att undvika att skära av arrangören, och sår äggula membranet, att göra äggula storlek proportionell mot blastula.
Förutom två-stegs hackning, fann vi det medium där storleks minskning kirurgi utförs är avgörande för återvinning av embryon efter operationen. Bland flera Media Vi försökte (ägg vatten, ägg vatten + albumin, Danieau buffert, L15, L15 + FBS, 1/3x ringer, 1x ringer), endast 1/3x ringer och 1x ringer gav höga överlevnads tal; i andra medier, embryon misslyckats med att återhämta sig från såren.
En viktig fel söknings tips för låg överlevnads frekvens är att använda hälsosamma embryon från friska och unga föräldra fiskar. Vi noterade att även när kontrollen icke-storlek reducerade embryon visar nästan 100% överlevnad, när storleken reduceras, embryon från äldre fiskar tenderar att Visa lägre överlevnads grad. Observera också att överlevnaden tenderar att minska när storleks minskningen kombineras med ytterligare perturbationer, såsom morfolino injektion.
Enkelheten i storleks reducerings tekniken som beskrivs här gör det möjligt för forskare att tillämpa denna teknik utan specialiserad utrustning eller intensiv träning. Vidare, eftersom storleken reduceras embryon förbli mindre tills senare stadier av utveckling (när de börjar äta, verkar deras storlek för att fånga upp med kontroll fisken), denna teknik kan tillämpas för att studera skalning av många vävnader och organ. Därför gör denna teknik det möjligt att kombinera storleks reduktion och kvantitativ in vivo Live Imaging för att studera skalning och storleks kontroll av olika system.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna deklarerar inga konkurrerande eller ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Arbetet stöddes av PRESTO-programmet för Japans vetenskaps-och teknik byrå (JPMJPR11AA) och ett nationellt institut för hälso bidrag (R01GM107733).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 60 mm PYREX Petri dish | CORNING | 3160-60 | |
| Agarose | affymetrix | 75817 | For making a mount for live imaging |
| Agarose, low gelling temperature Type VII-A | SIGMA-ALDRICH | A0701-25G | |
| CaCl2 | EMD | CX0130-1 | For 1/3 Ringer's solution |
| CaSO4 | For egg water | ||
| Cover slip (25 mm x 25 mm, Thickness 1) | CORNING | 2845-25 | |
| Disposable Spatula | VWR | 80081-188 | |
| Foam board | ELMER'S | 951300 | For microscope incubator |
| Forcept (No 55) | FST | 11255-20 | |
| Glass pipette | VWR | 14673-043 | |
| HEPES | SIGMA Life Science | H4034 | For 1/3 Ringer's solution |
| INCUKIT XL for Cabinet Incubators | INCUBATOR Warehouse.com | For microscope incubator | |
| Instant sea salt | Instant Ocean | 138510 | For egg water |
| KCl | SIGMA-ALDRICH | P4504 | For 1/3 Ringer's solution |
| Methyl cellulose | SIGMA-ALDRICH | M0387-100G | |
| NaCl | SIGMA-ALDRICH | S7653 | For 1/3 Ringer's solution |
| Petri dish | Falcon | 351029 | For making a mount for live imaging |
| Phenol red | SIGMA Life Science | P0290 | |
| Pipette pump | BEL-ART PRODUCTS | F37898 | |
| Pronase | EMD Millipore Corp | 53702-250KU | |
| Tricaine-S (MS222) | WESTERN CHEMICAL INC | NC0135573 | |
| Ultra thin bright annealed 316L dia. 0.035 mm Stainless Steel Weaving Wires | Sandra | The wire we used was obtained ~20 years ago and we could not find exactly the same one. This product has the same material and diameter as the one we use. |
References
- Cooke, J. Scale of body pattern adjusts to available cell number in amphibian embryos. Nature. 290, 775-778 (1981).
- Driesch, H. Entwicklungsmechanische Studien: I. Der Werthe der beiden ersten Furchungszellen in der Echinogdermenentwicklung. Experimentelle Erzeugung von Theil- und Doppelbildungen. Zeitschrift fur wissenschaftliche Zoologie. , (1892).
- Morgan, T. H. Half embryos and whole embryos from one of the first two blastomeres. Anatomischer Anzeiger. 10, 623-638 (1895).
- Ishimatsu, K., et al. Size-reduced embryos reveal a gradient scaling-based mechanism for zebrafish somite formation. Development. 145, (2018).
- Megason, S. G. In toto imaging of embryogenesis with confocal time-lapse microscopy. Methods in Molecular Biology. 546, 317-332 (2009).
- Graeden, E., Sive, H. Live imaging of the zebrafish embryonic brain by confocal microscopy. Journal of Visualized Experiments. (26), e1217 (2009).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments. (25), e1115 (2009).
- Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos. Journal of Visualized Experiments. (27), e1113 (2009).
- Sorlien, E. L., Witucki, M. A., Ogas, J. Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio. Journal of Visualized Experiments. (138), e56969 (2018).
- Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation. Journal of Visualized Experiments. (29), e1394 (2009).
- Mizuno, T., Shinya, M., Takeda, H. Cell and tissue transplantation in zebrafish embryos. Methods in Molecular Biology. 127, 15-28 (1999).
- Cooke, J. Control of somite number during morphogenesis of a vertebrate, Xenopus laevis. Nature. 254, 196-199 (1975).
- Inomata, H., Shibata, T., Haraguchi, T., Sasai, Y. Scaling of dorsal-ventral patterning by embryo size-dependent degradation of Spemann's organizer signals. Cell. 153, 1296-1311 (2013).
- Gomez, C., et al. Control of segment number in vertebrate embryos. Nature. 454, 335-339 (2008).
- Lauschke, V. M., Tsiairis, C. D., Francois, P., Aulehla, A. Scaling of embryonic patterning based on phase-gradient encoding. Nature. 493, 101-105 (2013).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
- Almuedo-Castillo, M., et al. Scale-invariant patterning by size-dependent inhibition of Nodal signalling. Nature Cell Biology. 20, 1032-1042 (2018).
- Koos, D. S., Ho, R. K. The nieuwkoid gene characterizes and mediates a Nieuwkoop-center-like activity in the zebrafish. Current Biology. 8, 1199-1206 (1998).
- Yamanaka, Y., et al. A novel homeobox gene, dharma, can induce the organizer in a non-cell-autonomous manner. Genes and Development. 12, 2345-2353 (1998).
- Jesuthasan, S., Stahle, U. Dynamic microtubules and specification of the zebrafish embryonic axis. Current Biology. 7, 31-42 (1997).
- Schier, A. F., Talbot, W. S. The zebrafish organizer. Current Opinion in Genetics and Development. 8, 464-471 (1998).
