Summary
Burada, biz normal gelişimsel süreçleri bozmadan zebra balığı embriyo boyutunu azaltmak için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu teknik, boyut değişikliklere karşı desen ölçekleme ve gelişimsel sağlamlık etüdünü sağlar.
Abstract
Gelişimsel süreçte, embriyolar vücut boyutlarına karşı vücut desenlerini eşleştirmek için dikkat çekici bir yetenek sergiler; vücut orantısı, belirli sınırlar içinde daha büyük veya daha küçük olan embriyolarda bile korunur. Ölçekleme bu fenomen bir yüzyıl boyunca dikkat çekti rağmen, temel mekanizmaları anlamak, çeşitli boyutlarda embriyo gelişimsel dinamiklerin nicel açıklaması eksikliği nedeniyle sınırlı olmuştur. Bu sınırlamanın üstesinden gelmek için, in vivo canlı görüntüleme için büyük avantajlara sahip olan zebra balığı embriyolarının boyutunu cerrahi olarak azaltmak için yeni bir teknik geliştirdik. Biz ayrı adımlarla Blastula aşamasında hücrelerin ve sarısı dengeli kaldırılması sonra, embriyo hızlı bir şekilde doğru koşullar altında kurtarabilirsiniz ve daha küçük ama başka normal embriyolar içine geliştirmek olduğunu göstermektedir. Bu teknik özel ekipman gerektirmeyen bu yana, kolayca uyarlanabilir ve morphogen aracılı desen sağlamlık da dahil olmak üzere, ölçekleme sorunları geniş bir yelpazede çalışmak için kullanılabilir.
Introduction
Bilim adamları uzun embriyo boyutu büyük ölçüde hem doğal ve deneysel koşullar altında değişebilir rağmen embriyoların sürekli vücut oranlarını oluşturmak için olağanüstü bir yeteneği var bilinen1,2,3. Onlarca yıl süren teorik ve deneysel çalışmalara rağmen, boyutsal varyasyona bu sağlamlık, ölçeklenme ve altta yatan mekanizmalar birçok doku ve organda bilinmiyor. Gelişmekte olan sistemin dinamiklerini doğrudan yakalamak için, zebra balığı4' te, in vivo canlı görüntüleme5' te büyük bir avantaja sahip olan tekrarlanabilir ve basit bir boyut azaltma tekniği kurduk.
Zebrafish, gelişim biyolojisi de dahil olmak üzere birden fazla biyoloji disiplininin çalışması için bir model vertebrat hayvanı olarak görev yapmıştır. Özellikle, zebra balığı in vivo canlı görüntüleme için idealdir6 çünkü 1) geliştirme normal anne ve yumurta kabuğu dışında devam edebilir, ve 2) embriyo saydamdır. Buna ek olarak, embriyolar bazı sıcaklık ve çevresel dalgalanmalara dayanabilir, bu da laboratuar koşullarında incelenmesini sağlar. Ayrıca, morpholino ve mRNA enjeksiyon7,8, Crispr/Cas9 teknolojisindeki son gelişmeler tarafından konvansiyonel gen ifadesi pertürasyon ek olarak yüksek verimli zebra balığı ters genetik yaptı9. Ayrıca, Embriyoloji birçok klasik teknikleri, hücre transplantasyonu veya doku cerrahisi gibi uygulanabilir4,10,11.
Boyut azaltma teknikleri ilk olarak amfitbiya ve diğer omurga dışı hayvanlar12' de geliştirilmiştir. Örneğin, Xenopus laevis, başka bir popüler omurgası hayvan modeli, blastula aşamasında hayvan-bitkisel eksen boyunca şekilde bölünmüş boyutu düşük embriyo üretebilir12,13. Ancak, bizim elimizde bu tek adımlı yaklaşım zebrafish içinde dorsalized veya ventriselleştirilmiş embriyolar, muhtemelen dorsal belirleyicileri düzensiz dağıtılır ve bir embriyolar morfolojisi kendi yerelleştirme bilmiyorum çünkü. Burada, normalde gelişmekte olan ama daha küçük embriyolar üreten zebra balığı için alternatif iki adımlı bir kesme tekniği gösterilmektedir. Bu teknik ile, hücreler ilk hayvan direği, organizatördeki aktivite eksikliği naif hücrelerin bir bölge kaldırılır. Epiboly ve sonraki morfojenler için önemli olan sarısı ve hücrelerin miktarını dengelemek için, sarısı daha sonra kaldırılır. Burada, bu protokolü ayrıntılarıyla ve desen oluşumunda boyut invaryans iki örnek sağlamak; Somit oluşumu ve ventral nöral tüp deseni. Nicel görüntüleme ile birlikte, Boyut azaltma tekniği, Somitlerin ve nöral tüp boyutlarının azaltılmış embriyolar boyutu nasıl etkilendiğini incelemek için kullandık.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Balık ile ilgili tüm prosedürler Harvard Tıp fakültesinde kurumsal hayvan bakımı ve kullanım Komitesi 'nin (ıAVUC) onayı ile gerçekleştirilmiştir.
1. alet ve reaktif hazırlama
-
Embriyo kesmek için bir tel döngü olun
- 40 μm çapı ile sert ve korozif olmayan 20 cm 'lik paslanmaz çelik tel alın. Kabloyu cam kapiller (1,0 mm dış çapı, 0,5 mm iç çapı, hiçbir filament), üst kısmında küçük bir döngü yapma (döngü uzunluğu 1,0 mm) içine döngü
- Yerinde tutmak için tel döngü arasında cam kapiller ucunu üzerine açık oje biraz damlacık koyun. Kurumaya bırakın. Eğer embriyo zarar verebilir, döngü kısmı üzerine herhangi bir oje almak için emin olun.
- Ahşap bir çubuk üzerine döngü ile cam kapiller takın (9 "Bambu tek kullanımlık Chopsticks yarısında kırık) laboratuar bandı kullanarak. Çubukların ötesine uzanan cam kapiller yaklaşık 2,5 cm bırakın, böylece aracın çubuk parçası suya daldırma değil. Bu uzunluğu tercihe göre ayarlayın.
-
Alternatif olarak, embriyoları kesmek için cam iğne yapın
- Diğer tarafı bir el ile tutarken, camının bir ucunu forseps ile Pasteur pipet ile tutam. Pipetin ince kısmını bir ruh lambası veya Bunsen brülörü üzerinde ısıtın.
- Cam Pipet el çekin. Yaklaşık 30 μm çapı ve nazik eğrisi (eğrilik yarıçapı = yaklaşık 5 mm) olarak ideal pipet. Uygun çap ve eğrilik uygulama ve bazı şans ile elde edilir.
-
Metil selüloz hazırlayın
- Metil selüloz, embriyoları doğrama sırasında tutmak için kullanılır. 1/3x ringer çözeltisi (116 mM NaCl, 2,9 mM KCl, 1,8 mM CaCl2ve 5 mm 4-(2-hidroksiilil) -1-piperazineethanesulfonik ASIT (HEPES; pH 7,2))% 2 metil selüloz solüsyonu yapın. 1/3x ringer çözeltisi içinde 4 °C gece içinde metil selüloz tozu sallayın.
- İsteğe bağlı olarak, eklemek ~ 1,5 mL fenol kırmızı (0,5% DPBS stok çözüm) için 10 mL 2% metil selüloz çözeltisi, kırmızı kadar, çözüm görünür hale getirmek için. Renk üniforma hale gelene kadar sallayın.
2. cerrahi Boyut azaltma için zebrafish embriyo hazırlanması
-
Embriyo topla
- Bir veya iki erkek ve bir veya iki kadın zebra balığı bir çiftleşme odasına bir sürü su ile dolu yerleştirin. Erkek ve dişileri plastik bölücü kullanarak ayırın. Nöral tüp görüntüleme için hücre gruplarının görüntüleme (Bölüm 4) ve nöral tüp desenleme (nkx 2.2: mem-Gfp, dbx1b: Gfp, veya Olig2: DSRed) transjenik muhabir hattı için AB hattı kullanın. Onları bir gecede odaya bırak.
Not: Yetişkin seçimi cerrahi iyi hayatta yumurta elde etmek için önemlidir. Tipik olarak, genç sağlıklı kadınlar sağlıklı yumurta üretir. - Ertesi sabah, odası sığ suya aktarın ve odası hafif bir eğim ile yerleştirin. Balık Mate olabilir bölücü çıkarın.
- Bir çay süzgeci içine dökme tarafından yumurta toplayın. Yumurta suyu ile bir petri çanak içine yumurtalar transfer (20X yumurta suyu için, 6 g anında deniz tuzu, 1,5 g CaSO4 ve 1 L H2O; 1x kullanın). Daha iyi evreleme için, yumurtlama sonrası yumurtaları hemen toplayın. Embriyoları 28,5 °C ' lik bir kuluçte yerleştirin.
- Gerekirse, ortak bir protokol7,8aşağıdaki 1 – 4 hücre aşamalarında, morpholino, mRNA, vb enjekte. Nöral tüp görüntüleme için floresan membran etiketi (mem-mCherry, mem-mBFP1veya mem-Mcitrine) için mRNA enjekte (Bölüm 5).
- Bir veya iki erkek ve bir veya iki kadın zebra balığı bir çiftleşme odasına bir sürü su ile dolu yerleştirin. Erkek ve dişileri plastik bölücü kullanarak ayırın. Nöral tüp görüntüleme için hücre gruplarının görüntüleme (Bölüm 4) ve nöral tüp desenleme (nkx 2.2: mem-Gfp, dbx1b: Gfp, veya Olig2: DSRed) transjenik muhabir hattı için AB hattı kullanın. Onları bir gecede odaya bırak.
-
Pronase kullanarak dechorionate
- 128-hücre etrafında 256-hücre aşaması, bir 35 mm cam çanak yumurta suyu ile dolu sağlıklı embriyolar aktarmak. Çanak mümkün olduğunca çok yumurta suyu çıkarın.
- 1 mL 20 mg/mL pronase ekleyin. Plaka hareket ettirerek yavaşça girdap embriyoları ve cam pipet kullanarak dechorionation yardımcı olmak için hafifçe çözüm yukarı ve aşağı pipet.
- Ne zaman koryonlar elastikiyetini kaybetmeye başlar (genellikle 1-4 pronase ilavesi sonra Min, yumurta ve su miktarına bağlı olarak), pronase seyreltmek için mümkün olduğunca çok yumurta suyu ekleyin. Yavaşça forseps ile koryon dokunmadan elastikiyet kaybını değerlendirmek; Koryon hemen geri sıçrayan olmadan göçük tutmak gerekir. Bir cam pipet kullanarak yumurta suyu ile başka bir çanak için yumurta transfer (Bu noktada, koriyonların çoğu kırık değildir).
- Alternatif olarak, yavaşça embriyoları havaya embriyoları maruz kalmadan yumurta suyu ile dolu büyük bir 400 ml cam kabı içine çanak dökün. O zaman, embriyo tamamen yerleşmek izin verin. Embriyo bir tarafa düşmek izin için kabı eğim. Bir cam pipet kullanarak bu embriyoları toplayın ve 1/3x ringer çözeltisi ile dolu yeni bir 35 mm cam çanak aktarın.
- Birçok koreyonlar tamamen elastikiyetini kaybetmek kadar birkaç dakika bekleyin. Yumurtaların hafifçe pipetleme tarafından embriyolar kalan korolar çıkarın. Hasarlı embriyoları çıkarın ve 28,5 °C ' lik bir kuluçte embriyoları inkübe.
3. cerrahi Boyut azaltma ve kurtarma
- Bir temiz 35 mm cam çanak hazırlayın. Spread yaklaşık 0,5 mL 2% metil selüloz (içinde 1/3x zil çözümü, fenol kırmızı ile görselleştirmek için) büyük çanak alt merkezinin yakınında bir plastik spatula kullanarak. Metil selüloz yaklaşık 0,5 mm kalınlığında ince ve eşit şekilde yayılır.
- Yaklaşık 30 mL 1/3x zil 's çözüm çanak tarafına dökün ve yemek geri kalanı üzerine yaymak için izin, metil selüloz kapsayan.
- 256-Cell-1k-hücre aşamasında dechorionated embriyo yer 2% metil selüloz. Hem hücreleri hem de sarısı görselleştirmek için embriyoların yönünü yan tarafa ayarlayın. (Şekil 1)
- Kesme yaklaşık 30%-40% ' lik hücre (veya cam iğne) (Şekil 1, üst paneller) kullanarak hayvan-bitkisel eksen dik keserek hayvan direği yakın blastoderm hücrelerin%. Hücreleri çıkardıktan sonra, kalan hücrelerin geri takılmasını sağlamak için uçları hafifçe hafifçe dokunun. Birkaç dakika içinde, embriyo iyileşmeye başladığında ölü hücreler yırtılmalıdır.
- Sarısı (Şekil 1 orta paneller) "doğrama" yerine bitkisel kutup yakın sarısı için küçük bir yara olun. Yumurta membranı takılı tel ile çalarken ile sarısı yara. Sarısı, saldan sonra birkaç dakika dışarı sızmak olacak ve sonra yara iyileşir (Şekil 1 alt paneller).
- Sarısı dışarı sızmaya durur zaman, daha iyi kurtarmak için izin vermek için aynı çanak içinde metil selüloz dışında bir pipet kullanarak embriyo taşıyın.
- Tüm embriyo için 3.4-3.6 arasındaki adımları yineleyin. Embriyo kurtarırken çanak 30 dakika boyunca sabit bırakın.
-
Embriyoları taze 1/3x ringer çözeltisi ile yeni bir yemeğin içine aktarın ve onları tamamen kurtarmalarına izin vermek için 28,5 °C ' lik kuluçkörü içine koyun.
- Isteğe bağlı İlgi aşamasının erken Somit aşaması ise, 28,5 °C ' de kalkan aşamasına kadar, deney ve görüntüleme zamanlamasını ayarlamak için embriyoların 20 °C ' de inkübe edilebilir.
4. zebrafish Somitogenesis canlı görüntüleme
- Hazırlamak 100 ml 1% agaroz çözeltisi ekleyerek 1 g agaroz 100 ml yumurta suyu, Isıtma agaroz tamamen çözülene kadar. 62-72 °C sıcaklığa 5-10 dk. kadar soğumaya bırakın.
-
Görüntüleme için bir montaj hazırlayın.
Not: Bu kılavuz, tersine çevrilmiş geniş alan mikroskobu ile kullanılmak üzere geliştirilmiştir.- 100 mm x 15 mm plastik Petri çanak için% 1 agaroz ~ 15 ml dökün.
- Yavaşça bir dorsal Mount v1 kalıp şablonu5 Petri tabak altına yerleştirin. Su ile 15 mL tüp gibi bir ağırlık kullanarak alt kalıp tutun.
Not: Bu yüzden embriyolar, tersine çevrilmiş bir mikroskop kullanırken, mümkün olduğunca Petri tabağı altına kadar yakındır. Embriyolar Somit görüntüleme için yanal monte edilse de, burada dorsal Mount v15 , embriyoları erken Somit aşamalarında daha iyi tuttuğu için kullanılır. - Agaroz tamamen katılaşmış olana kadar soğumaya bırakın. % 0,01 tricaine ile yumurta suyu ~ 30 mL dökün ve dikkatle forseps ile yavaşça meraklı tarafından kalıp kaldırmak.
-
Somit görüntüleme için embriyo montajı
- 1/3x ringer çözeltisi (veya yumurta suyu) 1% düşük erime Agarose hazırlayın ve 42 °C ' de saklayın. Sıcaklık 42 °C ' ye gelene kadar bekleyin.
- Bir Diseksiyon mikroskobu altında, iyi başına bir embriyo yerleştirin. Yaklaşık olarak 1 μL düşük erime Agarose üzerinde pipet iyi ince boyutu, özellikle ve boyutu azaltma olmayan bireysel embriyolar boyutuna göre değişir boyutu ayarlamak için.
- Embriyoların yemek için tamamen yanal bir şekilde karşı karşıya olması için, embriyoları düşük eritme Agarose 'den önce hızlı bir şekilde yönlendirmek. Embriyoları taktıktan sonra, embriyoları yerinde tutmak için hafifçe agaroz montajına yerleştirin. Embriyoların tüm Somit sınırları için tamamen yanal olarak monte edilmesi gerektiğinden, daha sonraki aşamalarında açıkça görüntülenmeye yönelik olarak, uzun süreli Somit görüntüleme için oryantasyon özellikle önemlidir.
- Montaj alanından uzaklaşın ve 25 mm x 25 mm 'lik kapak camını, kalıp tarafından yapılan kare girintisinin oryantasyonunda 45 derece uzaklık olarak değiştirin. Her köşe kalıp farklı bir tarafı dinleninceye kadar bu yönde kalıp üzerinde lamel magazini kaydırın.
Not: Bu protokol ters bir mikroskop için olsa da, kalıp üzerine bir kapak camı yerleştirmek hala önemlidir, böylece embriyolar mikroskop aktarırken hareket etmez.
-
Görüntüleme Somit oluşumu süreci
- Foancore panoları ve dolap ısıtıcı ile inşa edilmiş bir kuluçta mikroskop 28 °C prewarm.
- Petri tabak monte embriyolar ile mikroskop sahne üzerine yerleştirin. Daha düşük büyütme lensi ile agaroz montajının sol üst kısmına monte edilmiş embriyo bulun, ardından hedefi 10X olarak değiştirin.
- Görüntü edinme ayarlayın.
Not: Bu talimat parlak alan içindir. - Somit sınırının açıkça görülebilmek için ışık gücü, pozlama süresi ve kondenser koşullarını bulun. Z-yığını ayarlarını kullanarak en düşük ve en yüksek istenen görüntüleme düzlemini ayarlayın. Toplam saat ve zaman aralığını ayarlayın. Bulmak ve tüm embriyolar bu yüzden birden fazla embriyo aynı anda görüntülenmiş olabilir monte XY konumlarını kaydedin.
- Fiji16kullanarak PSM ve Somitlerin uzunlukları ölçmek.
5. neural tüp desen görüntüleme
- Hazırlamak 100 ml 1% agaroz çözeltisi ekleyerek 1 g agaroz 100 ml yumurta suyu, Isıtma agaroz tamamen çözülene kadar. 5-10 dakikada 62-72 °C ' ye kadar soğumaya bırakın. % 0,01 için tricaine ayarlayın.
-
Görüntüleme için bir dorsal montaj hazırlayın.
Not: Bu kılavuz, dik floresan mikroskobu ile kullanılmak üzere geliştirilmiştir. Ters çevrilen mikroskoplar için lamel magazini alt yemekleri gereklidir ve adım 3 ' te montaj yönü çevrilir.- 100 mm x 15 mm plastik Petri çanak için% 1 agaroz ~ 15 ml dökün. Yavaşça hava kabarcıkları tanıtmak önlemek için agaroz yüzeyinde bir dorsal Mount v1 kalıp float. Agaroz tamamen katılaşmış olana kadar soğumaya bırakın.
- Kalıbı forseps veya jilet ile dikkatlice çıkarın. % 0,01 tricaine ile yumurta suyu ile çanak doldurun ve kullanımına kadar kapak.
-
Nöral tüp görüntüleme için embriyo monte edin.
- Transgenik veya enjekte floresan boyutuna izin verin-azaltılmış ve kontrol embriyolar 20-25 Somit aşamaya kadar geliştirmek için (kabaca 18-22 h döllenme sonra). Bir floresan membran etiketi (mem-mCherry, mem-mBFP1veya mem-mcitrine) ve nöral tüp deseninin transjenik muhabiri (nkx 2.2: mem-Gfp, dbx1b: Gfpveya Olig2: DSRed) ifade eden embriyo kullanılır görüntüleme için.
- % 0,01 tricaine çalışma solüsyonu ile hazırlanan dorsal montajda yumurta suyu ortamını değiştirin. Embriyolardan yavaşça pipet, dorsal montajın kuyularını görüntülenmiş.
- Embriyoları, kafasının montajda ileri bakacak şekilde doğru yönde manipüle etmesi ve kuyruk, arka taraftaki dorsal kısmı su yüzeyine doğru dönük olarak işaret ediyor.
- Kuyruk düz yalan ve yemek altına doğru aşağı işaret değil gibi embriyo Orient. Bazen batan ve yanlışlıkla Hindbrain görüntüleme kuyruk önlemek için montaj yan çıkıntıda kuyruk posterior kısmını dinlenmek için yararlıdır. Her embriyo için tekrarlayın. Boyutu küçülmüş embriyolar ile belirli olun onlar derin kuyu içine görüntülenmiş olmak düşmeyin.
- Montaj alanından uzaklaşın ve 25 mm x 25 mm 'lik kapak camını, kalıp tarafından yapılan kare girintisinin oryantasyonuna göre 45 ° uzaklık olarak değiştirin. Her köşe kalıp farklı bir tarafı dinleninceye kadar bu yönde kalıp üzerinde lamel magazini kaydırın.
- Hafifçe montaj alanına düşene kadar yavaşça coverglass döndürün. Embriyoların hala doğru pozisyonlara ve oryantasyonlara takılı olduğundan emin olmak için kontrol edin. Eğer çok fazla hareket coverglass düşen neden olur, hafifçe kaldırın ve adım C montaj tekrar.
-
3-b gelişen omurilik görüntü.
- Monte edilmiş embriyoları içeren tabağı yavaşça Konfokal mikroskopla taşıyın. Uzun süreli canlı görüntüleme için, inkübe edilmiş bir mikroskop kullandığınızdan emin olun. Aksi takdirde düşük sıcaklıklarda tolerans gösterilecektir.
- Aydınlık alan aydınlatma altında, görüntü için embriyo gidin ve tercih anterior-posterior pozisyonda bakış alanı merkezi. Embriyolar arasında ayrıntılı bir karşılaştırma sağlamak için, her embriyo üzerindeki bu pozisyon tutarlı olmalıdır.
- Görüntüleme parametrelerini, yansıtılan floresan proteinlerden heyecanlandırmak ve yakalama sinyalini ayarlayın. Parametreler ilk örnekteki istenen görüntüyü oluşturmak için göz tarafından ayarlanabilir. Ölçüm tutarlılığı etkinleştirmek için bu ayarları veri kümesindeki tüm embriyo uygulayın. Birçok z-yığınları gerekli ise hız ayarlarını optimize edin.
- Z-yığını ayarlarını kullanarak, en düşük ve en yüksek istenen görüntüleme düzlemini ayarlayın. Z-yığınındaki en iyi görüntü kalitesi için, z-çözünürlüğünü diyafram ayarı için en üst seviyede ayarlayın. İyi görüntüler 1 μm z-Aralık ile oluşturulabilir.
- Herhangi bir tercih edilen yöntemle görüntüleme verilerini analiz edin.
Not: Bu durumda, analiz, bir görüntünün nöral bölümlerinin basit segmentasyonunu ve görüntüleme sinyalinin ölçülmesini sağlayan özel MATLAB komut dosyaları ile gerçekleştirilmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sarısı hacim azaltma normal morfoloji için önemlidir
Son zamanlarda Almuedo-Castillo ve al.17' de açıklandığı gibi, embriyoların boyutu azaltılması, sarısı hacmini azaltmadan elde edilebilir. Sarısı hacim azaltma ile karşılaştırmak için, hem iki adımlı kesme (hem Blastula hem de sarısı) ve Blastula sadece doğrama (Şekil 2 ve ek film 1) gerçekleştirdik. İki adımlı doğranmış embriyo, gelişimsel aşamalarında ( Şekil 2' de üst ve orta panellere bakın) kontrol (sadece dechorionation sadece) embriyolar, boyut farkı dışında göre görünüşte normal genel morfoloji gösterdi. Öte yandan, blastula-sadece doğranmış embriyolar, özellikle önceki aşamalarında, tuhaf bir morfoloji gösterdi. Epiboly sırasında, embriyo bir daralan ve girintili görünüm vardı ( Şekil 2' de% 70 epiboly için alt paneline bakın). Aşağıdaki Somit aşamasında, orta çizgi yapıların düzleştirilmiş olduğu tespit edildi (yani DV uzunluğu ML uzunluğundan nispeten daha kısaydı) çok eksenli seviyelerde ( Şekil 2' de 8 ve 20 Somit için alt paneller bakın). Daha sonra aşamalarında, vücut yapıları, orta ve Hindbrain gibi sarısı, bitişik ve ilk ~ 10 somites, hala nispeten daha büyük yağdan artmış gerginlik nedeniyle nispeten düzleştirilmiş bir şekil gösterdi.
Boyuttaki Somit boyutu azaltılması embriyolar azalır
Somites, embriyogenite sırasında sürekli olarak görünen ve vertebra ve iskelet kaslarına yol gösteren segmental yapılardır. Presomitic mezoderm (PSM) itibaren, Somitlerin periyodik bir şekilde anterior posterior yönde biri tarafından oluşturulur (örneğin zebrafish için 25 dk, fareler için 2 h) (Şekil 3a). Hem kontrol hem de doğranmış embriyolar için Somit oluşumunun zaman atlamalı görüntüleme gerçekleştirdik ve en yeni oluşan Somitlerin boyutunu ölçtük (Şekil 3B). Hem kontrol hem de doğranmış embriyolarda, daha sonraki aşamalarında oluşan Somitlerin boyutları daha önceki aşamalardan olanlar ile karşılaştırıldığında daha küçük olarak bulunmuştur. Ayrıca, Somit oluşum aşamalarında, doğranmış embriyolar kontrol embriyoları olandan daha küçük somitler vardı (Şekil 3C).
Nöral tüp yükseklikleri aşağıdaki boyutta azaltılır
Embriyo boyutu azalma nöral tüp boyutu üzerindeki etkisini görmek için, biz iki adımlı kesme tekniği ile mem-mCherry enjekte embriyolar yapılan ve 20 HPF bizim konfoksel görüntüleme sistemi (Şekil 4A, B) kullanarak kendi omuriliği görüntülenmiş. Bu veri kümesinde, özel görüntü analiz kodu (Şekil 4C) kullanılarak el ile ölçüldüğü gibi, nöral tüp yükseklikleri% 12,4% ± 3,2% oranında azaltıldı. Birlikte alındığında, bu veri boyutu azaltma nöral tüp yüksekliğini azaltır gösterir. Bu teknik, nöral desenle Boyut azaltma etkilerini ölçmek için kullanılabilir.
Şekil 1 : Boyut azaltma tekniği. Hücrelerin yaklaşık% 30-40% hayvan Kutbu (üst paneller) kesildi. Sarısı çevreleyen membran dikkatle yaralandı böylece sarısı (orta paneller) dışarı oozed. Aşağıdaki birkaç dakika için, sarısı dışarı oozed ve sonra hem blastoderm ve sarısı üzerinde yaralar (alt paneller) iyileşti. Ölçek çubuğu = 200 μm. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 2 : Boyut azaltma iki yöntem arasında karşılaştırma. Embriyo kontrol (üst paneller, 24 HPF ve 30 HPF için en iyi embriyolar), iki adımlı doğrama (Blastula ve sarısı, orta paneller, 24 HPF ve 30 HPF için orta embriyo) ve boyutu azaltılmış embriyolar ile Blastula sadece doğrama (alt paneller, alt embriyo 24 HPF ve 30 HPF için) gelişimsel aşamalar boyunca karşılaştırılır. Blastula sadece doğranmış embriyolar, blastoderm hacmi çok daha küçük sarısı (% 70 epiboly) kıyasla olduğunu unutmayın. Sonuç olarak, embriyo, Somit aşamalarında orantısız bir şekilde düzleştirilmiş bir şekle sahiptir (yani, DV ekseni, blastula sadece doğranmış embriyolar AP eksenine kıyasla nispeten daha kısa, kontrol veya iki adımlı bir doğranmış bir) ile karşılaştırıldığında. Ölçek ba = 200 μm. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 3 : Boyut azaltma somites uzunluğu. (A) Somit oluşumunun şematik Illustration. (B) parlak alan zaman içinde kontrol ve doğranmış embriyo görüntüleri. Sarı ok uçları her bir Somit aşamasında en yeni oluşturulan Somit gösterir. (C) Somit uzunluğu (anterior-posterior eksen) ölçümleri zaman içinde hem kontrol ve doğranmış embriyo. Hata çubukları standart sapma temsil eder. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 4 : Boyut azaltma neural tüp yüksekliğini azaltır. (A-B) Normal boyutta (A) ve boyutu azaltılmış (B) TG (ptch2: Kaede) embriyoların örnek görüntüleri, mem-MCherry mRNA ile tek hücreli aşamaya enjekte edilmiştir. Ölçek çubuğu = 20 μm. (C) her z-yığınındaki nöral tüpün manuel segmentinden çıkarılan neural tüp yükseklikleri. İstatistiksel olarak anlamlı farklılıklar, değerleri eşleştirilmemiş bir t-testi kullanılarak karşılaştırıldığı zaman ortalama nöral yükseklikte görülür (p = 0,0397). Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Ek film 1: iki adımlı kesme ile Blastula-sadece doğrama arasındaki karşılaştırma. Üst satır = kontrol embriyoları, orta satır = boyutu iki adım kesme ile embriyolar azaltılmış, alt satır = boyutu Blastula sadece kesme ile embriyo azalır. Filmler her 3 dakikada bir alınmıştır 12 h. ölçek çubuğu = 1 mm. Bu videoyu görüntülemek Için lütfen buraya tıklayın. (İndirmek için sağ tıklayın.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tarihsel olarak, omurgalı hayvanlar arasında, Boyut azaltma genellikle bir Blastula aşamasında hayvan-bitkisel eksen boyunca embriyolar bisecting tarafından, amfitiyomer embriyo kullanılarak yapılmıştır12. Ancak, biz embriyolar şehri ikiye bölüyor zaman kurbağa ve zebra balığı embriyo arasında ağırlıklı olarak iki fark vardır. İlk olarak, zebra balığı embriyoları bisi (Blastula aşaması) toleranslı olduğunda sahnede, organizatör Blastula marjı18,19,20,21kısıtlı bir alanda yer almaktadır. Çünkü bir organizatörün embriyo morfolojisinden konumunu anlatamaz, hayvan-bitkisel eksen boyunca embriyoyu rasgele keserek dorsalized veya ventriyleştirilmiş embriyolar üretir. İkinci olarak, kurbağa embriyoları aksine, zebra balığı embriyolar, hücrelerle çevrili olana kadar hücrelerin ayrı bir sarısı etrafında bitkisel direğe doğru hareket ettikleri epiboly denen bir süreç üzerinden devam ederler. Sadece bir kısmı blastoderm kaldırılırsa, daha az hücre nispeten daha büyük hacim bir sarısı yutacak kalır, ve sonuç olarak, morfoloji epiboly sonra etkilenen görünür. Bu nedenle, biz, organizatörü kesme önlemek için, hayvan direği yakın blastulae Chop iki adımlı doğrama istihdam ve sarısı membran yara, blastula ile orantılı sarısı boyutu yapmak.
İki adımlı kesmeye ek olarak, cerrahi sonrası embriyonun iyileşmesi için Boyut azaltma cerrahisinin gerçekleştirildiği orta yer bulundu. Biz (yumurta suyu, yumurta suyu + albumin, Danieau tampon, L15, L15 + FBS, 1/3x zil, 1x zil), sadece 1/3x zil ve 1x zil çalıştı birçok medya arasında yüksek hayatta kalma oranları vermiştir; diğer medyada, embriyo yaralardan kurtaramadı.
Düşük hayatta kalma oranı için önemli bir sorun giderme ipucu sağlıklı ve Genç ebeveyn balıklardan sağlıklı embriyo kullanmaktır. Biz bile kontrol non-boyut azaltılmış embriyolar neredeyse 100% hayatta kalma oranı, boyutu azaltılmış, eski balıklardan embriyo daha düşük hayatta kalma hızını göstermek eğilimindedir gösterir kaydetti. Ayrıca, yaşam hızı boyutu azaltma ek perturbations ile birleştirildiğinde azalma eğilimindedir dikkat, morpholino enjeksiyon gibi.
Burada açıklanan Boyut azaltma tekniğinin basitliği, araştırmacıların bu tekniği özel ekipman veya yoğun eğitim olmadan uygulamanızı sağlar. Ayrıca, boyutu azaltılmış embriyolar gelişimin sonraki aşamalarına kadar küçük kalır (bir kez onlar yeme başlar, onların boyutu kontrol balığı ile yakalamak için görünüyor), bu teknik birçok doku ve organların ölçeklendirme çalışma uygulanabilir. Bu nedenle, bu teknik, çeşitli sistemlerin ölçekleme ve boyut kontrolünü incelemek için Boyut azaltma ve nicel in vivo canlı görüntülemenin birleştirilmesi mümkün kılar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir rekabet veya mali çıkarları beyan.
Acknowledgments
Çalışma, Japonya bilim ve teknoloji Ajansı (JPMJPR11AA) ve Ulusal Sağlık Enstitüleri hibe (R01GM107733) PRESTO programı tarafından destekleniyordu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 60 mm PYREX Petri dish | CORNING | 3160-60 | |
| Agarose | affymetrix | 75817 | For making a mount for live imaging |
| Agarose, low gelling temperature Type VII-A | SIGMA-ALDRICH | A0701-25G | |
| CaCl2 | EMD | CX0130-1 | For 1/3 Ringer's solution |
| CaSO4 | For egg water | ||
| Cover slip (25 mm x 25 mm, Thickness 1) | CORNING | 2845-25 | |
| Disposable Spatula | VWR | 80081-188 | |
| Foam board | ELMER'S | 951300 | For microscope incubator |
| Forcept (No 55) | FST | 11255-20 | |
| Glass pipette | VWR | 14673-043 | |
| HEPES | SIGMA Life Science | H4034 | For 1/3 Ringer's solution |
| INCUKIT XL for Cabinet Incubators | INCUBATOR Warehouse.com | For microscope incubator | |
| Instant sea salt | Instant Ocean | 138510 | For egg water |
| KCl | SIGMA-ALDRICH | P4504 | For 1/3 Ringer's solution |
| Methyl cellulose | SIGMA-ALDRICH | M0387-100G | |
| NaCl | SIGMA-ALDRICH | S7653 | For 1/3 Ringer's solution |
| Petri dish | Falcon | 351029 | For making a mount for live imaging |
| Phenol red | SIGMA Life Science | P0290 | |
| Pipette pump | BEL-ART PRODUCTS | F37898 | |
| Pronase | EMD Millipore Corp | 53702-250KU | |
| Tricaine-S (MS222) | WESTERN CHEMICAL INC | NC0135573 | |
| Ultra thin bright annealed 316L dia. 0.035 mm Stainless Steel Weaving Wires | Sandra | The wire we used was obtained ~20 years ago and we could not find exactly the same one. This product has the same material and diameter as the one we use. |
References
- Cooke, J. Scale of body pattern adjusts to available cell number in amphibian embryos. Nature. 290, 775-778 (1981).
- Driesch, H. Entwicklungsmechanische Studien: I. Der Werthe der beiden ersten Furchungszellen in der Echinogdermenentwicklung. Experimentelle Erzeugung von Theil- und Doppelbildungen. Zeitschrift fur wissenschaftliche Zoologie. , (1892).
- Morgan, T. H. Half embryos and whole embryos from one of the first two blastomeres. Anatomischer Anzeiger. 10, 623-638 (1895).
- Ishimatsu, K., et al. Size-reduced embryos reveal a gradient scaling-based mechanism for zebrafish somite formation. Development. 145, (2018).
- Megason, S. G. In toto imaging of embryogenesis with confocal time-lapse microscopy. Methods in Molecular Biology. 546, 317-332 (2009).
- Graeden, E., Sive, H. Live imaging of the zebrafish embryonic brain by confocal microscopy. Journal of Visualized Experiments. (26), e1217 (2009).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments. (25), e1115 (2009).
- Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos. Journal of Visualized Experiments. (27), e1113 (2009).
- Sorlien, E. L., Witucki, M. A., Ogas, J. Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio. Journal of Visualized Experiments. (138), e56969 (2018).
- Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation. Journal of Visualized Experiments. (29), e1394 (2009).
- Mizuno, T., Shinya, M., Takeda, H. Cell and tissue transplantation in zebrafish embryos. Methods in Molecular Biology. 127, 15-28 (1999).
- Cooke, J. Control of somite number during morphogenesis of a vertebrate, Xenopus laevis. Nature. 254, 196-199 (1975).
- Inomata, H., Shibata, T., Haraguchi, T., Sasai, Y. Scaling of dorsal-ventral patterning by embryo size-dependent degradation of Spemann's organizer signals. Cell. 153, 1296-1311 (2013).
- Gomez, C., et al. Control of segment number in vertebrate embryos. Nature. 454, 335-339 (2008).
- Lauschke, V. M., Tsiairis, C. D., Francois, P., Aulehla, A. Scaling of embryonic patterning based on phase-gradient encoding. Nature. 493, 101-105 (2013).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
- Almuedo-Castillo, M., et al. Scale-invariant patterning by size-dependent inhibition of Nodal signalling. Nature Cell Biology. 20, 1032-1042 (2018).
- Koos, D. S., Ho, R. K. The nieuwkoid gene characterizes and mediates a Nieuwkoop-center-like activity in the zebrafish. Current Biology. 8, 1199-1206 (1998).
- Yamanaka, Y., et al. A novel homeobox gene, dharma, can induce the organizer in a non-cell-autonomous manner. Genes and Development. 12, 2345-2353 (1998).
- Jesuthasan, S., Stahle, U. Dynamic microtubules and specification of the zebrafish embryonic axis. Current Biology. 7, 31-42 (1997).
- Schier, A. F., Talbot, W. S. The zebrafish organizer. Current Opinion in Genetics and Development. 8, 464-471 (1998).
