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Developmental Biology

Réduction chirurgicale de la taille du Zébrafish pour l’étude de l’échelle des motifs embryonnaires

Published: May 3, 2019 doi: 10.3791/59434
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Systems Biology, Harvard Medical School

Summary

Ici, nous décrivons une méthode pour réduire la taille des embryons de zébrafish sans perturber les processus de développement normaux. Cette technique permet d’étudier la mise à l’échelle des patrons et la robustesse du développement contre le changement de taille.

Abstract

Dans le processus de développement, les embryons montrent une capacité remarquable à assortir leur modèle corporel à leur taille corporelle; leur proportion corporelle est maintenue même chez les embryons plus grands ou plus petits, dans certaines limites. Bien que ce phénomène de mise à l’échelle ait attiré l’attention depuis plus d’un siècle, la compréhension des mécanismes sous-jacents a été limitée, en partie en raison d’un manque de description quantitative de la dynamique du développement chez les embryons de tailles variées. Pour surmonter cette limitation, nous avons développé une nouvelle technique pour réduire chirurgicalement la taille des embryons de zébrafish, qui ont de grands avantages pour l’imagerie en direct in vivo. Nous démontrons qu’après l’élimination équilibrée des cellules et du jaune au stade blastula dans des étapes distinctes, les embryons peuvent rapidement se rétablir dans les bonnes conditions et se développer en embryons plus petits mais normalement normaux. Comme cette technique ne nécessite pas d’équipement spécial, elle est facilement adaptable et peut être utilisée pour étudier un large éventail de problèmes de dimensionnement, y compris la robustesse du modelage par médiation morphogénique.

Introduction

Les scientifiques ont longtemps connu que les embryons ont une capacité remarquable à former des proportions constantes du corps bien que la taille de l’embryon peut varier grandement à la fois dans les conditions naturelles et expérimentales1,2,3. Malgré des décennies d’études théoriques et expérimentales, cette robustesse à la variation de taille, appelée mise à l’échelle, et ses mécanismes sous-jacents demeurent inconnus dans de nombreux tissus et organes. Afin de capturer directement la dynamique du système en développement, nous avons établi une technique de réduction de taille reproductible et simple dans le poisson zèbre4, qui a le grand avantage dans l’imagerie en direct in vivo5.

Le zébrafish a servi de modèle d’animal vertébré pour étudier plusieurs disciplines de la biologie, y compris la biologie du développement. En particulier, le zébrafish est idéal pour l’imagerie en direct in vivo6 parce que 1) le développement peut se dérouler normalement à l’extérieur de la mère et de la coquille d’oeuf, et 2) les embryons sont transparents. En outre, les embryons peuvent résister à certaines fluctuations de température et d’environnement, ce qui leur permet d’être étudiés dans des conditions de laboratoire. En outre, en plus de la perturbation conventionnelle d’expression génique par morpholino et l’injection de mRNA7,8, les progrès récents dans la technologie crispr/Cas9 a fait la génétique inversée dans le poisson zèbre très efficace9. En outre, de nombreuses techniques classiques en embryologie, telles que la transplantation cellulaire ou la chirurgie tissulaire peuvent être appliquées4,10,11.

Des techniques de réduction de la taille ont été développées à l’origine chez les amphibiens et autres animaux non vertébrés12. Par exemple, dans Xenopus laevis, un autre modèle animal de vertébrés populaire, la bissection le long de l’axe animal-végétal au stade blastula peut produire des embryons réduits de taille12,13. Cependant, dans nos mains cette approche en une étape entraîne des embryons dorsalisés ou ventralisés dans le zébrafish, vraisemblablement parce que les déterminants dorsales sont distribués de manière inégale et on ne peut pas connaître leur localisation de la morphologie des embryons. Nous montrons ici une technique alternative de hachage en deux étapes pour le zébrafish qui produit des embryons normalement en développement mais plus petits. Avec cette technique, les cellules sont d’abord retirées du pôle animal, une région de cellules naïves manquant dans l’activité de l’organisateur. Pour équilibrer la quantité de jaune et de cellules, ce qui est important pour l’épibolie et la morphogenèse subséquente, le jaune est ensuite enlevé. Ici, nous détaillons ce protocole et fournissons deux exemples d’invariance de taille dans la formation de modèle; formation de somite et le modelage du tube neural ventrale. Combinée à l’imagerie quantitative, nous avons utilisé la technique de réduction de la taille pour examiner la façon dont les tailles des somites et du tube neural sont affectées par la taille des embryons réduits.

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Protocol

Toutes les procédures liées au poisson ont été effectuées avec l’approbation du Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) de la Harvard Medical School.

1. préparation des outils et des réactifs

  1. Faire une boucle de fil pour hacher les embryons
    1. Prendre 20 cm de fil d’acier inoxydable rigide et non corrosif d’un diamètre de 40 μm. Boucler le fil dans le capillaire en verre (diamètre extérieur de 1,0 mm, diamètre intérieur 0,5 mm, sans filament), en faisant une petite boucle au sommet (longueur de boucle de 1,0 mm)
    2. Mettre une petite goutte de vernis à ongles clair sur la pointe du capillaire de verre entre la boucle de fil pour le maintenir en place. Laissez sécher. Assurez-vous de ne pas obtenir de vernis à ongles sur la partie de la boucle, car il peut endommager les embryons.
    3. Fixez le capillaire en verre avec la boucle sur une baguette en bois (baguettes jetables en bambou de 9 po brisées en deux) à l’aide d’une bande de laboratoire. Laisser environ 2,5 cm du capillaire en verre s’étendant au-delà de la baguette, de sorte que la partie de l’outil ne plonge pas dans l’eau. Ajustez cette longueur à la préférence.
  2. Alternativement, faites une aiguille en verre pour hacher les embryons
    1. Pincez une extrémité de verre pipette Pasteur avec forceps, tout en tenant l’autre côté avec une main. Chauffer la partie fine de la pipette au-dessus d’une lampe à esprit ou d’un brûleur Bunsen.
    2. Tirez à la main la pipette en verre. La pipette idéale comme diamètre d’environ 30 μm et une courbe douce (rayon de courbure = environ 5 mm). Le diamètre et la courbure corrects sont obtenus avec la pratique et une certaine chance.
  3. Préparation de la cellulose méthylique
    1. La méthylcellulose est utilisée pour retenir les embryons lors du hachage. Faire 2% de solution de cellulose méthylique dans la solution de Ringer 1/3x (116 mM NaCl, 2,9 mM KCl, 1,8 mM CaCl2et 5 mm 4-(2-hydroxyethyl) -1-pipérazineethanesulfonic acid (HEPES; pH 7,2)). Agiter la poudre de méthyle cellulose en 1/3x la solution Ringer à 4 ° c pendant la nuit.
    2. En option, ajouter ~ 1,5 mL de phénol rouge (0,5% dans la solution stock DPBS) à 10 mL de solution de méthylcellulose à 2%, jusqu’à ce qu’il soit rouge, pour rendre la solution visible. Secouez-le jusqu’à ce que la couleur devienne uniforme.

2. préparation des embryons de Zébrafish pour la réduction de taille chirurgicale

  1. Collecter des embryons
    1. Placez un ou deux mâles et un ou deux poisson zèbre femelles dans une chambre d’accouplement remplie de beaucoup d’eau. Séparer les mâles et les femelles à l’aide d’un diviseur en plastique. Utilisez la ligne AB pour l’imagerie somite (section 4) et une ligne de reporter transgénique de la structure du tube neural (NKX 2.2: MEM-GFP, dbx1b: GFPou OLIG2: DsRed) pour l’imagerie du tube neural. Laissez-les dans la chambre pendant la nuit.
      Remarque: Le choix des adultes est important pour obtenir des oeufs qui survivent bien à la chirurgie. Typiquement, les jeunes femelles saines produisent des oeufs sains.
    2. Le lendemain matin, transférer la chambre dans de l’eau peu profonde et placer la chambre avec une légère inclinaison. Enlevez le diviseur de sorte que le poisson puisse s’accoupler.
    3. Recueillir les oeufs en versant dans une passoire à thé. Transférer les oeufs dans une boîte de Petri avec de l’eau d’oeuf (pour 20x eau d’oeuf, 6 g de sel de mer instantané, 1,5 g CaSO4 et 1 L H2O; utiliser à 1x). Pour une meilleure mise en scène, recueillir les oeufs juste après la ponte. Placer les embryons dans un incubateur de 28,5 ° c.
    4. Si nécessaire, injecter morpholino, ARNm, etc., à des stades de 1 à 4 cellules suivant un protocole commun7,8. Injecter l’ARNm pour l’étiquette de membrane fluorescente (MEM-mCherry, Mem-mBFP1, ou MEM-mcitrine) pour l’imagerie de tube neural (section 5).
  2. Déchorionate utilisant la pronase
    1. Autour du stade 128-Cell à 256-Cell, transférez des embryons sains vers un plat en verre de 35 mm rempli d’eau d’oeuf. Retirer autant d’eau d’oeuf que possible du plat.
    2. Ajouter 1 mL de pronase de 20 mg/mL. Agiter doucement les embryons en déplaçant la plaque et Pipetter doucement la solution vers le haut et vers le bas pour aider la déchorionation à l’aide d’une pipette en verre.
    3. Lorsque les chorion commencent à perdre de l’élasticité (habituellement 1-4 min après addition de pronase, selon la quantité d’oeufs et d’eau), ajouter autant d’eau d’oeuf que possible pour diluer la pronase. Évaluez la perte d’élasticité en touchant doucement le chorion à l’aide de forceps; le chorion devrait tenir la dent sans rebondir immédiatement en arrière. Transférer les oeufs à un autre plat avec de l’eau d’oeuf à l’aide d’une pipette en verre (à ce stade, la plupart des chorion ne sont pas cassés).
      1. Alternativement, versez délicatement les embryons du plat dans un grand bécher de verre de 400 mL rempli d’eau d’oeuf sans exposer les embryons à l’air. Ensuite, laissez les embryons s’installer complètement. Inclinez le bécher pour laisser tomber les embryons d’un côté. Collectez ces embryons à l’aide d’une pipette en verre et transférez-les dans un nouveau plat en verre de 35 mm rempli de la solution 1/3x Ringer.
    4. Attendez plusieurs minutes jusqu’à ce que la plupart des chorion perdent complètement l’élasticité. Retirer les chorion restants des embryons en pipetant doucement les oeufs. Enlever les embryons endommagés et incuber les embryons dans un incubateur de 28,5 ° c.

3. réduction et récupération de la taille chirurgicale

  1. Préparez un plat en verre de 35 mm propre. Étaler environ 0,5 mL de 2% de méthylcellulose (en 1/3x la solution de Ringer, avec du rouge de phénol pour aider à visualiser) près du centre du fond du plat plus grand à l’aide d’une spatule en plastique. Répartir finement et uniformément la cellulose méthylique à une épaisseur d’environ 0,5 mm.
  2. Verser environ 30 mL de solution 1/3x Ringer sur le côté du plat et laisser s’étaler sur le reste du plat, couvrant la cellulose méthylique.
  3. Placer les embryons déchorionés au stade 256-cellules-1K-cellules sur 2% de la cellulose méthylique. Ajustez l’orientation des embryons sur le côté pour visualiser à la fois les cellules et le jaune. (Figure 1)
  4. Hacher approximativement 30%-40% des cellules du blastoderme près du pôle animal en coupant perpendiculairement à l’axe animal-végétal à l’aide de la boucle métallique (ou de l’aiguille en verre) (figure 1, panneaux supérieurs). Après avoir enlevé les cellules, Tapotez doucement les extrémités ensemble pour aider les cellules restantes à coller en arrière. En quelques minutes, les cellules mortes devraient se départir lorsque l’embryon commence à guérir.
  5. Faire une petite blessure au jaune près du pôle végétal au lieu de «hacher» le jaune (figure 1 panneaux du milieu). Enroulez le jaune en entant la membrane de l’oeuf avec le fil monté. Le jaune se mettra à suer quelques minutes après avoir blessé, puis la plaie guérira (figure 1 panneaux inférieurs).
  6. Lorsque le jaune cesse de suer, déplacez l’embryon à l’aide d’un pipettoir à l’extérieur de la cellulose méthylique dans le même plat pour lui permettre de mieux se rétablir.
  7. Répétez les étapes 3.4 à 3.6 pour tous les embryons. Laisser le plat stable pendant 30 min pendant que les embryons récupèrent.
  8. Transférer les embryons dans un nouveau plat avec une solution fraîche 1/3x Ringer et les mettre en incubateur 28,5 ° c pour leur permettre de se rétablir complètement.
    1. Facultatif Si le stade d’intérêt est le stade de somite précoce, les embryons peuvent être incubés à 20 ° c après avoir été incubés à 28,5 ° c jusqu’à la phase de blindage, pour ajuster le timing pour l’expérimentation et l’imagerie.

4. imagerie en direct de la somitogenèse zebrafish

  1. Préparer 100 mL de solution d’d’agarose à 1% en ajoutant 1 g d’d’agarose à 100 mL d’eau d’oeuf, en chauffant jusqu’à ce que l’d’agarose soit complètement dissous. Laisser refroidir pendant 5-10 min à une température de 62-72 ° c.
  2. Préparez une monture pour l’imagerie.
    Remarque:     ce guide a été conçu pour être utilisé avec un microscope à large champ inversé.
    1. Verser ~ 15 mL de 1% d’d’agarose dans une boîte de Petri en plastique de 100 mm x 15 mm.
    2. Placez délicatement un modèle de moule à monture dorsale v15 sur le fond de la boîte de Petri. Gardez le moule sur le fond en utilisant un poids, comme le tube de 15 mL avec de l’eau.
      Remarque: C’est ainsi que les embryons sont aussi proches du fond de la boîte de Petri que possible, lors de l’utilisation d’un microscope inversé. Bien que les embryons soient montés latéralement pour l’imagerie somite, ici le Mont dorsal v15 est utilisé car il maintient les embryons mieux aux stades somites précoces.
    3. Laisser refroidir jusqu’à ce que l’d’agarose soit complètement solidifiée. Verser dans ~ 30 mL d’eau d’oeuf avec 0,01% de tricaïne, et retirer délicatement le moule en se déjouant doucement avec la pince.
  3. Monter des embryons pour l’imagerie somite
    1. Préparez 1% d’agarose à faible fusion dans la solution 1/3x Ringer (ou l’eau d’oeuf) et conservez-le à 42 ° c. Attendre jusqu’à ce que la température descend à 42 ° c.
    2. Sous un microscope de dissection, placer un embryon par puits. Pipetter approximativement 1 μL d’agarose à faible fusion dans le puits pour ajuster finement la taille du puits à la taille des embryons individuels qui varient en taille, en particulier entre ceux avec et sans réduction de la taille.
    3. Orientez rapidement les embryons avant que l’agarose à faible fusion ne se solidifie pour que les embryons soient complètement latéralement sur le plat. Après avoir monté les embryons, placez délicatement le feuillet de couverture dans le support d’d’agarose pour maintenir les embryons en place. L’orientation est particulièrement importante pour l’imagerie somite à long terme, car les embryons doivent être montés latéralement pour que toutes les limites somitiques soient clairement imagées à des stades ultérieurs.
    4. Submerger loin de la zone de montage et manipuler un verre de couverture de 25 mm x 25 mm de telle sorte qu’il soit 45 degrés de décalage de l’orientation du retrait carré fait par le moule. Glissez la bavette sur le moule dans cette orientation jusqu’à ce que chaque coin se repose d’un côté différent du moule.
      Remarque: Bien que ce protocole soit pour un microscope inversé, placer un verre de couverture sur le dessus du moule est encore important de sorte que les embryons ne bougent pas pendant le transfert au microscope.
  4. Processus de formation d’imagerie somite
    1. Préchauffer le microscope à 28 ° c dans un incubateur construit avec des planches de foamcore et un radiateur d’armoire.
    2. Placer la boîte de Petri avec les embryons montés sur l’étape du microscope. Trouvez l’embryon monté dans le puits supérieur gauche de la monture d’d’agarose avec un objectif de grossissement inférieur, puis basculez l’objectif sur 10x.
    3. Configurer l’acquisition d’images.
      Remarque: Cette instruction est pour le champ lumineux.
    4. Trouvez les conditions pour la puissance lumineuse, le temps d’exposition et le condenseur afin que la limite somite puisse être clairement visible. L’utilisation des paramètres z-Stack a défini le plan d’imagerie désiré le plus bas et le plus élevé. Réglez l’intervalle de temps et de temps total. Trouver et enregistrer les positions XY de tous les embryons montés de sorte que plusieurs embryons peuvent être imagés timelapse à la fois.
  5. Mesurez la longueur des PSM et des somites en utilisant Fidji16.

5. imagerie du modelage du tube neural

  1. Préparer 100 mL de solution d’d’agarose à 1% en ajoutant 1 g d’d’agarose à 100 mL d’eau d’oeuf, en chauffant jusqu’à ce que l’d’agarose soit complètement dissous. Laisser refroidir pour 5-10 min à 62-72 ° c. Ajustez la tricaïne à 0,01%.
  2. Préparez une monture dorsale pour l’imagerie.
    Remarque:     ce guide est conçu pour être utilisé avec un microscope à fluorescence vertical. Pour les microscopes inversés les plats de fond de lamelle sont nécessaires et l’orientation de montage à l’étape 3 est retournée.
    1. Verser ~ 15 mL de 1% d’d’agarose dans une boîte de Petri en plastique de 100 mm x 15 mm. Flottez doucement un moule de monture dorsale v1 sur la surface de l’d’agarose pour éviter d’introduire des bulles d’air. Laisser refroidir jusqu’à ce que l’d’agarose soit complètement solidifiée.
    2. Retirez délicatement le moule avec une pince ou une lame de rasoir. Remplissez le plat avec de l’eau d’oeuf avec 0,01% tricaïne et couvrez jusqu’à utilisation.
  3. Montez des embryons pour l’imagerie des tubes neuronaux.
    1. Permettre aux embryons transgéniques ou injectés de réduire la taille et de contrôler l’embryon jusqu’au stade somite 20-25 (environ 18-22 h après la fécondation). Les embryons exprimant une étiquette de membrane fluorescente (MEM-mCherry, MEM-mBFP1ou MEM-mcitrine) et un reporter transgénique de la structure du tube neural (NKX 2.2: MEM-GFP, dbx1b: GFP, ou OLIG2: DsRed) sont utilisés pour l’imagerie.
    2. Remplacer le milieu d’eau d’oeuf dans le support dorsal préparé avec 0,01% de solution de travail tricaïque. Pipetter doucement dans les embryons pour être imagé dans les puits de la monture dorsale.
    3. Manipuler les embryons dans l’orientation correcte de telle sorte que la tête soit orientée vers l’avant dans le support et que la queue pointe vers l’arrière avec la partie dorsale orientée vers la surface de l’eau.
    4. Orienter l’embryon de telle sorte que la queue soit allongée et non pointée vers le bas du plat. Il est parfois utile de reposer la partie postérieure de la queue sur le rebord latéral du puits de montage pour empêcher la queue de couler et d’imagerie par inadvertance le cerveau postérieur. Répétez pour chaque embryon. Assurez-vous avec des embryons réduits de taille qu’ils ne tombent pas profondément dans les puits pour être imagés.
    5. Submerger loin de la zone de montage et manipuler un verre de 25 mm x 25 mm de couverture de telle sorte qu’il est 45 ° offset de l’orientation du retrait carré fait par le moule. Glissez la bavette sur le moule dans cette orientation jusqu’à ce que chaque coin se repose d’un côté différent du moule.
    6. Tournez doucement le couvre-verre jusqu’à ce qu’il tombe doucement sur la zone de montage. Vérifiez que les embryons sont toujours montés dans les positions et les orientations correctes. Si trop de mouvement est provoqué par la chute de la vitre, enlevez doucement et répétez le montage de l’étape C.
  4. Image en 3-D la moelle épinière en développement.
    1. Transporter doucement le plat contenant des embryons montés au microscope confocale. Pour l’imagerie en direct à long terme, assurez-vous d’utiliser un microscope incubé. Sinon, les basses températures sont tolérables.
    2. Sous l’illumination de fond clair, naviguez vers l’embryon à l’image et centrez le champ de vue sur la position antérieure-postérieure préférée. Pour permettre une comparaison détaillée entre les embryons, cette position sur chaque embryon doit être cohérente.
    3. Réglez les paramètres d’imagerie pour exciter et capturer le signal des protéines fluorescentes qui sont imagées. Les paramètres peuvent être réglés à l’œil pour créer une image souhaitée sur l’échantillon initial. Pour activer la cohérence des mesures, appliquez ces paramètres à tous les embryons du jeu de données. Si de nombreuses piles z sont nécessaires, optimisez les paramètres de vitesse.
    4. À l’aide des paramètres z-Stack, définissez le plan d’imagerie désiré le plus bas et le plus élevé. Pour une qualité d’image optimale dans la pile z, réglez la résolution z sur la valeur la plus élevée qui est optimale pour le réglage de l’ouverture. De bonnes images peuvent être générées avec un espacement z de 1 μM.
  5. Analysez les données d’imagerie par n’importe quelle méthode préférée.
    Remarque: Dans ce cas, l’analyse a été effectuée avec des scripts MATLAB personnalisés qui permettent une segmentation simple des portions neuronales d’une image et la quantification du signal d’imagerie.

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Representative Results

La réduction du volume du jaune est importante pour la morphologie normale
Comme nous l’avons récemment décrit dans Almuedo-Castillo et al.17, la réduction de la taille des embryons peut être obtenue sans réduire le volume du jaune. Pour comparer avec et sans réduction du volume du jaune, nous avons effectué deux étapes de hachage (blastula et jaune) et de hachage blastula seulement (figure 2 et film supplémentaire 1). Les embryons hachés en deux étapes ont montré une morphologie globale apparemment normale par rapport aux embryons témoins (déchorionation seulement), autres que la différence de taille, tout au long des stades de développement (voir les panneaux supérieurs et intermédiaires dans la figure 2). D’autre part, les embryons hachés blastula seulement ont montré une morphologie particulière, surtout à des stades antérieurs. Pendant l’épibolie, les embryons avaient une apparence constrictée et en retrait (voir le panneau inférieur pour 70% d’épibolie dans la figure 2). Au stade somite suivant, on a constaté que les structures intermédiaires étaient aplaties (c.-à-d. que la longueur du DV est relativement plus courte que la longueur de ML) à de nombreux niveaux axiaux (voir les panneaux inférieurs pour 8 et 20 somites dans la figure 2). À des stades plus tardifs, les structures du corps adjacentes au jaune, comme le cerveau moyen et postérieur, et les premières ~ 10 somites, ont encore montré une forme relativement aplatie, peut-être en raison de la tension accrue du jaune relativement plus grand.

Réduction de la taille de la somite des embryons réduits
Les somites sont des structures segmentaires qui apparaissent transitoirement pendant l’embryogenèse et donnent naissance à des vertèbres et des muscles squelettiques. Du mésoderme presomitique (PSM), les somites se forment une à une de la direction antérieure à postérieure de façon périodique (par exemple 25 min pour le zébrafish, 2 h pour les souris) (figure 3a). Nous avons procédé à l’imagerie par laps de temps de la formation de somite à la fois pour le contrôle et les embryons hachés et mesuré la taille de la plupart des somites nouvellement formés (figure 3B). Dans les embryons témoins et hachés, les tailles des somites qui ont été formées à des stades ultérieurs se sont trouvées plus petites comparativement à celles des stades antérieurs. En outre, tout au long des stades de formation des somites, les embryons hachés avaient des somites plus petits que ceux des embryons témoins (figure 3C).

Les hauteurs du tube neural sont réduites après réduction de la taille
Pour voir l’effet de la réduction de la taille des embryons sur la taille du tube neural, nous avons effectué notre technique de hachage en deux étapes sur des embryons mCherry injectés et nous avons imagé leurs cordons spinaux à 20 HPF en utilisant notre système d’imagerie confocale (figure 4A, B). Dans ce jeu de données, les hauteurs des tubes neuronaux ont été réduites après réduction de la taille de 12,4% ± 3,2%, mesurée manuellement à l’aide d’un code d’analyse d’image personnalisé (figure 4C). Prises ensemble, ces données montrent que la réduction de la taille réduit la hauteur du tube neural. Cette technique peut être utilisée pour mesurer les effets de la réduction de taille sur la structuration neuronale.

Figure 1
Figure 1 : Technique de réductionde la taille. Environ 30% à 40% des cellules ont été coupées du pôle animal (panneaux supérieurs). La membrane entourant le jaune a été soigneusement blessée de sorte que le jaune s’est exsudé (panneaux du milieu). Pour les quelques minutes suivantes, le jaune s’est sué et les plaies sur le blastoderme et le jaune ont guéri (panneaux inférieurs). Barre d’échelle = 200 μm. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
La figure 2 : Comparaison entre deux méthodes de réduction de la taille. Les embryons témoins (panneaux supérieurs, embryons supérieurs pour 24 HPF et 30 HPF), les embryons de taille réduite à hacher en deux étapes (blastula et jaune, panneaux du milieu, embryons intermédiaires pour 24 HPF et 30 HPF) et les embryons de taille réduite avec hachage blastula uniquement (panneaux inférieurs, embryons inférieurs pour 24 HPF et 30 HPF) sont comparées le long des stades de développement. Notez que dans les embryons hachés blastula seulement, le volume de blastoderme est beaucoup plus petit comparé au jaune (à 70% épiboly). En conséquence, l’embryon a une forme disproportionnée aplatie à des stades somites (c.-à-d., l’axe DV est relativement plus court comparé à l’axe AP dans les embryons hachés blastula seulement, par rapport à la commande ou à deux étapes hachées un). Echelle BA = 200 μm. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : Réduction de la taille réduit la longueur des somites. A) illustration schématique de la formation de somites. (B) champ lumineux images de contrôle et d’embryons hachés au fil du temps. Les pointes de flèches jaunes indiquent la somite la plus récemment formée à chaque stade somite. C) les mesures de la longueur de la somite (dans l’axe antérieur-postérieur) au fil du temps pour les embryons témoins et hachés. Les barres d’erreur représentent l’écart type. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4 : La réduction de la taille réduit la hauteur du tube neural. (A-B) Exemples d’images de taille normale (A) et d’embryons réduits (B) TG (ptch2: Kaede) qui ont été injectés au stade de la cellule unique avec l’ARNm MEM-mCherry. Barre d’échelle = 20 μM. (C) hauteurs du tube neural extraites de la segmentation manuelle du tube neural dans chaque pile z. Des différences statistiquement significatives sont observées dans la hauteur moyenne neuronale lorsque les valeurs sont comparées à l’aide d’un test t non apparié (p = 0,0397). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Supplemental Movie 1
Film supplémentaire 1: comparaison entre le hachage en deux étapes et le hachage blastula uniquement. Rang supérieur = embryons de contrôle, rangée du milieu = taille des embryons réduits avec deux hachures, rangée inférieure = taille des embryons réduits avec blastula seulement hacher. Les films ont été pris toutes les 3 min pendant 12 h. barre d’échelle = 1 mm. s’il vous plaît cliquez ici pour voir cette vidéo. (Cliquez avec le bouton droit de la souris pour télécharger.)

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Discussion

Historiquement, parmi les animaux vertébrés, la réduction de la taille a été principalement réalisée à l’aide d’embryons d’amphibiens, en bisayant les embryons le long de l’axe animal-végétal à une phase blastula12. Cependant, il y a principalement deux différences entre les embryons de grenouille et de zébrafish lorsque nous bisect embryons. Premièrement, au stade où les embryons de zébrafish deviennent tolérants au bisou (stade blastula), l’organisateur est situé dans une zone restreinte de la marge de blastula18,19,20,21. Parce qu’on ne peut pas dire la position de l’organisateur de la morphologie des embryons, la découpe aléatoire de l’embryon le long de l’axe animal-végétal produit des embryons dorsalisés ou ventralisés. Deuxièmement, contrairement aux embryons de grenouilles, les embryons de zébrafish passent par un processus appelé épiboly, où les cellules se déplacent vers le pôle végétal autour d’un jaune séparé jusqu’à ce qu’elles soient complètement entourées de cellules. Si seulement une partie du blastoderme est enlevée, moins de cellules restent pour engloutir un jaune de volume relativement plus grand, et par conséquent, la morphologie apparaît affectée après l’épibolie. Par conséquent, nous employons le hachage en deux étapes dans lequel nous hachons les blastulas près du pôle animal, pour éviter de couper l’organisateur, et la plaie la membrane jaune, pour rendre la taille du jaune proportionnelle à la blastula.

En plus de la coupe en deux étapes, nous avons trouvé le milieu dans lequel la chirurgie de réduction de la taille est effectuée est essentielle pour la récupération des embryons suite à la chirurgie. Parmi plusieurs médias, nous avons essayé (eau d’oeuf, oeuf eau + albumine, tampon DANIEAU, L15, L15 + FBS, 1/3x Ringer, 1x Ringer), seulement 1/3x Ringer et 1x Ringer a donné des taux de survie élevés; dans d’autres médias, les embryons n’ont pas réussi à se rétablir des plaies.

Une importante astuce de dépannage pour un faible taux de survie consiste à utiliser des embryons sains provenant de poissons parentaux sains et jeunes. Nous avons noté que même lorsque le contrôle des embryons de non-taille réduit montrent presque 100% taux de survie, lorsque la taille réduite, les embryons de poissons plus âgés tendent à montrer un taux de survie plus faible. Notez également que le taux de survie tend à diminuer lorsque la réduction de la taille est combinée avec des perturbations supplémentaires, telles que l’injection de morpholino.

La simplicité de la technique de réduction de la taille décrite ici permet aux chercheurs d’appliquer cette technique sans équipement spécialisé ni formation intensive. De plus, puisque la taille des embryons réduits reste plus petite jusqu’à des stades ultérieurs de développement (une fois qu’ils commencent à manger, leur taille semble rattraper le poisson témoin), cette technique peut être appliquée à l’étude de l’échelle de nombreux tissus et organes. Par conséquent, cette technique permet de combiner la réduction de la taille et l’imagerie en direct quantitative in vivo pour étudier la mise à l’échelle et le contrôle de la taille de divers systèmes.

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Disclosures

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrentiel ou financier.

Acknowledgments

Les travaux ont été soutenus par le programme PRESTO de l’Agence japonaise pour la science et la technologie (JPMJPR11AA) et un don des instituts nationaux de santé (R01GM107733).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
60 mm PYREX Petri dish CORNING  3160-60
Agarose affymetrix 75817 For making a mount for live imaging
Agarose, low gelling temperature Type VII-A SIGMA-ALDRICH A0701-25G
CaCl2 EMD CX0130-1 For 1/3 Ringer's solution
CaSO4 For egg water
Cover slip (25 mm x 25 mm, Thickness 1) CORNING 2845-25
Disposable Spatula VWR  80081-188
Foam board ELMER'S 951300 For microscope incubator
Forcept (No 55) FST 11255-20
Glass pipette VWR 14673-043
HEPES SIGMA Life Science H4034 For 1/3 Ringer's solution
INCUKIT XL for Cabinet Incubators INCUBATOR Warehouse.com For microscope incubator
Instant sea salt Instant Ocean 138510 For egg water
KCl SIGMA-ALDRICH P4504 For 1/3 Ringer's solution
Methyl cellulose SIGMA-ALDRICH M0387-100G
NaCl SIGMA-ALDRICH S7653 For 1/3 Ringer's solution
Petri dish Falcon 351029 For making a mount for live imaging
Phenol red SIGMA Life Science P0290
Pipette pump BEL-ART PRODUCTS F37898
Pronase EMD Millipore Corp 53702-250KU
Tricaine-S (MS222) WESTERN CHEMICAL INC NC0135573
Ultra thin bright annealed 316L dia. 0.035 mm Stainless Steel Weaving Wires Sandra The wire we used was obtained ~20 years ago and we could not find exactly the same one. This product has the same material and diameter as the one we use.

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References

  1. Cooke, J. Scale of body pattern adjusts to available cell number in amphibian embryos. Nature. 290, 775-778 (1981).
  2. Driesch, H. Entwicklungsmechanische Studien: I. Der Werthe der beiden ersten Furchungszellen in der Echinogdermenentwicklung. Experimentelle Erzeugung von Theil- und Doppelbildungen. Zeitschrift fur wissenschaftliche Zoologie. , (1892).
  3. Morgan, T. H. Half embryos and whole embryos from one of the first two blastomeres. Anatomischer Anzeiger. 10, 623-638 (1895).
  4. Ishimatsu, K., et al. Size-reduced embryos reveal a gradient scaling-based mechanism for zebrafish somite formation. Development. 145, (2018).
  5. Megason, S. G. In toto imaging of embryogenesis with confocal time-lapse microscopy. Methods in Molecular Biology. 546, 317-332 (2009).
  6. Graeden, E., Sive, H. Live imaging of the zebrafish embryonic brain by confocal microscopy. Journal of Visualized Experiments. (26), e1217 (2009).
  7. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments. (25), e1115 (2009).
  8. Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos. Journal of Visualized Experiments. (27), e1113 (2009).
  9. Sorlien, E. L., Witucki, M. A., Ogas, J. Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio. Journal of Visualized Experiments. (138), e56969 (2018).
  10. Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation. Journal of Visualized Experiments. (29), e1394 (2009).
  11. Mizuno, T., Shinya, M., Takeda, H. Cell and tissue transplantation in zebrafish embryos. Methods in Molecular Biology. 127, 15-28 (1999).
  12. Cooke, J. Control of somite number during morphogenesis of a vertebrate, Xenopus laevis. Nature. 254, 196-199 (1975).
  13. Inomata, H., Shibata, T., Haraguchi, T., Sasai, Y. Scaling of dorsal-ventral patterning by embryo size-dependent degradation of Spemann's organizer signals. Cell. 153, 1296-1311 (2013).
  14. Gomez, C., et al. Control of segment number in vertebrate embryos. Nature. 454, 335-339 (2008).
  15. Lauschke, V. M., Tsiairis, C. D., Francois, P., Aulehla, A. Scaling of embryonic patterning based on phase-gradient encoding. Nature. 493, 101-105 (2013).
  16. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
  17. Almuedo-Castillo, M., et al. Scale-invariant patterning by size-dependent inhibition of Nodal signalling. Nature Cell Biology. 20, 1032-1042 (2018).
  18. Koos, D. S., Ho, R. K. The nieuwkoid gene characterizes and mediates a Nieuwkoop-center-like activity in the zebrafish. Current Biology. 8, 1199-1206 (1998).
  19. Yamanaka, Y., et al. A novel homeobox gene, dharma, can induce the organizer in a non-cell-autonomous manner. Genes and Development. 12, 2345-2353 (1998).
  20. Jesuthasan, S., Stahle, U. Dynamic microtubules and specification of the zebrafish embryonic axis. Current Biology. 7, 31-42 (1997).
  21. Schier, A. F., Talbot, W. S. The zebrafish organizer. Current Opinion in Genetics and Development. 8, 464-471 (1998).

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Biologie du développement numéro 147 échelle réduction de la taille zébrafish embryologie structuration robustesse développement organogenèse
Réduction chirurgicale de la taille du Zébrafish pour l’étude de l’échelle des motifs embryonnaires
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Ishimatsu, K., Cha, A., Collins, Z.… More

Ishimatsu, K., Cha, A., Collins, Z. M., Megason, S. G. Surgical Size Reduction of Zebrafish for the Study of Embryonic Pattern Scaling. J. Vis. Exp. (147), e59434, doi:10.3791/59434 (2019).

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