Summary
Este trabalho descreve dois métodos para quantificar as respostas de defesa em Arabidopsis Arabidopsis thaliana após a exposição aos elicitors imunes: o estouro oxidativo transiente, e a inibição do crescimento de plântulas.
Abstract
As plantas evoluíram um sistema imunológico robusto para perceber patógenos e proteger contra a doença. Este papel descreve dois ensaios que podem ser usados para medir a força da ativação imune no Arabidopsis thaliana de Arabidopsis que segue o tratamento com moléculas do elicitores. Apresentado em primeiro lugar é um método para capturar o estouro oxidativo rápido-induzido e dinâmico, que pode ser monitorado usando um ensaio luminol-baseado. O segundo apresentado é um método que descreve como medir a inibição imune-induzida do crescimento de plântulas. Estes protocolos são rápidos e de confiança, não exigem o treinamento ou o equipamento especializado, e são amplamente utilizados compreender a base genética da imunidade da planta.
Introduction
Para perceber e se defender contra patógenos, as plantas evoluíram com receptores de reconhecimento de padrões ligados à membrana (PRRs) que detectam moléculas microbianas conservadas fora da célula conhecida como padrões moleculares associados a micróbios (MAMPs)1. A ligação de mamps a seus PRRS cognato inicia a sinalização imune quinase-negociada proteína tendo por resultado a resistência de doença do largo-espectro2. Uma das primeiras respostas após a ativação do PRR é a fosforilação e a ativação de proteínas integrais de membrana plasmática respiratória BURST OXIDASE HOMOLOG (RBOH) que catalisam a produção de espécies reativas de oxigênio extracelular (ROS)3 , 4. Ros desempenham um papel importante no estabelecimento de resistência à doença, atuando tanto como mensageiros secundários para propagar a sinalização imune, bem como agentes antimicrobianos diretos5. A primeira observação de um surto oxidativo imune-eliciado foi descrita usando tubérculos de batata de CV. Rishiri após a inoculação de Phytophthora infestans 6. A produção de Eros foi avaliada em diversas espécies vegetais utilizando discos foliares7, culturas de suspensão celular8e protoplastos6. Descrito aqui é um método simples para a produção de ROS desencadeados por padrão em discos foliares de Arabidopsis Arabidopsis thaliana (Arabidopsis).
Como resposta à percepção MAMP, as proteínas ativadas de RbOH catalisam a produção de radicais de superóxido (o2-), radicais hidroxilo (• Oh) e oxigênio singlet (1o2) que são convertidos em peróxido de hidrogênio (H2o 2) no espaço extracelular9. H2o2 pode ser quantificado por quimioluminescência à base de luminol na presença do agente oxidante peroxidase de rábano (HRP)10. HRP oxida H2O2 gerando um íon hidróxido (Oh−) e gás de oxigênio (O2) que reagem com luminol para produzir um intermediário instável que libera um fóton de luz10. A emissão de fótons pode ser quantificada como unidades de luz relativa (RLUs) usando um leitor de microplacas ou Imager capaz de detectar luminescência, que se tornaram peças padrão de equipamentos na maioria dos laboratórios moleculares. Medindo a luz produzida sobre um intervalo de 40-60 minutos, um estouro oxidativo transiente pode ser detectado tão cedo quanto 2-5 minutos após o tratamento do elicitores, atingindo o pico em 10-20 minutos, e retornando aos níveis básicos após ~ 60 minutos11. A luz cumulativa produzida sobre este curso do tempo pode ser usada como uma medida da força imune que corresponde à ativação de proteínas de RBOH12. Convenientemente, este ensaio não exige o equipamento especializado ou a preparação incômoda da amostra.
Pico logo após a detecção da MAMP, a explosão oxidativa é considerada uma resposta imune precoce, juntamente com a ativação do MAPK e a produção de etileno5. As respostas imunes posteriores incluem reprogramação transcricional, fechamento estomático e deposição de calose2,5. A exposição prolongada aos MAMPs ativa continuamente a sinalização imune energeticamente dispendiosa, resultando na inibição do crescimento vegetal, indicativo de um trade-off entre o desenvolvimento e a imunidade13. A inibição do crescimento de plântulas desencadeada por padrão (SGI) é amplamente utilizada para avaliar a produção imune em Arabidopsis e tem sido parte integrante da identificação de vários componentes-chave da sinalização imune, incluindo PRRS 14,15 ,16. Conseqüentemente, este papel apresenta adicionalmente um ensaio para o SGI Pattern-desencadeado em Arabidopsis, por meio de que as plântulas são crescidas em placas do multi-poço que contêm meios ou meios padrão suplementados com um elicitores imune por 8-12 dias e pesaram então utilizando uma escala analítica.
Para demonstrar como os ensaios ROS e SGI podem ser usados para monitorar a sinalização mediada por PRR, três genótipos que representam diferentes saídas imunes foram escolhidos: (1) o tipo selvagem de adesão de Arabidopsis Columbia (Col-0), (2) o dominante-negativo bak1-5 mutante em que o coreceptor multi-funcional de PRR brassinosteroid insensivel 1-associado quinase 1 (BAK1) é não-funcional na sinalização imune17,18, e (3) o mutante cpk28-1 recessive, que não possui o proteínas reguladoras proteína quinase dependente de cálcio 28 (CPK28) e monitores intensificados respostas imunes-desencadeadas19,20. Os ensaios ROS e SGI são apresentados em resposta a um epítopo de peptídeo elf18 produzido sinteticamente de fator de alongamento bacteriano tu (EF-tu), reconhecido em Arabidopsis pelo receptor PRR EF-tu (EFR)15. Estes protocolos podem ser usados com outros indutores imunes tais como a proteína da motilidade bacteriana flagelina14 ou proteínas endógenas do elicitor da planta (atpeps)16, entretanto, deve-se notar que a responsividade da planta difere dependendo do elicitores21. Juntos, os ensaios ROS e SGI podem ser utilizados para a avaliação rápida e quantitativa das respostas mediadas pelo PRR precoce e tardia.
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Protocol
1. detecção de ROS estourou em discos de folhas de Arabidopsis após Elicitação imunológica
- Crescimento e manutenção de plantas.
- Para sincronizar a germinação, estratifique as sementes de Arabidopsis suspendendo aproximadamente 50 sementes em 1 ml de agar estéril 0,1% [w/v] e armazene a 4 ° c (sem luz) por 3-4 dias.
Nota: estratifique um controle de fundo de tipo selvagem (por exemplo, Col-0) e genótipos com saídas imunes altas e baixas (por exemplo, cpk28-1 e bak1-5, respectivamente) para servir como controles internos. - Semear sementes no solo e germinar padrão de curto-dia condições (22 ° c, 10 h luz, 150 mE/m2/s intensidade de luz, e 65-70% umidade relativa).
- Após aproximadamente 7 dias, use fórceps para transplantar seedlings individuais aos potenciômetros novos, separados por pelo menos 4 cm para permitir o desenvolvimento cheio da roseta. Transplante 6-12 mudas por genótipo e retorno às condições padrão de curto-dia. Regularmente água e fertilizar plantas (1 g/L de 20-20-20 fertilizante a cada 2 semanas).
- Para sincronizar a germinação, estratifique as sementes de Arabidopsis suspendendo aproximadamente 50 sementes em 1 ml de agar estéril 0,1% [w/v] e armazene a 4 ° c (sem luz) por 3-4 dias.
- Colete discos foliares em placas 96-well para a recuperação durante a noite.
- Em 4-5 semanas após a germinação (Figura 1a), use um perfurador afiado da biópsia de 4 milímetros para remover um disco da folha por a planta, evitando a meados de-veia e sendo cuidadoso limitar o ferimento (Figura 1b). Coloque os discos foliares em uma placa de luminômetro 96-well não utilizada contendo 100 μL de ddH2o com o lado adaxial voltado para cima para evitar a dessecação22 (Figura 1C). Se a avaliação de vários elicitors, remover 1 folha de disco da mesma folha para cada tratamento elicitores.
Nota: folhas de amostra que são totalmente expandidas, terceira a quinta da parte superior da roseta, e aproximadamente o mesmo tamanho e idade para limitar a variabilidade. Se possível, corte discos de folhas ao meio usando uma lâmina de barbear antes da recuperação durante a noite, pois isso aumenta a área de superfície exposta à solução de elicitores23. - Recupere durante a noite na temperatura ambiente para evitar a interferência de ROS produzidos por ferimento durante a coleta de discos foliares. Cubra as placas com uma tampa para evitar a evaporação.
- Em 4-5 semanas após a germinação (Figura 1a), use um perfurador afiado da biópsia de 4 milímetros para remover um disco da folha por a planta, evitando a meados de-veia e sendo cuidadoso limitar o ferimento (Figura 1b). Coloque os discos foliares em uma placa de luminômetro 96-well não utilizada contendo 100 μL de ddH2o com o lado adaxial voltado para cima para evitar a dessecação22 (Figura 1C). Se a avaliação de vários elicitors, remover 1 folha de disco da mesma folha para cada tratamento elicitores.
- Realize o tratamento de elicitores e meça a produção de ROS.
- Programe o leitor de placas antes de adicionar a solução de reação, pois isso reduzirá o tempo entre o início do burst de ROS e as primeiras medições gravadas. Use um software comercial que seja apropriado para o leitor da placa. No nosso caso (consulte o Sumário), clique em configuraçõese selecione o cartucho LUM96 e o tipo de leitura cinética . Clique na categoria área de leitura e arraste para selecionar um subconjunto de poços ou a chapa inteira a ser lida. a aba do Pmt e do sistema ótico , ajuste o tempo da integração a 1.000 MS. na guia timing , defina o tempo de execução total para 40-60 min e o intervalo para 2 min.
- Retire a água de cada poço usando uma pipeta multicanal.
Nota: Não perfure discos foliares, pois isso pode provocar tensões de ferimento e resultar em saídas de ROS mais variáveis. - Prepare uma solução de reacção contendo 100 μM de luminol, 10 μg/mL de HRP, e a concentração desejada de elicitores (por exemplo: elf18 a 1 nM, 10 nM, 100 nM ou 1.000 nM) em ddH2o estéril utilizando 10 ml de solução para placa de 1 96 poços.
Nota: dissolva peptídeos liofilizados em H estéril2o em tubos de baixa ligação para fazer um estoque de 10 mm, Flash-Freeze no líquido N2, e armazene em-80 ° c. Quando estiver pronto para usar, diluir estoques em H2o estéril para gerar um estoque de trabalho de 100 μm e armazenar a-20 ° c. - Utilize uma pipeta multicanal para dispensar 100 μL da mistura de reacção a cada poço, acrescentando a solução a todos os discos foliares do mesmo tratamento ao mesmo tempo22. Inclua uma reação de controle (sem elicitor) para cada genótipo para avaliar os níveis basais de ROS na ausência de Elicitação. Meça imediatamente a emissão clara para todos os comprimentos de onda no espectro visível usando um leitor do microplate.
Nota: Prepare e aplique a solução de reacção pouca luz, pois luminol e HRP são reagentes sensíveis à luz. Manter os reagentes no gelo ou a-20 ° c, excepto em utilização. - Meça a emissão clara com um tempo da integração de 1.000 MS em intervalos de 2 minutos durante um período de 40-60 minutos em um leitor da microplaca a fim capturar o estouro oxidativo dinâmico (Figura 1D).
Nota: Use um tempo de integração mais longo para melhorar a sensibilidade do ensaio11, ao assegurar-se de que todas as amostras em uma placa 96-well possam ser medidas dentro de um intervalo.
- Interpretação de dados.
- Para cada genótipo, use um aplicativo de planilha para calcular a contagem média de fótons e o erro padrão em cada ponto de tempo e exiba a produção de ROS em função do tempo usando um gráfico de dispersão.
Onde t = cada ponto de tempo - Alternativamente, somar as contagens de fótons para cada disco de folha e apresentar a média desses valores para cada genótipo usando um gráfico de barras com barra de erro padrão ou uma caixa e plotagem de Whisker.
- Para cada genótipo, use um aplicativo de planilha para calcular a contagem média de fótons e o erro padrão em cada ponto de tempo e exiba a produção de ROS em função do tempo usando um gráfico de dispersão.
2. ensaio de inibição do crescimento de plântulas
- Esterilizar sementes e semear em placas de Murashige e Skoog (MS).
- Prepare meio estéril de meia-força (0,5 x) MS (2,16 g/L) contendo 0,8% de agar [w/v]. Despeje a mídia em placas (90 x 15 mm) em uma capa de fluxo laminar.
- Esterilizar aproximadamente 100 sementes em um tubo de microcentrífuga por lavagem com 1 mL de etanol a 70% por 2 min e remover por aspiração. Adicionar 1 mL de 40% lixívia e suavemente rocha por 17 minutos à temperatura ambiente. Remova a lixívia por aspiração e lave três vezes em 1 mL de água estéril durante 5 min. ressuscitem em 1 mL de agar estéril de 0,1%.
Nota: Alternativamente, use um protocolo de esterilização de sementes de gás cloro24. - Semeie aproximadamente 100 sementes por o genótipo em placas do ágar do MS usando uma pipeta e um selo com fita do micropore em uma capa do fluxo laminar.
Nota: Evite colocar sementes em estreita proximidade, pois isso tornará as mudas de transplante difíceis mais tarde. - Estratifique as sementes colocando as placas a 4 ° c (sem luz) durante 3-4 dias para sincronizar a germinação (Figura 2a).
- Transplante de mudas em 48-well placas contendo peptídeos imunológicos elicitores.
- Após a estratificação, mova as placas para a luz em condições de dia curto (22 ° c, 10 h de luz, 150 mE/m2/s de intensidade de luz e 65-70% de umidade relativa) para 3-4 dias para permitir a germinação.
- Em uma capa de fluxo laminar, prepare diluições de peptídeo de elicitores (0 nM, 1 nM, 10 nM, 100 nM e 1.000 nM) em meios líquidos estéreis de 0,5 x MS contendo 1% de sacarose [w/v], usando 25 mL de MS para cada placa de 48 poços. Prepare as placas pipetando 500 μL de meio líquido MS ou meio MS contendo peptídeos por poço. Se disponível, use um pipetador da repetição para a preparação da placa para agilizar o processo.
Nota: para cada genótipo, cultivar mudas em MS sem elicitores para dar conta de quaisquer diferenças inerentes ao crescimento das mudas. - Usando fórceps estéril cuidadosamente transplantar um seedling a cada poço do mesmo tamanho e idade, assegurando que não há nenhum dano à muda ou à ruptura à raiz e que a raiz está submersa nos meios. Para cada genótipo, transplantar um mínimo de 6-8 mudas em cada diluição peptídica (Figura 2b).
Nota: mudas de transplante aos 4 dias após a germinação, pois as raízes curtas são mais fáceis de manipular, e as mudas mais velhas podem produzir resultados menos ideais. - Sele as placas com fita do micropore e mova-se para trás à luz circunstâncias padrão do short-dia (22 ° c, luz de 10 h, 150 mim/m2/s intensidade de luz, e umidade relativa de 65-70%). Permitir que as mudas cresçam por 8-12 dias.
- Determine a inibição do crescimento percentual.
- Retire cuidadosamente as mudas de 48-well placas e seque por dabbing na toalha de papel. Pesar mudas em uma escala analítica e valores de registro. Se disponível, use uma escala analítica equipada com saída USB para gravar valores de peso fresco em uma planilha. Antes de pesar as mudas, tire uma foto para exibir visualmente a inibição do crescimento (Figura 2C).
- Determine a inibição do crescimento percentual de mudas tratadas com elicitor em comparação com as mudas cultivadas apenas em MS (Figura 2D) da seguinte forma:
- Plotar dados usando um gráfico de barra com barras de erro padrão ou usando uma plotagem de caixa e Whisker para exibir melhor a variância inter-experimental.
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Representative Results
Mutantes cpk28-119,25 e bak1-517,18 plantas foram utilizadas para demonstrar os desfechos esperados para genótipos com respostas imunes altas e baixas, respectivamente, em burst oxidativo e SGI ensaios em relação a um controle de fundo de tipo selvagem (Col-0). Para avaliar os efeitos dose-dependentes, uma série de diluição do peptide 10-fold (1-1000 nanômetro) de elf18 foi usada. Como esperado, as linhas de perda-de-função cpk28-1 apresentaram maior acumulado (Figura 3a) e média (Figura 3B) da explosão de Ros em comparação com a Col-0, enquanto bak1-5 exibiu redução da produção de Eros em concentrações entre 10 nm e 1.000 nM (Figura 3). Diferenças esperadas no SGI podem ser discerbem entre todos os genótipos cultivados em 100 nM e 1.000 nM elf18 (figura 4a), que também podem ser observados visualmente no tratamento 1.000 nm Elf18 (Figura 4B). Característica da sinalização imune elevada, os mutantes cpk28-1 eram marcadamente menores do que Col-0 quando crescidos em 1.000 nanômetro elf18, quando os mutantes bak1-5 exibiam a inibição fraca do crescimento relativo a Col-0 devido à deteção interrompida de MAMP.
Figura 1. Ensaio de Burst oxidativo baseado em luminol após a indução imune em Arabidopsis. (A) cresça plantas no solo em condições do dia curto por 4-5 semanas. (B) Use um perfurador de biópsia de 4 mm para coletar discos foliares de cada planta e recuperar durante a noite em ddH2O. (C) adicionar solução de reação (100 μm luminol, 10 μg/ml HRP, e a concentração desejada de elicitor) e medir a emissão de luz sobre 40-60 min, em intervalos de 2 min com um tempo de integração de 1.000 MS. (D) determine contagens médias de fótons para cada genótipo em relação a Col-0 (mostrada em verde), um alto controle de ROS, como cpk28-1 (mostrado em roxo), e um baixo controle de Ros, como bak1-5 (mostrado em laranja). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Ensaio elicitor-induzido da inibição do crescimento do seedling em Arabidopsis. (A) plantar mudas em agar MS e crescer por 3-4 dias em condições padrão de curto-dia. (B) mudas de transplante para placas de 48 poços contendo meio MS ou MS contendo diferentes concentrações de elf18. (C) após 8-12 dias, avaliar visualmente o tamanho das mudas e, em seguida, medir o peso fresco usando uma escala analítica para determinar a inibição do crescimento percentual. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Explosão oxidativa elf18-induzida representativa em três genótipos de Arabidopsis . Plantas de quatro semanas de idade foram tratadas com uma série de diluição de elf18 (0 nM ' mock ', 1 nM, 10 nM, 100 nM e 1.000 nM). Col-0 representa o controle de fundo do tipo Wild, com cpk28-1 e bak1-5 representando fenótipos de Ros altos e baixos, respectivamente. (A) contagem total de fótons representada como unidades de luz relativas após tratamento elf18 (n= 6 discos foliares de plantas independentes). As diferenças estatísticas são representadas por letras minúsculas e calculadas por meio de ANOVA unidirecional com teste de diferença significativa honesta de Tukey post-hoc (p< 0,05). (B) contagem média de fótons, representada como unidades de luz relativa, mais de 40 min após o tratamento elf18 (n= 6 discos foliares de plantas independentes). As barras de erro representam o erro padrão da média. Resultados semelhantes foram obtidos em dois dos três experimentos. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Inibição representativa do crescimento da plântula induzida por elf18 em três genótipos de Arabidopsis . Mudas de tipo selvagem (Col-0), cpk28-1e bak1-5 foram cultivadas em uma série de diluição de 10 vezes (0-1.000 nm) de elf18. (A) a inibição do crescimento percentual foi calculada comparando-se o peso de mudas individuais cultivadas em elf18 (n= 6 mudas individuais) ao peso médio das mudas do mesmo genótipo cultivado apenas em SM (' mock ') (n= 6 mudas individuais) durante um período de 10 dias. As diferenças estatísticas são representadas por letras minúsculas e calculadas por meio de ANOVA unidirecional com teste de diferenças significativas honestas de Tukey (p< 0,05). (B) demonstração visual de SGI em duas mudas representativas de Col-0, cpk28-1 e bak1-5 em resposta a concentrações crescentes de elf18. Resultados semelhantes foram obtidos em três dos quatro experimentos. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Este trabalho descreve dois métodos para a avaliação de respostas imunes desencadeadas por padrão em Arabidopsis, oferecendo abordagens quantitativas para avaliar a produção imune sem o uso de equipamentos especializados. Em combinação, ROS e SGI acionados por padrão podem ser usados para avaliar respostas precoces e tardias à percepção de micródios, respectivamente.
A maior limitação do ensaio de explosão oxidativa é a variabilidade. Por razões que não são completamente compreendidas, RLUs absolutos muitas vezes diferem por uma ordem de magnitude entre experimentos. Como a variabilidade entre experimentos é alta, é aconselhável incluir controles de referência internos com altas (por exemplo, cpk28-1) e baixas (por exemplo, bak1-5) explosões oxidativas, além de um controle de tipo selvagem (por exemplo, Col-0). No entanto, medidas podem ser tomadas para aumentar a reprodutibilidade entre experimentos. As condições ambientais, como temperatura, umidade, fotoperíodo e intensidade da luz, devem ser idênticas entre as repetições. A idade e a saúde das plantas também devem ser consideradas na amostragem. Os discos foliares podem ser recolhidos a partir de plantas que estão entre 4 e 7 semanas de idade cultivadas em condições de dia curto (6-10 horas de luz). Curiosamente, os resultados mais consistentes foram encontrados com plantas com mais de 6 semanas após a germinação, mas ainda não florescimento ou senescing. É importante cultivar plantas em câmaras ambientais limpas de modo que não sejam expor às pragas comuns da estufa tais como o mildew oídio ou os insetos de mastigação. Como as mudas para SGI são cultivadas em meios de MS estéreis e, por um período mais curto, as flutuações ambientais não são, em grande parte, uma preocupação. No entanto, a variação pode ocorrer se as mudas ficarem danificadas durante o transplante, se as mudas selecionadas para os tratamentos de elicitores forem de tamanhos diferentes, ou se a mídia de crescimento se tornar contaminada. Recomenda-se incluir também os genótipos de controle de referência internos descritos acima em experimentos com SGI.
A concentração de elicitor é outra consideração importante na condução de ensaios imunológicos. Os elicitors são percebidos por PRRs resultando em um rápido e robusto ROS Burst pico 10-20 minutos após o tratamento de elicitores (Figura 2b). No entanto, a magnitude da explosão é dependente tanto do elicitores como do genótipo da planta. Portanto, uma série de dose de elicitores, conforme apresentado na Figura 3 e na Figura 4, é recomendada para identificar uma concentração de elicitores adequada. Ros acionados por padrão também podem ser analisados por inoculando discos foliares com micróbios vivos23,26 ou extratos microbianos26,27,28. Por exemplo, explosões de ROS transientes e dependentes da dose podem ser detectadas em Arabidopsis em resposta a patamares virulentos de Pseudomonas-sifas, atingindo 35-40 minutos e alcançando níveis basais aproximadamente 70 minutos após a Elicitação 23 anos de , 29. em resposta às bactérias avirulentas29 ou ao patógeno fúngico P. infestans30,31, um segundo acúmulo mais pronunciado de Ros é produzido que pode ser monitorado 6-10 horas após Inoculação. Para elicitors mais fracos, como a quitina fúngica32 ou quitosana33, indicadores luminescentes mais sensíveis podem ser usados, como o derivado de luminol L-012, no entanto, o sinal de fundo produzido é muitas vezes maior32, 34. importante, o ecotipo da planta igualmente ditará sua compreensibilidade aos indutores específicos35,36. Por exemplo, enquanto a flagelina bacteriana é capaz de provocar respostas imunes em vários ecotipos de Arabidopsis incluindo Col-0, o ecotipo wassilewskija (WS-0) expressa uma variante não funcional do PRR flagelina-SENSING 2 (FLS2) e é Portanto, insensível a flagelina14,37.
Ros imuno-induzidos também podem ser observados em discos foliares de outras plantas dicotiledóneas, incluindo Brassica napus38, tomate39, Nicotiana javanica22,40,41e várias outras espécies solanáceas41. Ensaios de detecção de Ros com base em luminol adicionais foram desenvolvidos para plantas que utilizam extratos teciduais10, culturas de suspensão celular8,42e protoplastos43, e são particularmente úteis em sistemas onde os protocolos do disco da folha não são eficazes42. Por exemplo, explosões de Ros induzidos por elicitor têm sido descritas usando culturas de suspensão celular no arroz42,44 e trigo45,46, bem como o gymnosperm Araucaria angustifolia 47 e o musgo physcomitrella patens48. SGI não tem sido usado como amplamente para medir a sinalização imune. Entretanto, a inibição do crescimento em resposta aos indutores foi demonstrada em N. javanica41 e em B. napus38,49. A inibição rápida do crescimento foi demonstrada igualmente no patens do P. em resposta à quitina fungosa que ocorre dentro de 2 minutos da exposição, que pode ser observada usando a fotografia do tempo-lapso48.
Com a modificação, os ensaios de SGI e de Burst oxidativo podem ser usados para telas de alta taxa de transferência para identificar reguladores imunes. Por exemplo, populações mutagenizadas de Arabidopsis podem ser cultivadas em MS médio e inundados com indutores para identificar mutantes insensível15,50,51,52,53. Alternativamente, as populações mutagenizadas podem ser avaliadas para ROS desencadeados por elicitor, que foi executado com sucesso com ambos os discos-folha54 e plântulas inteiras cultivadas em placas de MS19. Outro método de triagem útil é a expressão transitória de proteínas em N. javanica para análise de Ros antes do desenvolvimento de linhas transgênicas de superexpressão22,40,55. No entanto, a variação intraexperimental é maior do que em linhas de Arabidopsis estáveis devido à expressão de proteína diferencial em N. javanica deixa22, embora isso possa ser parcialmente atenuado pela infiltração de referência os controles na mesma folha que as amostras experimentais.
Em resumo, a explosão oxidativa imune-induzida e os ensaios do SGI são métodos rápidos e de confiança para avaliar a sinalização PRR-negociada em Arabidopsis. Esses métodos podem ser estendidos para outros sistemas e usados para telas em grande escala para descobrir novos reguladores imunológicos.
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Disclosures
Nenhum.
Acknowledgments
O trabalho em nosso laboratório é financiado através do programa de descoberta de recursos naturais e engenharia de pesquisa do Canadá (NSERC), a Fundação Canadense para a inovação John R. Evans Leader ' s Fund, e da Queen ' s University. KS e é são apoiados por tandem Ontario bolsas de pós-graduação e NSERC Canadá bolsas de pós-graduação para estudantes de mestrado (CGS-M).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 20-20-20 Fertilizer | Plant Prod | 10529 | Mix 1g/L in water and apply to plants every 2 weeks for optimal growth. |
| 4 mm Biopsy Punch | Medical Mart | 232-33-34-P | A cork borer set with a 0.125 cm^2 surface area can also be used. |
| 48-Well Sterile Plates with Lid | Sigma-Aldrich | CLS3548 | |
| Analytical Scale with Draft Sheid | VWR | VWR-225AC | Any standard analytical scale can be used for growth inibition assays, however, a direct computer output is optimal. |
| BioHit mLine Mechanical 12 Multichannel Pipette (30-300 uL) | Sartorius | 725240 | Any multichannel pipette can be used, as can a single pipetter if necessary. |
| elf18 (Ac-SKEKFERTKPHVNVGTIG) | EZ Biolab | cp7211 | Store 10 mM stock peptide at -80C in low protein binding tubes. When thawed, store 100 uM working stock at -20C. |
| Forceps | Fisher Scientific | 22-327379 | |
| Horseradish Peroxidase | Sigma-Aldrich | P6782 | Dissolve in pure water. Store at -20C and away from light. |
| Luminol | Sigma-Aldrich | A8511 | Dissolve in DMSO. Store at -20C and away from light. |
| Murisage and Skoog Basal Salts | Cedarlane Labs | MSP09-100LT | Store at 4C. |
| Soil | SunGrow Horticulture | Sunshine Mix #1 | Other soil types can also be used to grow Arabidopsis. Mix with water when filling pots. |
| SpectraMax Paradigm Multi Mode Microplate Reader with LUM Module | Molecular Devices | Must request a quote | Any plate reader capable of detecting luminescence can be used for these assays. |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389-1KG | Store at room temperature. |
| White Polystyrene 96-Well Plates | Fisher Scientific | 07-200-589 |
References
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