Summary
Questo documento descrive due metodi per quantificare le risposte della difesa nell'Arabidopsis thaliana in seguito all'esposizione agli elicitori immunitari: il scoppio ossidativo transitorio e l'inibizione della crescita delle piantine.
Abstract
Le piante hanno sviluppato un robusto sistema immunitario per percepire gli agenti patogeni e proteggere dalle malattie. Questo documento descrive due saggi che possono essere utilizzati per misurare la forza dell'attivazione immunitaria in Arabidopsis thaliana dopo il trattamento con molecole di elicitor. Presentato per primo è un metodo per catturare la raffica ossidativa rapida e dinamica, che può essere monitorata utilizzando un saggio basato sul luminol. Il secondo è presentato come misurare l'inibizione indotta immunoindotta della crescita delle piantine. Questi protocolli sono veloci e affidabili, non richiedono formazione o attrezzature specializzate e sono ampiamente utilizzati per comprendere la base genetica dell'immunità delle piante.
Introduction
Per percepire e difendersi dagli agenti patogeni, le piante hanno sviluppato recettori di riconoscimento dei modelli legati alla membrana (PRR) che rilevano molecole microbiche conservate al di fuori della cellula note come modelli molecolari associati ai microbi (MAMP)1. Il legame dei MAMP ai loro MR cognati avvia la segnalazione immunitaria mediata dalla chinasi proteica, con conseguente resistenza alle malattie ad ampio spettro2. Una delle prime risposte dopo l'attivazione del PRR è la fosforolalazione e l'attivazione delle proteine respiratorie RESPIRATORI OXIDASE HOMOLOG (RBOH) che catalizzano la produzione di specie extracellulari reattive dell'ossigeno (ROS)3 , 4. Il ROS svolge un ruolo importante nello stabilire la resistenza alle malattie, agendo sia come messaggeri secondari per propagare la segnalazione immunitaria sia come agenti antimicrobici diretti5. La prima osservazione di un'esplosione ossidativa immuno-elitata è stata descritta usando tuberi di patate di cv. Rishiri dopo Phytophthora infestans inoculazione6. La produzione di ROS è stata valutata in diverse specie vegetali utilizzando dischi foglia7, colture di sospensioni cellulari8e protoplasts6. Descritto qui è un metodo semplice per andire la produzione ROS innescata da pattern nei dischi foglia dell'Arabidopsis thaliana (Arabidopsis).
In risposta alla percezione del MAMP, le proteine RBOH attivate catalizzano la produzione di radicali di superossido (O2-), radicali idrossili (OH) e ossigeno singlet (1O2) che vengono convertiti in perossido di idrogeno (H2O 2) nello spazio extracellulare9. H2O2 può essere quantificato dalla chemiluminescenza a base di luminolo in presenza dell'agente ossidante perossidase (HRP)10. HRP ossida H2O2 generando uno ione idrossido (OH)e gas di ossigeno (O2) che reagiscono con il luminol per produrre un intermedio instabile che rilascia un fotone di luce10. L'emissione di fotoni può essere quantificata come unità di luce relativa (RLU) utilizzando un lettore di microplacino o un imager in grado di rilevare la luminescenza, che sono diventati pezzi standard di attrezzature nella maggior parte dei laboratori molecolari. Misurando la luce prodotta in un intervallo di 40-60 minuti, un'esplosione ossidativa transitoria può essere rilevata già 2-5 minuti dopo il trattamento dell'elicitor, raggiungendo il picco di 10-20 minuti e tornando a livelli basali dopo 60 minuti11. La luce cumulativa prodotta in questo ciclo temporale può essere utilizzata come misura della forza immunitaria corrispondente all'attivazione delle proteine RBOH12. Convenientemente, questo saggio non richiede attrezzature specializzate o preparazione ingombrante del campione.
Raggiungendo il picco poco dopo il rilevamento MAMP, il scoppio ossidativo è considerato una risposta immunitaria precoce, insieme all'attivazione MAPK e alla produzione di etilene5. Le successive risposte immunitarie includono la riprogrammazione trascrizionale, la chiusura stomatale e la deposizione callosa2,5. L'esposizione prolungata ai MAMP attiva continuamente la segnalazione immunitaria energeticamente costosa con conseguente inibizione della crescita delle piante, indicativa di un compromesso tra sviluppo e immunità13. L'inibizione della crescita delle piantine innescata a pattern (SGI) è ampiamente utilizzata per valutare la produzione immunitaria in Arabidopsis ed è stata parte integrante dell'identificazione di diversi componenti chiave della segnalazione immunitaria, tra cui i PRR14,15 ,16. Pertanto, questo documento presenta inoltre un saggio per la SGI innescata a motivi geometrici in Arabidopsis, in base al quale le piantine vengono coltivate in piastre multi-bene contenenti supporti standard o multimediali integrati con un elicitor immunitario per 8-12 giorni e poi pesati utilizzando una scala analitica.
Per dimostrare come i test ROS e SGI possono essere utilizzati per monitorare la segnalazione mediata da PRR, sono stati scelti tre genotipi che rappresentano output immunitarie variabili: (1) il tipo selvaggio Arabidopsis accession Columbia (Col-0), (2) il bak1-5 dominante-negativo in cui il co-recettore multifunzionale PRR BRASSINOSTEROID INSENSITIVE 1-ASSOCIATED KINASE 1 (BAK1) non è funzionale nella segnalazione immunitaria17,18e (3) il mutante cpk28-1 recessivo, che manca proteine regolatorie CALCIUM-dipendente PROTEIN A LIVELLO DI KINASE 28 (CPK28) e visualizza risposte potenziate19,20. I saggi ROS e SGI sono presentati in risposta a un epitopo peptide elf18 prodotto sinteticamente del fattore di allungamento batterico Tu (EF-Tu), riconosciuto in Arabidopsis dal PRR EF-Tu RECETTOR (EFR)15. Questi protocolli possono essere utilizzati con altri elicitori immunitari come la flagellina14 della proteina di motilità batterica o le proteine endogene dell'elicitora vegetale (AtPeps)16, tuttavia, va notato che la reattività delle piante differisce a seconda elicitor21. Insieme, i saggi ROS e SGI possono essere utilizzati per la valutazione rapida e quantitativa delle risposte mediate da PRR precoce e tardiva.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Rilevamento di esplosione ROS nei dischi foglia di Arabidopsis dopo l'elicitazione immunitaria
- Crescita e manutenzione dell'impianto.
- Per sincronizzare la germinazione, stratificare i semi di Arabidopsis sospendendo circa 50 semi in 1 mL di sterile 0,1% agar [w/v] e conservare a 4 gradi (senza luce) per 3-4 giorni.
NOTA: Stratificare un controllo dello sfondo di tipo selvaggio (ad esempio, Col-0) e genotipi con uscite immunitarie alte e basse (ad esempio, cpk28-1 e bak1-5, rispettivamente) per fungere da controlli interni. - Semina i semi sul suolo e germinano in condizioni standard di breve giorno (22 gradi centigradi, 10 h luce, 150 mE/m2/ intensità di luce e 65-70% di umidità relativa).
- Dopo circa 7 giorni, utilizzare pinze per trapiantare singole piantine in nuovi vasi, separati da almeno 4 cm per consentire lo sviluppo completo della rosetta. Trapianto 6-12 piantine per genotipo e ritorno a condizioni standard di breve giorno. Regolarmente acqua e fertilizzare piante (1 g/L di 20-20-20 fertilizzante ogni 2 settimane).
- Per sincronizzare la germinazione, stratificare i semi di Arabidopsis sospendendo circa 50 semi in 1 mL di sterile 0,1% agar [w/v] e conservare a 4 gradi (senza luce) per 3-4 giorni.
- Raccogliere i dischi foglia in piastre 96-bene per il recupero notturno.
- A 4-5 settimane dopo la germinazione (Figura 1A), utilizzare un forte pugno di biopsia di 4 mm per rimuovere un disco foglia per pianta, evitando la vena intermedia e facendo attenzione a limitare la feria (Figura 1B). Posizionare i dischi foglia in una piastra luminosa di 96 pozzetto inutilizzata contenente 100 -L di ddH2O con il lato adassiale rivolto verso l'alto per evitare la disidratazione22 (Figura 1C). Se si valutano più elicitori, rimuovere 1 foglio dalla stessa foglia per ogni trattamento con elicitor.
NOTA: foglie di esempio completamente espanse, dal terzo al quinto dalla parte superiore della rosetta e approssimativamente alla stessa dimensione ed età per limitare la variabilità. Se possibile, tagliare a metà i dischi foglia utilizzando una lama di rasoio prima del recupero notturno, in quanto ciò aumenta la superficie esposta alla soluzione di elicitor23. - Recuperare durante la notte a temperatura ambiente per evitare l'interferenza di ROS prodotto dalla ferita durante la raccolta del disco foglia. Coprire le piastre con un coperchio per evitare l'evaporazione.
- A 4-5 settimane dopo la germinazione (Figura 1A), utilizzare un forte pugno di biopsia di 4 mm per rimuovere un disco foglia per pianta, evitando la vena intermedia e facendo attenzione a limitare la feria (Figura 1B). Posizionare i dischi foglia in una piastra luminosa di 96 pozzetto inutilizzata contenente 100 -L di ddH2O con il lato adassiale rivolto verso l'alto per evitare la disidratazione22 (Figura 1C). Se si valutano più elicitori, rimuovere 1 foglio dalla stessa foglia per ogni trattamento con elicitor.
- Eseguire il trattamento con l'elicitor e misurare la produzione di ROS.
- Programmare il lettore di piastre prima di aggiungere la soluzione di reazione, in quanto ciò ridurrà il tempo che interverrà tra l'inizio della raffica di ROS e le prime misurazioni registrate. Utilizzare un software commerciale appropriato per il lettore di lastre. Nel nostro caso (vedere Sommario),fare clic su Impostazionie selezionare la cartuccia LUM96 e il tipo di lettura cinetica. Fare clic sulla categoria Area di lettura e trascinare per selezionare un sottoinsieme di pozze o l'intera piastra da leggere. Nella scheda PMT e ottica, impostare il tempo di integrazione su 1.000 ms. Nella scheda Intervallo, impostare il tempo di esecuzione totale su 40-60 min e l'intervallo su 2 min.
- Rimuovere l'acqua da ogni pozzo utilizzando una pipetta multicanale.
NOTA: Non forare i dischi foglia, in quanto ciò potrebbe causare stress da ferita e provocare uscite ROS più variabili. - Preparare una soluzione di reazione contenente 100 m luminol, 10 g/mL HRP, e la concentrazione desiderata di elicitor (ad esempio: elf18 a 1 nM, 10 nM, 100 nM o 1.000 nM) in sterile ddH2O utilizzando 10 mL di soluzione per una piastra da 96.
NOTA: Sciogliere i peptidi lofilofili in sterili H2O in tubi a bassa legatura per fare uno stock di 10 mM, congelare flash nel liquido N2e conservare a -80 gradi centigradi. Quando è pronto per l'uso, diluire le scorte in sterile H2O per generare una scorta di lavoro di 100 M e conservare a -20 gradi centigradi. - Utilizzare una pipetta multicanale per erogare 100 l di l della miscela di reazione ad ogni pozzo, aggiungendo la soluzione a tutti i dischi foglia dello stesso trattamento allo stesso tempo22. Includere una reazione di controllo (nessun elicitor) per ogni genotipo per valutare i livelli di ROS basale in assenza di elicitazione. Misurare immediatamente l'emissione di luce per tutte le lunghezze d'onda nello spettro visibile utilizzando un lettore di microplacino.
NOTA: Preparare e applicare la soluzione di reazione in condizioni di scarsa illuminazione, poiché il luminolo e l'HRP sono reagenti sensibili alla luce. Mantenere i reagenti sul ghiaccio o a -20 gradi centigradi, a meno che non siano in uso. - Misurare l'emissione di luce con un tempo di integrazione di 1.000 ms in intervalli di 2 minuti su un periodo di 40-60 min in un lettore di microplacino al fine di catturare l'esplosione ossidativa dinamica (Figura 1D).
NOTA: Utilizzare un tempo di integrazione più lungo per migliorare la sensibilità di analisi11, garantendo al contempo che tutti i campioni in una piastra di 96 pozzetto possano essere misurati in un intervallo.
- Interpretazione dei dati.
- Per ogni genotipo, utilizzare un'applicazione foglio di calcolo per calcolare il numero medio di fotoni e l'errore standard in ogni punto temporale e visualizzare la produzione ROS in funzione del tempo utilizzando un grafico a dispersione.
Dove t - ogni punto temporale - In alternativa, sommare i conteggi dei fotoni per ogni disco foglia e presentare la media di questi valori per ogni genotipo utilizzando un grafico a barre con barre di errore standard o un grafico a scatola e baffi.
- Per ogni genotipo, utilizzare un'applicazione foglio di calcolo per calcolare il numero medio di fotoni e l'errore standard in ogni punto temporale e visualizzare la produzione ROS in funzione del tempo utilizzando un grafico a dispersione.
2. Inibizione della crescita delle piantine
- Sterilizzare semi e semimare su piastre Murashige e Skoog (MS).
- Preparare la metà della forza sterile (0,5x) media MS (2,16 g/L) contenente 0,8% agar [w/v]. Versare i supporti in piastre (90 x 15 mm) in un cappuccio a flusso laminare.
- Sterilizzare circa 100 semi in un tubo di microcentrifuga lavando con 1 mL del 70% di etanolo per 2 min e rimuovere per aspirazione. Aggiungere 1 mL di 40% di candeggina e abbellire delicatamente per 17 min a temperatura ambiente. Rimuovere la candeggina per aspirazione e lavare tre volte in 1 mL di acqua sterile per 5 min. Resuspend in 1 mL di sterile 0.1% agar.
NOTA: In alternativa, utilizzare un protocollo di sterilizzazione del gas di cloro24. - Semina circa 100 semi per genotipo su piastre MS agar utilizzando una pipetta e una guarnizione con nastro microporo in un cappuccio a flusso laminare.
NOTA: Evitare di posizionare i semi in prossimità in quanto ciò renderà difficile il trapianto di piantine in seguito. - Stratificate i semi mettendo le piastre a 4 gradi centigradi (senza luce) per 3-4 giorni per sincronizzare la germinazione (Figura 2A).
- Piantine trapianti in piastre di 48 pozzi contenenti peptidi elicitor i immunitari.
- Dopo la stratificazione, spostare le piastre alla luce in condizioni di giorno breve (22 gradi centigradi, 10 h luce, 150 mE/m2/ s intensità di luce e 65-70% umidità relativa) per 3-4 giorni per consentire la germinazione.
- In un cappuccio a flusso laminare, preparare le diluizioni dei peptidi di elicitor (0 nM, 1 nM, 10 nM, 100 nM e 1.000 nM) in supporti liquidi sterili 0,5x MS contenenti 1% di saccarosio [w/v], utilizzando 25 mL di MS per ogni piastra di 48 pozze. Preparare le piastre con la pipa 500 l di MS medio o MS medio contenente peptidi per pozzo. Se disponibile, utilizzare un pipettor di ripetizione per la preparazione della piastra per accelerare il processo.
NOTA: Per ogni genotipo, coltivare piantine in MS senza elicitor per tenere conto di eventuali differenze intrinseche nella crescita delle piantine. - Utilizzando pinze sterili trapiantare con attenzione una piantina ad ogni pozzo della stessa dimensione ed età, assicurando che non vi sia alcun danno alla piantina o rottura alla radice e che la radice sia immersa nei media. Per ogni genotipo, trapiantare un minimo di 6-8 piantine in ogni diluizione peptide (Figura 2B).
NOTA: Le piantine trapianti a 4 giorni dopo la germinazione, poiché le radici corte sono più facili da manipolare e le piantine più vecchie possono produrre risultati meno ottimali. - Piastre di sigillazione con nastro microporo e ritorno alla luce in condizioni standard di breve giorno (22 gradi centigradi, 10 h di luce, 150 mE/m2/ s intensità di luce e 65-70% di umidità relativa). Lasciare che le piantine crescano per 8-12 giorni.
- Determinare l'inibizione percentuale della crescita.
- Rimuovere con cura le piantine da piastre 48-well e asciugare tamponando su carta assorbente. Pesare le piantine su una scala analitica e registrare i valori. Se disponibile, utilizzare una bilancia analitica dotata di output USB per registrare i valori di peso nuovi su un foglio di calcolo. Prima di pesare piantine, scattare una foto per visualizzare visivamente l'inibizione della crescita (Figura 2C).
- Determinare l'inibizione percentuale della crescita delle piantine trattate con elicitori rispetto alle piantine coltivate solo in MS (Figura 2D) come segue:
- Tracciare i dati utilizzando un grafico a barre con barre di errore standard o utilizzando un grafico a scatola e baffi per visualizzare meglio la varianza intersperimentale.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mutant cpk28-119,25 e bak1-517,18 piante sono state utilizzate per dimostrare i risultati attesi per i genotipi con risposte immunitarie alte e basse, rispettivamente, in burst ossidativo e SGI saggi relativi a un controllo di sfondo di tipo selvaggio (Col-0). Per valutare gli effetti dipendenti dalla dose, è stata utilizzata una serie di diluizione peptide di 10 volte (1-1.000 nM) di elfo18. Come previsto, le linee di perdita di funzione di cpk28-1 hanno avuto un aumento cumulativo (Figura 3A) e media (Figura 3B) ROS burst rispetto al Col-0, mentre bak1-5 ha mostrato ridotta produzione ROS a concentrazioni tra 10 nM e 1.000 nM (Figura 3). Si potrebbero distinguere le differenze attese in SGI tra tutti i genotipi coltivati in 100 nM e 1.000 nM elf18 (Figura 4A), che potrebbero essere osservati anche visivamente nel trattamento di 1.000 nM elf18 (Figura 4B). Caratteristici dell'alta segnalazione immunitaria, i mutanti cpk28-1 erano notevolmente più piccoli del Col-0 quando erano coltivati in 1.000 nM elf18, mentre i mutanti bak1-5 mostravano inibizioni di crescita debole rispetto al Col-0 a causa del rilevamento MAMP interrotto.
come illustrato nella Figura 1. Saggio di scoppio ossidativo a base di luminolo a seguito dell'induzione immunitaria in Arabidopsis. (A) Coltivare piante sul terreno in condizioni di breve giorno per 4-5 settimane. (B) Utilizzare un punzone di biopsia da 4 mm per raccogliere i dischi fogliada da ogni pianta e recuperare durante la notte in ddH2O. (C) Aggiungere una soluzione di reazione (100 M luminol, 10 s/mL HRP, e la concentrazione desiderata di elicitor) e misurare l'emissione di luce oltre 40-60 min, in intervalli min con un tempo di integrazione di 1.000 ms.(D) Determinare i conteggi media dei fotoni per ogni genotipo rispetto al Col-0 (mostrato in verde), un controllo ROS elevato come cpk28-1 (mostrato in viola) e un basso controllo ROS come bak1-5 (mostrato in arancione). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
come illustrato nella Figura 2. Saggio di crescita della piantina indotta da elicitor in Arabidopsis. (A) Semina le piantine su SM agar e crescono per 3-4 giorni in condizioni standard di breve giorno. (B) Piantine trapianti a 48 pozze contenenti medie MS o MS contenenti diverse concentrazioni di elfo18. (C) Dopo 8-12 giorni, valutare visivamente la dimensione della piantina e quindi misurare il peso fresco utilizzando una scala analitica per determinare l'inibizione della crescita percentuale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
come illustrato nella figura 3. Il rappresentante dell'ossidativo indotto dall'elfo18 è esploso in tre genotipi arabidopsis. Le piante vecchie di quattro settimane sono state trattate con una serie di diluizione di elfi18 (0 nM 'mock', 1 nM, 10 nM, 100 nM e 1.000 nM). Col-0 rappresenta il controllo dello sfondo di tipo selvaggio, con cpk28-1 e bak1-5 che rappresentano fenotipi ROS alti e bassi, rispettivamente. (A) Numero totale di fotoni rappresentato comeunità di luce relativa in seguito al trattamento elf18 (n dischi foglia da piante indipendenti). Le differenze statistiche sono rappresentate da lettere minuscole e sono state calcolate utilizzando un ANOVAunidirezionale con un test di differenza significativa onesta post-hoc di Tukey (p <0.05). (B) Numero medio di fotoni, rappresentato come unità di lucerelativa, oltre 40 min dopo il trattamento elf18 (n dischi foglia 6 da piante indipendenti). Le barre di errore rappresentano l'errore standard della media. Risultati simili sono stati ottenuti in due dei tre esperimenti. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
come illustrato nella Figura 4. Rappresentativo inibizione della crescita della piantina indotta da elfo18 in tre genotipi arabidopsis. Le piantine wild-type (Col-0), cpk28-1e bak1-5 sono state coltivate in una serie di diluizione di 10 volte (0-1.000 nM) di elfo18. (A) L'inibizione percentuale della crescita è stata calcolata confrontando il peso delle singole piantine coltivate in elfo18 (nn 6 piantine individuali) con il peso medio delle piantine dello stesso genotipo coltivate solo in SM ('mock') (n n .6 singole piantine) per un periodo di 10 giorni. Le differenze statistiche sono rappresentate da lettere minuscole e sono state calcolate utilizzando un ANOVAunidirezionale con un test sulle differenze onestamente significative di Tukey (p <0.05). (B) Dimostrazione visiva di SGI in due piantine rappresentative di Col-0, cpk28-1 e bak1-5 in risposta alle crescenti concentrazioni di elfo18. Risultati simili sono stati ottenuti in tre dei quattro esperimenti. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Questo documento descrive due metodi per andire le risposte immunitarie innescate in modello in Arabidopsis, offrendo approcci quantitativi alla valutazione della produzione immunitaria senza l'uso di apparecchiature specializzate. In combinazione, ROS e SGI attivati in modello possono essere utilizzati per valutare le risposte tempestive e tardive alla percezione dei microbi, rispettivamente.
La principale limitazione del saggio ossidativo burst è la variabilità. Per motivi che non sono completamente compresi, le RLI assolute spesso differiscono per un ordine di grandezza tra gli esperimenti. Poiché la variabilità tra gli esperimenti è elevata, è consigliabile includere controlli di riferimento interni con picchi ossidativi alti (adesempio, cpk28-1) e bassi (ad esempio, bak1-5) in aggiunta a un controllo di tipo selvaggio (ad esempio, Col-0). Tuttavia, possono essere adottate misure per aumentare la riproducibilità tra un esperimento e l'altro. Le condizioni ambientali come la temperatura, l'umidità, il fotoperiodo e l'intensità della luce devono essere identiche tra le repliche. L'età e la salute delle piante devono essere prese in considerazione anche durante il campionamento. I dischi foglia possono essere raccolti da piante che sono tra 4 e 7 settimane di età coltivate in condizioni di pochi giorni (6-10 ore di luce). Aneddoticamente, i risultati più coerenti sono stati trovati con piante più vecchie di 6 settimane dopo la germinazione, ma non ancora fioritura o senescing. È importante coltivare piante in camere ambientali pulite in modo che non siano esposte a comuni parassiti della serre come l'oidio o gli insetti masticatori. Poiché le piantine per SGI sono coltivate in supporti smmembri sterili, e per un tempo più breve, le fluttuazioni ambientali non sono in gran parte una preoccupazione. Tuttavia, la variazione può verificarsi se le piantine si danneggiano durante il trapianto, se le piantine selezionate per i trattamenti con elicitor sono di dimensioni diverse o se il supporto di crescita viene contaminato. Si consiglia di includere anche i genotipi di controllo di riferimento interno descritti in precedenza negli esperimenti SGI.
La concentrazione di elicitori è un'altra considerazione importante quando si conducono saggi immunitari. Gli elicitori sono percepiti dai PRR, con conseguente rapida e robusta raffica ROS con un picco di 10-20 minuti dopo il trattamento con elicitor (Figura 2B). Tuttavia, la grandezza dello scoppio dipende sia dall'elicitor che dal genotipo vegetale. Pertanto, è consigliata una serie di dosi di elicitori, come illustrato nella Figura 3 e Nella Figura4, al fine di identificare una concentrazione di elicitor idonea. Il ROS innescato di pattern può anche essere analizzato inoculando dischi fogliari con microbi vivi23,26 o estratti microbici26,27,28. Ad esempio, le raffiche ROS transitorie e dipendenti dalla dose possono essere rilevate in Arabidopsis in risposta a i pagovarvi virulenti delle siringhe Pseudomonas, raggiungendo il picco a 35-40 minuti e raggiungendo livelli basali circa 70 minuti dopo l'elicitation 23 del 23 o , 29.In risposta ai batteri avirulent29 o il patogeno fungino P. infestans30,31, un secondo più pronunciato accumulo di ROS è prodotto che può essere monitorato 6-10 ore dopo Inoculazione. Per gli elicitori più deboli, come la chitina fungina32 o chitosan33, possono essere utilizzati indicatori luminescenti più sensibili, come il derivato luminol L-012, tuttavia, il segnale di fondo prodotto è spesso superiorea 32, 34. È importante sottolineare che l'ecotipo vegetale determinerà anche la sua reattività a specifici eliciri35,36. Ad esempio, mentre la flagellina batterica è in grado di suscitare risposte immunitarie in diversi ecotipi dell'Arabidopsis, tra cui Col-0, l'ecotipo Wassilewskija (Ws-0) esprime una variante non funzionale del PRR FLAGELLIN-SENSING 2 (FLS2) ed è quindi insensibile alla flagellina14,37.
Il ROS immune-indotto può essere osservato anche nei dischi fogliadi di altre piante dicotiledonose tra cui Brassica napus38, pomodoro39, Nicotiana benthamiana22,40,41e diverse altre specie solanacee41. Ulteriori analisi di rilevamento ROS basate su luminol sono state sviluppate per le piante che utilizzano estratti di tessuto10, colture di sospensioni cellulari8,42e protoplasts43, e sono particolarmente utili nei sistemi dove i protocolli a disco foglia non sono efficaci42. Ad esempio, le esplosioni di ROS indotte da elicitor sono state descritte utilizzando colture di sospensioni cellulari nel riso42,44 e grano45,46, così come il gymnosperm Araucaria angustifolia 47 e il muschio Physcomitrella patens48. SGI non è stato utilizzato come ampiamente per misurare la segnalazione immunitaria. Tuttavia, l'inibizione della crescita in risposta agli eliciri è stata dimostrata in N. benthamiana41 e B. napus38,49. L'inibizione rapida della crescita è stata dimostrata anche in P. patens in risposta alla chitina fungina che si verifica entro 2 minuti di esposizione, che può essere osservata utilizzando la fotografia time-lapse48.
Con la modifica, sia SGI che i saggi a scoppio ossidativo possono essere utilizzati per schermi ad alta velocità per identificare i regolatori immunitari. Ad esempio, le popolazioni mutagenizzate di Arabidopsis possono essere coltivate su MS medio e inondate di eliche per identificare mutanti insensibili15,50,51,52,53. In alternativa, le popolazioni mutagenizzate possono essere valutate per ROS innescato, che è stato eseguito con successo sia con foglia-dischi54 che con intere piantine coltivate su piastre MS19. Un altro metodo di screening utile è l'espressione transitoria delle proteine in N. benthamiana per l'analisi ROS prima dello sviluppo di linee di sovraespressione transgenica22,40,55. Tuttavia, la variazione intrasperimentale è più elevata rispetto alle linee stabili dell'Arabidopsis a causa dell'espressione differenziale della proteina in N. benthamiana lascia22, anche se questo può essere parzialmente mitigato da infiltrazioni di riferimento sulla stessa foglia dei campioni sperimentali.
In sintesi, il burst ossidativo indotto dall'immuneing e i test SGI sono metodi rapidi e affidabili per valutare la segnalazione mediata da PRR in Arabidopsis. Questi metodi possono essere estesi ad altri sistemi e utilizzati per schermi su larga scala per scoprire nuovi regolatori immunitari.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
nessuno.
Acknowledgments
Il lavoro nel nostro laboratorio è finanziato attraverso il Natural Resources and Engineering Research Council of Canada (NSERC) Discovery Program, la Canadian Foundation for Innovation John R. Evans Leader's Fund e la Queen's University. KS e IS sono supportati da borse di studio tandem Ontario Graduate e borse di studio NSERC Canada Graduate per studenti di master (CGS-M).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 20-20-20 Fertilizer | Plant Prod | 10529 | Mix 1g/L in water and apply to plants every 2 weeks for optimal growth. |
| 4 mm Biopsy Punch | Medical Mart | 232-33-34-P | A cork borer set with a 0.125 cm^2 surface area can also be used. |
| 48-Well Sterile Plates with Lid | Sigma-Aldrich | CLS3548 | |
| Analytical Scale with Draft Sheid | VWR | VWR-225AC | Any standard analytical scale can be used for growth inibition assays, however, a direct computer output is optimal. |
| BioHit mLine Mechanical 12 Multichannel Pipette (30-300 uL) | Sartorius | 725240 | Any multichannel pipette can be used, as can a single pipetter if necessary. |
| elf18 (Ac-SKEKFERTKPHVNVGTIG) | EZ Biolab | cp7211 | Store 10 mM stock peptide at -80C in low protein binding tubes. When thawed, store 100 uM working stock at -20C. |
| Forceps | Fisher Scientific | 22-327379 | |
| Horseradish Peroxidase | Sigma-Aldrich | P6782 | Dissolve in pure water. Store at -20C and away from light. |
| Luminol | Sigma-Aldrich | A8511 | Dissolve in DMSO. Store at -20C and away from light. |
| Murisage and Skoog Basal Salts | Cedarlane Labs | MSP09-100LT | Store at 4C. |
| Soil | SunGrow Horticulture | Sunshine Mix #1 | Other soil types can also be used to grow Arabidopsis. Mix with water when filling pots. |
| SpectraMax Paradigm Multi Mode Microplate Reader with LUM Module | Molecular Devices | Must request a quote | Any plate reader capable of detecting luminescence can be used for these assays. |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389-1KG | Store at room temperature. |
| White Polystyrene 96-Well Plates | Fisher Scientific | 07-200-589 |
References
- Couto, D. E., Zipfel, C. Regulation of pattern recognition receptor signalling in plants. Nature Reviews Immunology. 16, 537-552 (2016).
- Boller, T., Felix, G. A Renaissance of Elicitors: Perception of Microbe-Associated Molecular Patterns and Danger Signals by Pattern-Recognition Receptors. Annual Review of Plant Biology. 60, 379-406 (2009).
- Marino, D., Dunand, C., Puppo, A., Pauly, N. A burst of plant NADPH oxidases. Trends in Plant Science. 56 (8), 1472-1480 (2012).
- Kadota, Y., Shirasu, K., Zipfel, C. Regulation of the NADPH Oxidase RBOHD during Plant Immunity. Plant and Cell Physiology. 56 (8), 1472-1480 (2015).
- Yu, X., Feng, B., He, P., Shan, L. From chaos to harmony: responses and signaling upon microbial pattern recognition. Annual Review of Phytopathology. 55, 109-137 (2017).
- Doke, N. Involvement of superoxide anion generation in the hypersensitive response of potato tuber tissues to infection with an incompatible race of Phytophthora infestans and to the hyphal wall components. Physiological Plant Pathology. 23 (3), 345-357 (1983).
- Bindschedler, L. V., et al. Peroxidase-dependent apoplastic oxidative burst in Arabidopsis required for pathogen resistance. The Plant Journal. 47 (6), 851-863 (2006).
- Keppler, L. D. Active Oxygen Production During a Bacteria-Induced Hypersensitive Reaction in Tobacco Suspension Cells. Phytopathology. 110 (3), 759-763 (1989).
- Wrzaczek, M., Brosché, M., Kangasjärvi, J. ROS signaling loops - production, perception, regulation. Current Opinion in Plant Biology. 16 (5), 575-582 (2013).
- Warm, E., Laties, G. G. Quantification of hydrogen peroxide in plant extracts by the chemiluminescence reaction with luminol. Phytochemistry. 21 (4), 827-831 (1982).
- Trujillo, M. Analysis of the lmmunity-Related Oxidative Bursts by a Luminol-Based Assay. Methods in Molecular Biology. 1398, 323-329 (2016).
- Nühse, T. S., Bottrill, A. R., Jones, A. M. E., Peck, S. C. Quantitative phosphoproteomic analysis of plasma membrane proteins reveals regulatory mechanisms of plant innate immune responses. The Plant Journal. 51 (5), 931-940 (2007).
- Belkhadir, Y., Yang, L., Hetzel, J., Dangl, J. L., Chory, J. The growth-defense pivot: Crisis management in plants mediated by LRR-RK surface receptors. Trends in Biochemical Sciences. 39 (10), 447-456 (2014).
- Gómez-Gómez, L., Felix, G., Boller, T. A single locus determines sensitivity to bacterial flagellin in Arabidopsis thaliana. The Plant Journal. 18 (3), 277-284 (1999).
- Zipfel, C., et al. Perception of the Bacterial PAMP EF-Tu by the Receptor EFR Restricts Agrobacterium-Mediated Transformation. Cell. 125 (4), 749-760 (2006).
- Krol, E., et al. Perception of the Arabidopsis danger signal peptide 1 involves the pattern recognition receptor AtPEPR1 and its close homologue AtPEPR2. Journal of Biological Chemistry. 285 (18), 13471-13479 (2010).
- Schwessinger, B., et al. Phosphorylation-dependent differential regulation of plant growth, cell death, and innate immunity by the regulatory receptor-like kinase BAK1. PLoS Genetics. 7 (4), e1002046 (2011).
- Roux, M., et al. The Arabidopsis Leucine-Rich Repeat Receptor-Like Kinases BAK1/SERK3 and BKK1/SERK4 Are Required for Innate Immunity to Hemibiotrophic and Biotrophic Pathogens. The Plant Cell. 23 (6), 2440-2455 (2011).
- Monaghan, J., et al. The calcium-dependent protein kinase CPK28 buffers plant immunity and regulates BIK1 turnover. Cell Host and Microbe. 16 (5), 605-615 (2014).
- Wang, J., et al. A Regulatory Module Controlling Homeostasis of a Plant Immune Kinase. Molecular Cell. 69 (3), 493-504 (2018).
- Mott, G. A., et al. Genomic screens identify a new phytobacterial microbe-associated molecular pattern and the cognate Arabidopsis receptor-like kinase that mediates its immune elicitation. Genome Biology. 17, 98 (2016).
- Sang, Y., Macho, A. P. Analysis of PAMP-Triggered ROS Burst in Plant Immunity. Methods in Molecular Biology. 1578, 143-153 (2017).
- Smith, J. M., Heese, A. Rapid bioassay to measure early reactive oxygen species production in Arabidopsis leave tissue in response to living Pseudomonas syringae. Plant Methods. 10 (1), 6 (2014).
- Lindsey, B. E., Rivero, L., Calhoun, C. S., Grotewold, E., Brkljacic, J. Standardized Method for High-throughput Sterilization of Arabidopsis Seeds. Journal of Visualized Experiments. 128, (2017).
- Matschi, S., Werner, S., Schulze, W. X., Legen, J., Hilger, H. H., Romeis, T. Function of calcium-dependent protein kinase CPK28 of Arabidopsis thaliana in plant stem elongation and vascular development. The Plant Journal. 73 (6), 883-896 (2013).
- Felix, G., Duran, J. D., Volko, S., Boller, T. Plants have a sensitive perception system for the most conserved domain of bacterial flagellin. The Plant Journal. 18 (3), 265-276 (2002).
- Kunze, G., Zipfel, C., Robatzek, S., Niehaus, K., Boller, T., Felix, G. The N Terminus of Bacterial Elongation Factor Tu Elicits Innate Immunity in Arabidopsis Plants. The Plant Cell. 16 (12), 3496-3507 (2004).
- Zipfel, C., et al. Bacterial disease resistance in Arabidopsis through flagellin perception. Nature. 428 (6984), 764-767 (2004).
- Mur, L. A. J., Kenton, P., Draper, J. In planta measurements of oxidative bursts elicited by avirulent and virulent bacterial pathogens suggests that H2O2 is insufficient to elicit cell death in tobacco. Plant, Cell and Environment. 28 (4), 548-561 (2005).
- Kobayashi, M., et al. Calcium-dependent protein kinases regulate the production of reactive oxygen species by potato NADPH oxidase. The Plant Cell. 19 (3), 1065-1080 (2007).
- Yoshioka, H., et al. Induction of Plant gp91 phox Homolog by Fungal Cell Wall, Arachidonic Acid, and Salicylic Acid in Potato. Molecular Plant-Microbe Interactions. 14 (6), 725-736 (2001).
- Klauser, D., Flury, P., Boller, T., Bartels, S. Several MAMPs, including chitin fragments, enhance AtPep-triggered oxidative burst independently of wounding. Plant Signaling and Behavior. 8 (9), e25346 (2013).
- El Gueddari, N. E., Rauchhaus, U., Moerschbacher, B. M., Deising, H. B. Developmentally regulated conversion of surface-exposed chitin to chitosan in cell walls of plant pathogenic fungi. New Phytologist. 156 (1), 103-112 (2002).
- Daiber, A., et al. Detection of superoxide and peroxynitrite in model systems and mitochondria by the luminol analogue L-012. Free Radical Research. 38 (3), 259-269 (2004).
- Bauer, Z., Gómez-Gómez, L., Boller, T., Felix, G. Sensitivity of Different Ecotypes and Mutants of Arabidopsis thaliana toward the Bacterial Elicitor Flagellin Correlates with the Presence of Receptor-binding Sites. Journal of Biological Chemistry. 276 (49), 45669-45676 (2001).
- Vetter, M. M., et al. Flagellin perception varies quantitatively in arabidopsis thaliana and its relatives. Molecular Biology and Evolution. 29 (6), 1655-1667 (2012).
- Chinchilla, D. The Arabidopsis Receptor Kinase FLS2 Binds flg22 and Determines the Specificity of Flagellin Perception. The Plant Cell. 18 (2), 465-476 (2006).
- Lloyd, S. R., Schoonbeek, H., Trick, M., Zipfel, C., Ridout, C. J. Methods to Study PAMP-Triggered Immunity in Brassica Species. Molecular Plant-Microbe Interactions. 27 (3), 286-295 (2014).
- Clarke, C., Vinatzer, B. Characterizing the Immune-Eliciting Activity of Putative Microbe-Associated Molecular Patterns in Tomato. Methods in Molecular Biology. 1578, 249-261 (2017).
- Gimenez-Ibanez, S., Hann, D. R., Chang, J. H., Segonzac, C., Boller, T., Rathjen, J. P. Differential Suppression of Nicotiana benthamiana Innate Immune Responses by Transiently Expressed Pseudomonas syringae Type III Effectors. Frontiers in Plant Science. 9, 688 (2018).
- Wei, Y., et al. The Ralstonia solanacearum csp22 peptide, but not flagellin-derived peptides, is perceived by plants from the Solanaceae family. Plant Biotechnology Journal. 16 (7), 1349-1362 (2018).
- Melcher, R. L. J., Moerschbacher, B. M. An improved microtiter plate assay to monitor the oxidative burst in monocot and dicot plant cell suspension cultures. Plant Methods. 12, 5 (2016).
- Perraki, A., et al. Phosphocode-dependent functional dichotomy of a common co-receptor in plant signalling. Nature. 561 (7722), 248-252 (2018).
- Yamaguchi, K., Kawasaki, T. Chitin-Triggered MAPK Activation and ROS Generation in Rice Suspension-Cultured Cells. Methods in Molecular Biology. 1578, 309-316 (2017).
- Ortmann, I., Conrath, U., Moerschbacher, B. M. Exopolysaccharides of Pantoea agglomerans have different priming and eliciting activities in suspension-cultured cells of monocots and dicots. FEBS Letters. 580 (18), 4491-4494 (2006).
- Ortmann, I., Sumowski, G., Bauknecht, H., Moerschbacher, B. M. Establishment of a reliable protocol for the quantification of an oxidative burst in suspension-cultured wheat cells upon elicitation. Physiological and Molecular Plant Pathology. 64 (5), 227-232 (2004).
- Dos Santos, A. L. W., El Gueddari, N. E., Trombotto, S., Moerschbacher, B. M. Partially acetylated chitosan oligo- and polymers induce an oxidative burst in suspension cultured cells of the gymnosperm Araucaria angustifolia. Biomacromolecules. 9 (12), 3411-3415 (2008).
- Bressendorff, S., Rasmussen, M., Petersen, M., Mundy, J. Chitin-Induced Responses in the Moss Physcomitrella patens. Methods in Molecular Biology. , 317-324 (2017).
- Lloyd, S. R., Ridout, C. J., Schoonbeek, H. Methods to Quantify PAMP-Triggered Oxidative Burst, MAP Kinase Phosphorylation, Gene Expression, and Lignification in Brassicas. Methods in Molecular Biology. 1578, 325-335 (2017).
- Gómez-Gómez, L., Boller, T. FLS2: An LRR Receptor-like Kinase involved in the perception of the bacterial elicitor flagellin in Arabidopsis. Molecular Cell. 5 (6), 1003-1011 (2000).
- Li, J., et al. Specific ER quality control components required for biogenesis of the plant innate immune receptor EFR. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (37), 15973-15978 (2009).
- Lu, X., et al. Uncoupling of sustained MAMP receptor signaling from early outputs in an Arabidopsis endoplasmic reticulum glucosidase II allele. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (52), 22522-22527 (2009).
- Nekrasov, V., et al. Control of the pattern-recognition receptor EFR by an ER protein complex in plant immunity. EMBO Journal. 28 (21), 3428-3438 (2009).
- Boutrot, F., et al. Direct transcriptional control of the Arabidopsis immune receptor FLS2 by the ethylene-dependent transcription factors EIN3 and EIL1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (32), 14502-14507 (2010).
- Kadota, Y., et al. Direct Regulation of the NADPH Oxidase RBOHD by the PRR-Associated Kinase BIK1 during Plant Immunity. Molecular Cell. 54 (1), 43-55 (2014).
