Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Kirurgisk Størrelsesreduksjon av sebrafisk for studiet av embryonale mønster skalering

Published: May 3, 2019 doi: 10.3791/59434
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Systems Biology, Harvard Medical School

Summary

Her beskriver vi en metode for å redusere størrelsen på sebrafisk embryo uten å forstyrre normale utviklingsprosesser. Denne teknikken gjør det mulig å studere mønster skalering og utviklingsmessige robusthet mot størrelsesendring.

Abstract

I utviklingsprosessen, embryo viser en bemerkelsesverdig evne til å matche deres kropps mønster til sin kroppsstørrelse; deres kropps andel opprettholdes selv i embryo som er større eller mindre, innenfor visse grenser. Selv om dette fenomenet skalering har tiltrukket seg oppmerksomhet i over et århundre, forstå de underliggende mekanismene har vært begrenset, skyldes delvis en mangel på kvantitativ beskrivelse av utviklingsmessige dynamikk i embryo av varierte størrelser. For å overvinne denne begrensningen, utviklet vi en ny teknikk for å kirurgisk redusere størrelsen på sebrafisk embryo, som har store fordeler for in vivo Live Imaging. Vi viser at etter balansert fjerning av celler og eggeplomme på Blastulastadiet scenen i separate trinn, kan embryo raskt komme seg under de rette forholdene og utvikle seg til mindre, men ellers normalt embryo. Siden denne teknikken ikke krever spesialutstyr, er det lett å tilpasse, og kan brukes til å studere et bredt spekter av Skalerings problemer, inkludert robusthet av morphogen mediert mønster.

Introduction

Forskere har lenge visst at embryo har en bemerkelsesverdig evne til å danne konstant kropps proporsjoner selv om embryo størrelse kan variere sterkt både under naturlige og eksperimentelle forhold1,2,3. Til tross for ti år med teoretiske og eksperimentelle studier, denne robusthet til størrelse variasjon, kalt skalering, og dens underliggende mekanismer forblir ukjent i mange vev og organer. For å direkte fange dynamikken i utviklingssystemet, etablerte vi en reproduserbar og enkel størrelsesreduksjon teknikk i sebrafisk4, som har den store fordelen i in vivo Live Imaging5.

Sebrafisk har fungert som en modell virveldyr dyr å studere flere disipliner av biologi, inkludert utviklingsmessige biologi. Spesielt er sebrafisk ideell for in vivo Live Imaging6 fordi 1) utviklingen kan fortsette normalt utenfor mor og eggeskall, og 2) embryo er gjennomsiktige. I tillegg kan embryo tåle noen temperatur og miljømessige svingninger, som tillater dem å bli studert i laboratorieforhold. Også, i tillegg til konvensjonelle genuttrykk forstyrrelsene av morpholino og mRNA injeksjon7,8, nylige fremskritt i CRISPR/Cas9 teknologi har gjort omvendt genetikk i sebrafisk svært effektiv9. Videre kan mange klassiske teknikker i embryologi, for eksempel celle transplantasjon eller vevs kirurgi påføres4,10,11.

Størrelsesreduksjon teknikker ble opprinnelig utviklet i amfibier og andre ikke-virveldyr dyr12. For eksempel, i Xenopus laevis, en annen populær virveldyr dyremodell, bisection langs dyret-vegetal aksen på Blastulastadiet stadiet kan produsere størrelse-redusert embryo12,13. Men i våre hender denne ett-trinns tilnærming resulterer i dorsalized eller ventralized embryo i sebrafisk, antagelig fordi rygg faktorer er fordelt ujevnt og man kan ikke kjenne sin lokalisering fra morfologi av embryo. Her viser vi en alternativ to-trinns hakke teknikk for sebrafisk som produserer normalt utvikling, men mindre embryo. Med denne teknikken, celler er først fjernet fra dyret polet, en region av naive celler mangler i arrangøraktivitet. For å balansere mengden av eggeplomme og celler, noe som er viktig for epiboly og påfølgende morphogenesis, eggeplomme blir deretter fjernet. Her detalj vi denne protokollen og gir to eksempler på størrelse invarians i mønsteret formasjon; somite dannelse og ventrale mønstre for nevrale rør. Kombinert med kvantitativ bildebehandling, benyttet vi størrelsesreduksjon teknikk for å undersøke hvordan størrelsene på somites og neural tube er påvirket i størrelse redusert embryo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle fiske relaterte prosedyrer ble utført med godkjennelse fra den institusjonelle dyre omsorgen og bruks komitéen (IACUC) ved Harvard Medical School.

1. forberedelse av verktøy og reagenser

  1. Lag en wire loop å hogge embryo
    1. Ta 20 cm rustfritt stål wire som er stiv og ikke-etsende med en diameter på 40 μm. Loop ledningen gjennom i glass kapillær (1,0 mm ytre diameter, 0,5 mm indre diameter, ingen filament), noe som gjør en liten sløyfe på toppen (loop lengde er 1,0 mm)
    2. Sett en liten dråpe av klar neglelakk på tuppen av glass kapillær mellom wire loop for å holde den på plass. La tørke. Pass på å ikke få noen neglelakk på loop delen, som det kan skade embryo.
    3. Fest glass kapillær med loopen på en tre chopstick (9 "bambus disponibel spisepinner delt i to) ved hjelp av lab tape. La ca 2,5 cm av glasset kapillær strekker seg utover chopstick, slik at den chopstick delen av verktøyet ikke dyppe i vannet. Juster denne lengden til ønsket preferanse.
  2. Alternativt kan du lage en glass nål for å hogge embryo
    1. Knip den ene enden av glass Pasteur pipette med tang, mens du holder den andre siden med en hånd. Varm den tynne delen av pipette over en ånd lampe eller Bunsen brenner.
    2. Hånd-trekk glasset pipette. Den ideelle pipette som en diameter på ca 30 μm og en mild kurve (radius av krumning = ca 5 mm). Riktig diameter og krumning er oppnådd med praksis og noen sjanse.
  3. Forbered metyl cellulose
    1. Metyl cellulose brukes til å holde embryo mens hakking. Lag 2% metyl cellulose løsning i 1/3x ringer løsning (116 mM NaCl, 2,9 mM KCl, 1,8 mM CaCl2, og 5 mm 4-(2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES; pH 7,2)). Shake methyl cellulose pulver i 1/3x ringer ' s løsning ved 4 ° c over natten.
    2. Du kan eventuelt legge til ~ 1,5 mL fenol rød (0,5% i DPBS lagerløsning) til 10 mL 2% metyl cellulose løsning, til rød, for å gjøre løsningen synlig. Rist den til fargen blir uniform.

2. utarbeidelse av sebrafisk embryo for kirurgisk Størrelsesreduksjon

  1. Samle inn embryo
    1. Plasser en eller to mannlige og en eller to kvinnelige sebrafisk i et parring kammer fylt med mye vann. Skill menn og kvinner ved hjelp av en plast skillevegg. Bruk AB linje for somite Imaging (§ 4) og en transgene reporter linje av nevrale rør mønstre (nkx 2.2: mem-gfp, dbx1b: gfpeller Olig2: dsred) for neural tube Imaging. La dem i kammeret over natten.
      Merk: Valget av voksne er viktig for å få egg som overlever kirurgi godt. Typisk, unge sunne hunner produsere sunne egg.
    2. På neste morgen, overføre kammeret i grunt vann og plasser kammeret med liten Vipp. Fjern skillelinjen slik at fisken kan mate.
    3. Samle eggene ved å strømme inn i en te sil. Overfør eggene til en Petri rett med egge vann (for 20x egg vann, 6 g Instant havsalt, 1,5 g CaSO4 og 1 L H2O; bruk ved 1x). For bedre staging, samle eggene rett etter gyting. Plasser embryo i en 28,5 ° c inkubator.
    4. Injiser om nødvendig morpholino, mRNA, etc., ved 1 – 4 celle etapper etter en felles protokoll7,8. Injiser mRNA for fluorescerende membran merke (mem-mCherry, mem-mBFP1eller mem-mCitrine) for nevrale rør avbildning (avsnitt 5).
  2. Dechorionate bruker pronase
    1. Rundt 128-celle til 256-cellers Stadium, overføre sunne embryo til en 35 mm glass rett fylt med egg vann. Fjern så mye egg vann som mulig fra fatet.
    2. Tilsett 1 mL 20 mg/mL pronase. Roter embryo forsiktig rundt ved å flytte platen og pipette løsningen forsiktig opp og ned for å hjelpe til med å dechorionation ved hjelp av en pipette med glass.
    3. Når chorions begynner å miste elastisitet (vanligvis 1-4 min etter tilsetning av pronase, avhengig av mengden av egg og vann), tilsett så mye egg vann som mulig for å fortynne pronase. Vurdere tap av elastisitet ved forsiktig å berøre chorionic med tang; chorionic bør holde bulk uten umiddelbart spretter tilbake. Overfør eggene til en annen rett med egg vann ved hjelp av et glass pipette (på dette punktet, de fleste av chorions er ikke brutt).
      1. Alternativt kan du forsiktig helle embryo fra fatet til en stor 400 mL glass beger fylt med egg vann uten å utsette embryo til luft. Deretter la embryo helt bosette. Vipp begeret for å la embryo falle til den ene siden. Samle disse embryo ved hjelp av en glass pipette og overføre til en ny 35 mm glass parabolen fylt med 1/3x ringer løsning.
    4. Vent i flere minutter til de fleste av chorions mister elastisitet helt. Fjern de resterende chorions fra embryo ved å forsiktig pipettering eggene. Fjern skadet embryo og ruge embryo i en 28,5 ° c inkubator.

3. kirurgisk Størrelsesreduksjon og gjenoppretting

  1. Forbered en ren 35 mm glass parabolen. Spre ca 0,5 mL av 2% metyl cellulose (i 1/3x ringer løsning, med fenol rødt for å visualisere) nær midten av bunnen av den større parabolen ved hjelp av en plast spatel. Tynt og jevnt spre metyl cellulose til en tykkelse på ca 0,5 mm.
  2. Hell ca 30 mL 1/3x ringer løsning på siden av fatet og la det spre seg på resten av fatet, dekker metyl cellulose.
  3. Plasser dechorionated embryo på 256-celle-1k-celle scenen på 2% metyl cellulose. Juster retningen på embryo på siden for å visualisere både celler og eggeplomme. (Figur 1)
  4. Chop ca 30%-40% av cellene fra blastoderm nær dyret Pol ved å kutte vinkelrett på dyret-vegetal aksen ved hjelp av wire loop (eller glass nål) (figur 1, topp paneler). Etter at du har fjernet cellene, trykker du forsiktig på endene sammen for å hjelpe de resterende cellene til å stikke tilbake. Innen minutter, bør de døde cellene slough av når fosteret begynner å gro.
  5. Lag et lite sår til eggeplomme nær vegetal Pol i stedet for "hakke" eggeplomme (figur 1 midtre panelene). Sår eggeplomme ved skår egget membranen med montert wire. Eggeplomme vil sive ut i noen minutter etter såret, og deretter såret vil helbrede (figur 1 bunn paneler).
  6. Når eggeplomme stopper oser ut, flytte embryo ved hjelp av en Pipet utenfor metyl cellulose i samme rett til å tillate dem å bedre komme seg.
  7. Gjenta trinn 3.4-3.6 for alle embryo. La fatet stabilt i 30 minutter mens embryo gjenopprette.
  8. Overfør embryo til en ny tallerken med fersk 1/3x ringer løsning og sette dem i 28,5 ° c inkubator for å tillate dem å helt gjenopprette.
    1. Valgfritt Hvis scenen av interesse er tidlig somite stadiet, kan embryo bli inkubert ved 20 ° c etter å ha blitt inkubert ved 28,5 ° c til skjoldet scenen, for å justere timing for eksperimentering og bildebehandling.

4. live Imaging av sebrafisk Somitogenesis

  1. Forbered 100 mL 1% agarose oppløsning ved å tilsette 1 g agarose til 100 mL egg vann, oppvarming til agarose er fullstendig oppløst. Avkjøl for 5-10 min. til en temperatur på 62-72 ° c.
  2. Forbered en montering for bildebehandling.
    Merk:     denne veiledningen er utviklet for bruk med et invertert vid felt mikroskop.
    1. Hell ~ 15 mL 1% agarose i en 100 mm x 15 mm plastikk Petri parabolen.
    2. Forsiktig plassere en rygg-Mount v1 mold mal5 på bunnen av Petri parabolen. Hold mold på bunnen ved hjelp av en vekt, for eksempel 15 mL rør med vann.
      Merk: Dette er så embryo er så nær bunnen av Petri parabolen som mulig, når du bruker en invertert mikroskop. Selv om embryo er montert sidelengs for somite Imaging, her rygglene Mount v15 er brukt siden det holder embryo bedre på tidlig somite etapper.
    3. La avkjøles til agarose er fullt befestet. Hell i ~ 30 mL egg vann med 0,01% tricaine, og forsiktig fjerne mugg ved forsiktig nysgjerrige av med pinsett.
  3. Mount embryo for somite Imaging
    1. Forbered 1% lav smelte Agarose i 1/3x ringer løsning (eller egg vann) og holde den ved 42 ° c. Vent til temperaturen kommer ned til 42 ° c.
    2. Under et disseksjon mikroskop plasserer du ett embryo per brønn. Pipetter ca. 1 μL av lav smelte Agarose i brønnen for å finjustere brønn størrelsen til størrelsen på de enkelte embryo som varierer i størrelse, spesielt mellom de med og uten størrelsesreduksjon.
    3. Raskt orientere embryo før Low smelte Agarose er befestet slik at embryo ansiktet helt sidelengs til parabolen. Etter montering embryo, forsiktig plassere dekselet slip i agarose montere å holde embryo på plass. Orienteringen er spesielt viktig for den langsiktige somite Imaging fordi embryo må være nøyaktig sideveis montert for alle somite grensene for å være tydelig avbildet på senere stadier.
    4. Senk vekk fra Monteringsområdet og manipulere en 25 mm x 25 mm deksel glass slik at det er 45 grader forskjøvet fra orienteringen av firkantet innrykk laget av mold. Skyv dekkglass over mold i denne orienteringen til hvert hjørne hviler på en annen side av mold.
      Merk: Selv om denne protokollen er for en invertert mikroskop, plassere et deksel glass på toppen av mold er fortsatt viktig slik at embryo ikke beveger seg under overføring til mikroskopet.
  4. Prosess for bilde somite formasjon
    1. Prewarm mikroskopet til 28 ° c i en inkubator bygget med papp boards og en kabinett varmer.
    2. Plasser Petri parabolen med montert embryo på mikroskopet scenen. Finn fosteret montert i øvre venstre brønn av agarose montere med lavere forstørrelse linse, og deretter bytte målet til 10x.
    3. Sett opp bilde anskaffelse.
      Merk: Denne instruksjonen er for lyse felt.
    4. Finn forutsetninger for lysstyrke, eksponeringstid og kondensator, slik at somite grensen kan ses tydelig. Bruk av z-stack-innstillinger angir det laveste og høyeste ønskede bilde planet. Angi total tid og tidsintervall. Finn og Registrer XY posisjoner av alle embryo montert slik at flere embryo kan timelapse avbildet på en gang.
  5. Mål lengdene av PSM og somites bruker Fiji16.

5. bilde av Neural tube mønstre

  1. Forbered 100 mL 1% agarose oppløsning ved å tilsette 1 g agarose til 100 mL egg vann, oppvarming til agarose er fullstendig oppløst. Avkjøl for 5-10 min til 62-72 ° c. Juster tricaine til 0,01%.
  2. Forbered et rygg feste for bildebehandling.
    Merk:     denne veiledningen er utviklet for bruk med et stående fluorescens mikroskop. For invertert mikroskop dekkglass bunn retter er nødvendig og montering orientering i trinn 3 er snudd.
    1. Hell i ~ 15 mL 1% agarose i en 100 mm x 15 mm plastikk Petri parabolen. Forsiktig flyte en rygglene montering v1 mold på overflaten av agarose for å unngå å innføre luftbobler. La avkjøles til agarose er fullt befestet.
    2. Forsiktig fjerne mold med tang eller en barberhøvel blad. Fyll fatet med egg vann med 0,01% tricaine og deksel til bruk.
  3. Mount embryo for neural tube Imaging.
    1. Tillat transgene eller injisert fluorescerende størrelse-redusert og kontroll embryo å utvikle til 20-25 somite scenen (omtrent 18-22 h etter befruktning). Embryo uttrykker en fluorescerende membran etikett (mem-mCherry, mem-mBFP1, eller mem-mCitrine) og en transgene reporter av nevrale rør mønstre (nkx 2.2: mem-gfp, dbx1b: gfpeller Olig2: dsred) brukes for bildebehandling.
    2. Erstatt egg vann medium i forberedt rygg feste med 0,01% tricaine arbeids løsning. Pipetter forsiktig i embryo for å bli avbildet i brønner på rygg braketten.
    3. Manipulere embryo i riktig retning slik at hodet vender fremover i braketten og halen peker mot baksiden med rygg delen vendt mot vannflaten.
    4. Orient fosteret slik at halen ligger flatt og ikke pekte nedover mot bunnen av fatet. Det er noen ganger nyttig å hvile den bakre delen av halen på siden hylle av montering godt å hindre halen fra synker og utilsiktet Imaging hindbrain. Gjenta for hvert embryo. Gjør visse med størrelse redusert embryo at de ikke faller dypt inn i brønnene for å bli avbildet.
    5. Senk vekk fra Monteringsområdet og manipulere en 25 mm x 25 mm deksel glass slik at det er 45 ° offset fra orienteringen av firkantet innrykk laget av mold. Skyv dekkglass over mold i denne orienteringen til hvert hjørne hviler på en annen side av mold.
    6. Drei dekkglass langsomt til det faller forsiktig på Monteringsområdet. Sjekk for å være sikker på at embryo er fortsatt montert i riktig posisjoner og orientering. Hvis for mye bevegelse forårsakes av dekkglass fall, Fjern forsiktig og gjenta monteringen fra trinn C.
  4. Bilde i 3-D utviklingsland ryggmargen.
    1. Forsiktig transportere fatet som inneholder montert embryo til konfokalmikroskopi mikroskop. For langsiktig Live Imaging, sørg for å bruke et inkubert mikroskop. Ellers lave temperaturer er utholdelig.
    2. Under brightfield belysning, Naviger til fosteret til bildet og midt i synsfeltet på den foretrukne fremre bakre posisjon. For å muliggjøre en detaljert sammenligning mellom embryo, må denne posisjonen på hvert embryo være konsekvent.
    3. Still inn bilde parametrene for å opphisse og fange signal fra de fluorescerende proteinene som blir avbildet. Parametre kan stilles for øye til å skape et ønsket bilde på den første prøven. Hvis du vil aktivere målings konsekvens, bruker du disse innstillingene på alle embryo i datasettet. Hvis mange z-stabler er nødvendig optimalisere innstillingene for hastighet.
    4. Bruk z-stack-innstillinger til å angi det laveste og høyeste ønskede bilde planet. For optimal bildekvalitet i z-stakken, sett z-oppløsningen til den høyeste som er optimal for blenderåpning innstillingen. Gode bilder kan genereres med 1 μm z-avstand.
  5. Analyser bildedata etter hvilken som helst foretrukket metode.
    Merk: I dette tilfellet ble analysen utført med egendefinerte MATLAB skript som gjør det mulig enkel segmentering av nevrale deler av et bilde og kvantifisering av tenkelig signal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Eggeplomme volumreduksjon er viktig for normal morfologi
Som nylig beskrevet i Almuedo-Castillo et al.17, kan størrelsesreduksjon av embryo oppnås uten å redusere eggeplomme volum. For å sammenligne med og uten eggeplomme volumreduksjon, utførte vi både to-trinns hakking (både Blastulastadiet og eggeplomme) og Blastulastadiet hakking (figur 2 og supplerende film 1). To-trinns hakket embryo viste tilsynelatende normal generelle morfologi i forhold til kontroll (dechorionation bare) embryo, annet enn størrelse forskjell, gjennom utviklingstrinn (se topp og midtre paneler i figur 2). På den annen side, Blastulastadiet-bare hakket embryo viste en særegen morfologi, spesielt på tidligere stadier. Under epiboly hadde embryo en innsnevret og innrykket utseende (se nederste panel for 70% epiboly i figur 2). På følgende somite Stadium, midtlinjen strukturer ble funnet å være flatet (dvs. DV lengde er relativt kortere enn ML lengde) på mange aksial nivåer (se bunn paneler for 8 og 20 somite i figur 2). På senere stadier, kroppen strukturer ved siden av eggeplomme, slik som mid-og hindbrain, og de første ~ 10 somites, fortsatt viste en relativt flat form, muligens på grunn av økt spenning fra relativt større eggeplomme.

Somite størrelsesreduksjon i størrelse redusert embryo
Somites er segmental strukturer som vises midlertidig under embryogenesis og gi opphav til ryggrad og skjelettmuskulatur. Fra presomitic mesoderm (PSM), somites dannes en etter en fra fremre til bakre retning i en periodisk måte (f. eks 25 min for sebrafisk, 2 h for mus) (Figur 3a). Vi utførte tid lapse Imaging av somite formasjon både for kontroll og hakkede embryo og målte størrelsen på de nyopprettede somites (Figur 3B). I både kontroll og hakket embryo ble størrelsen på somites som ble dannet ved senere stadier, funnet å være mindre sammenlignet med de fra tidligere stadier. Også gjennom hele somite formasjon stadier, hakket embryo hadde mindre somites enn de i kontroll embryo (Figur 3C).

Neural tube høyder er redusert etter størrelsesreduksjon
For å se effekten av embryo størrelsesreduksjon på neural tube størrelse, utførte vi våre to-trinns hakke teknikk på mem-mCherry injisert embryo og avbildet deres rygg snorer ved 20 hpf ved hjelp av vår konfokalmikroskopi Imaging system (Figur 4A, B). I dette datasettet ble nevrale rør høyder redusert etter størrelses reduksjonen med 12,4% ± 3,2%, målt manuelt ved hjelp av egendefinert bildeanalyse kode (Figur 4C). Samlet disse dataene viser at størrelsesreduksjon reduserer neural tube høyde. Denne teknikken kan brukes til å måle effekten av størrelsesreduksjon på nevrale mønstre.

Figure 1
Figur 1 : Størrelses reduksjons teknikk. Omtrent 30%-40% av cellene ble kuttet fra dyret stangen (topp paneler). Membranen rundt eggeplomme ble nøye såret slik at eggeplomme oozed ut (midtre paneler). For følgende noen minutter, eggeplomme oozed ut og deretter sårene på både blastoderm og eggeplomme helbredet opp (nederst paneler). Scale bar = 200 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 : Sammenligning mellom to metoder for størrelsesreduksjon. Kontroll embryo (Top paneler, topp embryo for 24 hpf og 30 hpf), størrelse redusert embryo med to-trinns hakking (Blastulastadiet og eggeplomme, midtre paneler, middels embryo for 24 hpf og 30 hpf) og størrelse redusert embryo med Blastulastadiet-bare hakking (bunn paneler, bunn embryo for 24 hpf og 30 hpf) sammenlignes langs utviklingstrinn. Merk at i Blastulastadiet-bare hakket embryo, er blastoderm volumet mye mindre i forhold til eggeplomme (ved 70% epiboly). Som et resultat har fosteret en uforholdsmessig flat form på somite stadier (dvs. DV-aksen er relativt kortere sammenlignet med AP-aksen i Blastulastadiet-bare hakkede embryo, sammenlignet med kontroll eller en to-trinns hakket en). Skaler ba = 200 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 : Størrelsesreduksjon reduserer lengden på somites. (A) skjematisk illustrasjon av somite formasjon. (B) Bright felt bilder av kontroll og hakket embryo over tid. Gule pilspisser angir den nyopprettede somite på hvert somite stadium. (C) Somite lengde (i fremre-bakre akse) målinger over tid for både kontroll og hakket embryo. Feilfelt representerer standardavvik. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4 : Størrelsesreduksjon reduserer høyden på nerve røret. (A-B) Eksempel bilder av normal størrelse (A) og størrelse redusert (B) TG (ptch2: Kaede) embryo som ble injisert i ett celle trinn med mem-mCherry mRNA. Scale bar = 20 μm. (C) neural tube Heights Hentet fra manuell segmentering av Neural tube i hver z-stack. Statistisk signifikante forskjeller er observert i gjennomsnittlig neural høyde når verdier sammenlignes med en ikke-sammenkoblet t-test (p = 0,0397). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Supplemental Movie 1
Tilleggs film 1: sammenligning mellom to-trinns hakking kontra Blastulastadiet hakking. Øverste rad = kontroll embryo, midtre rad = størrelse redusert embryo med to trinn hakke, nederste rad = størrelse redusert embryo med Blastulastadiet bare hakking. Filmer ble tatt hver 3 min for 12 h. Scale bar = 1 mm. Vennligst klikk her for å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Historisk blant virveldyr dyr, har størrelsesreduksjon blitt hovedsakelig utført ved hjelp amfibier embryo, ved å halverer embryo langs dyr vegetal aksen på et Blastulastadiet trinn12. Men det er i hovedsak to forskjeller mellom frosk og sebrafisk embryo når vi halvere embryo. Først på scenen når sebrafisk embryo blir tolerant av halverer (Blastulastadiet Stadium), arrangøren ligger i et begrenset område av Blastulastadiet margin18,19,20,21. Fordi man ikke kan fortelle posisjonen til arrangøren fra morfologi av embryo, tilfeldig kutte embryo langs dyret-vegetal aksen produserer dorsalized eller ventralized embryo. For det andre, i motsetning frosk embryo, sebrafisk embryo gå gjennom en prosess som kalles epiboly, der cellene beveger seg mot vegetal polet rundt en separert eggeplomme til den er helt omgitt av celler. Hvis bare en del av blastoderm er fjernet, færre celler gjenstår å sluker en eggeplomme av relativt større volum, og som et resultat, synes morfologi påvirket etter epiboly. Derfor bruker vi to-trinns hakking der vi hogge blastulae nær dyret Pol, for å unngå å kutte av arrangøren, og sår eggeplomme membranen, for å gjøre eggeplomme størrelse proporsjonal med Blastulastadiet.

I tillegg til to-trinns hakking, fant vi mediet der størrelses reduksjonen kirurgi er utført er avgjørende for gjenvinning av embryo etter operasjonen. Blant flere medier vi prøvde (egg vann, egg vann + albumin, Danieau buffer, L15, L15 + FBS, 1/3x ringer, 1x ringer), bare 1/3x ringer og 1x ringer gitt høye overlevelses rater; i andre medier, ikke embryo klarte å komme seg fra sårene.

En viktig feilsøking tips for lav overlevelse er å bruke sunne embryo fra friske og unge Foreldreomsorg fisk. Vi bemerket at selv når kontrollen ikke-størrelse redusert embryo viser nesten 100% overlevelse, når størrelsen reduseres, embryo fra eldre fisk har en tendens til å vise lavere overlevelse. Vær også oppmerksom på at overlevelsesraten har en tendens til å avta når størrelses reduksjonen kombineres med ekstra forstyrrelser, for eksempel morpholino injeksjon.

Enkelheten av størrelsesreduksjon teknikken beskrevet her tillater forskere å bruke denne teknikken uten spesialisert utstyr eller intensiv trening. Videre, siden størrelsen reduseres embryo forbli mindre til senere stadier av utvikling (når de begynner å spise, synes deres størrelse å ta opp med kontroll fisk), kan denne teknikken brukes til å studere skalering av mange vev og organer. Derfor gjør denne teknikken det mulig å kombinere størrelsesreduksjon og kvantitative in vivo Live Imaging å studere skalering og størrelses kontroll av ulike systemer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen konkurrerende eller økonomiske interesser.

Acknowledgments

Arbeidet ble støttet av PRESTO-programmet i Japan Science and Technology Agency (JPMJPR11AA) og en National Institutes of Health Grant (R01GM107733).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
60 mm PYREX Petri dish CORNING  3160-60
Agarose affymetrix 75817 For making a mount for live imaging
Agarose, low gelling temperature Type VII-A SIGMA-ALDRICH A0701-25G
CaCl2 EMD CX0130-1 For 1/3 Ringer's solution
CaSO4 For egg water
Cover slip (25 mm x 25 mm, Thickness 1) CORNING 2845-25
Disposable Spatula VWR  80081-188
Foam board ELMER'S 951300 For microscope incubator
Forcept (No 55) FST 11255-20
Glass pipette VWR 14673-043
HEPES SIGMA Life Science H4034 For 1/3 Ringer's solution
INCUKIT XL for Cabinet Incubators INCUBATOR Warehouse.com For microscope incubator
Instant sea salt Instant Ocean 138510 For egg water
KCl SIGMA-ALDRICH P4504 For 1/3 Ringer's solution
Methyl cellulose SIGMA-ALDRICH M0387-100G
NaCl SIGMA-ALDRICH S7653 For 1/3 Ringer's solution
Petri dish Falcon 351029 For making a mount for live imaging
Phenol red SIGMA Life Science P0290
Pipette pump BEL-ART PRODUCTS F37898
Pronase EMD Millipore Corp 53702-250KU
Tricaine-S (MS222) WESTERN CHEMICAL INC NC0135573
Ultra thin bright annealed 316L dia. 0.035 mm Stainless Steel Weaving Wires Sandra The wire we used was obtained ~20 years ago and we could not find exactly the same one. This product has the same material and diameter as the one we use.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cooke, J. Scale of body pattern adjusts to available cell number in amphibian embryos. Nature. 290, 775-778 (1981).
  2. Driesch, H. Entwicklungsmechanische Studien: I. Der Werthe der beiden ersten Furchungszellen in der Echinogdermenentwicklung. Experimentelle Erzeugung von Theil- und Doppelbildungen. Zeitschrift fur wissenschaftliche Zoologie. , (1892).
  3. Morgan, T. H. Half embryos and whole embryos from one of the first two blastomeres. Anatomischer Anzeiger. 10, 623-638 (1895).
  4. Ishimatsu, K., et al. Size-reduced embryos reveal a gradient scaling-based mechanism for zebrafish somite formation. Development. 145, (2018).
  5. Megason, S. G. In toto imaging of embryogenesis with confocal time-lapse microscopy. Methods in Molecular Biology. 546, 317-332 (2009).
  6. Graeden, E., Sive, H. Live imaging of the zebrafish embryonic brain by confocal microscopy. Journal of Visualized Experiments. (26), e1217 (2009).
  7. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments. (25), e1115 (2009).
  8. Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos. Journal of Visualized Experiments. (27), e1113 (2009).
  9. Sorlien, E. L., Witucki, M. A., Ogas, J. Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio. Journal of Visualized Experiments. (138), e56969 (2018).
  10. Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation. Journal of Visualized Experiments. (29), e1394 (2009).
  11. Mizuno, T., Shinya, M., Takeda, H. Cell and tissue transplantation in zebrafish embryos. Methods in Molecular Biology. 127, 15-28 (1999).
  12. Cooke, J. Control of somite number during morphogenesis of a vertebrate, Xenopus laevis. Nature. 254, 196-199 (1975).
  13. Inomata, H., Shibata, T., Haraguchi, T., Sasai, Y. Scaling of dorsal-ventral patterning by embryo size-dependent degradation of Spemann's organizer signals. Cell. 153, 1296-1311 (2013).
  14. Gomez, C., et al. Control of segment number in vertebrate embryos. Nature. 454, 335-339 (2008).
  15. Lauschke, V. M., Tsiairis, C. D., Francois, P., Aulehla, A. Scaling of embryonic patterning based on phase-gradient encoding. Nature. 493, 101-105 (2013).
  16. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
  17. Almuedo-Castillo, M., et al. Scale-invariant patterning by size-dependent inhibition of Nodal signalling. Nature Cell Biology. 20, 1032-1042 (2018).
  18. Koos, D. S., Ho, R. K. The nieuwkoid gene characterizes and mediates a Nieuwkoop-center-like activity in the zebrafish. Current Biology. 8, 1199-1206 (1998).
  19. Yamanaka, Y., et al. A novel homeobox gene, dharma, can induce the organizer in a non-cell-autonomous manner. Genes and Development. 12, 2345-2353 (1998).
  20. Jesuthasan, S., Stahle, U. Dynamic microtubules and specification of the zebrafish embryonic axis. Current Biology. 7, 31-42 (1997).
  21. Schier, A. F., Talbot, W. S. The zebrafish organizer. Current Opinion in Genetics and Development. 8, 464-471 (1998).

Tags

Utviklingsbiologi skalering størrelsesreduksjon sebrafisk embryologi mønstre robusthet utvikling organogenesen
Kirurgisk Størrelsesreduksjon av sebrafisk for studiet av embryonale mønster skalering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ishimatsu, K., Cha, A., Collins, Z.… More

Ishimatsu, K., Cha, A., Collins, Z. M., Megason, S. G. Surgical Size Reduction of Zebrafish for the Study of Embryonic Pattern Scaling. J. Vis. Exp. (147), e59434, doi:10.3791/59434 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter