Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biochemistry

Robuuste vergelijking van eiwitniveaus over weefsels en in de gehele ontwikkeling met behulp van gestandaardiseerde kwantitatieve westelijke bevlekken

doi: 10.3791/59438 Published: April 9, 2019
* These authors contributed equally

Summary

Deze methode beschrijft een robuuste en reproduceerbare aanpak voor het vergelijken van eiwitniveaus in verschillende weefsels en bij verschillende ontwikkelings timepoints met behulp van een kwantitatieve westelijke bevlekkende standaardbenadering.

Abstract

Westelijke bevlekken is een techniek die wordt gebruikt bij het detecteren en kwantificeren van eiwit expressie. Loop der jaren heeft deze techniek geleid tot veel vooruitgang in zowel fundamenteel en klinisch onderzoek. Echter zoals met vele soortgelijke experimentele technieken, wordt het resultaat van westelijke vlek analyses gemakkelijk beïnvloed door de keuzes in het ontwerp en de uitvoering van het experiment. Specifieke huishouding eiwitten hebben van oudsher gebruikt om te normaliseren eiwitniveaus voor kwantificering, echter deze hebben een aantal beperkingen en hebben daarom steeds meer bekritiseerd in de afgelopen paar jaar. Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol die we hebben ontwikkeld zodat ons ertoe complexe vergelijkingen van eiwit expressie variatie in verschillende weefsels, Muismodellen (inclusief ziekte modellen) en ontwikkelingsstoornissen timepoints. Met behulp van een fluorescerende totaal eiwit vlek en introductie van het gebruik van een interne standaard wordt geladen, is het mogelijk om de bestaande beperkingen in het aantal monsters die binnen experimenten kunnen worden vergeleken en systematisch vergelijken eiwitniveaus over een waaier van experimentele omstandigheden. Deze aanpak breidt het gebruik van traditionele westelijke vlek technieken, waardoor onderzoekers beter verkennen eiwituitdrukking in verschillende weefsels en monsters.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Westelijke bevlekken is een techniek die wordt gebruikt bij het detecteren en kwantificeren van eiwit expressie, met inbegrip in weefsel homogenates of extracten. Loop der jaren heeft deze techniek geleid tot veel vooruitgang in zowel fundamenteel en klinisch onderzoek, waar het kan worden gebruikt als een diagnostisch hulpprogramma te identificeren van de aanwezigheid van ziekte1,2. Westelijke bevlekken werd het eerst beschreven in 1979 als een methode voor het overbrengen van eiwitten van polyacrylamide gels naar nitrocellulose bladen en vervolgens het visualiseren van eiwitten met behulp van secundaire antilichamen die waren ofwel radioactief gelabelde of geconjugeerd met fluoresceïne of peroxidase3. Door de ontwikkeling van commercieel beschikbare kits en apparatuur, zijn westelijke bevlekkende methoden steeds meer gestandaardiseerd en vereenvoudigd door de jaren heen. Inderdaad, de techniek is gemakkelijk nu uitgevoerd door wetenschappers met uiteenlopende achtergronden en niveaus van ervaring. Echter zoals met vele soortgelijke experimentele technieken, wordt het resultaat van westelijke vlek analyses gemakkelijk beïnvloed door de keuzes in het ontwerp en de uitvoering van het experiment. Het is daarom belangrijk, dat de toegankelijkheid van gestandaardiseerde westelijke bevlekkende methoden niet de behoefte aan zorgvuldige experimentele planning verdoezelen en ontwerp. Experimentele aspecten omvatten, maar zijn niet beperkt tot, monster voorbereiding en behandeling, selectie en validatie van antilichamen voor eiwit detectie en gel-naar-membraan spuitrendement van met name kleine of grote (< 10 of > 140 kDa) eiwitten4,5,6,7,8,9. Eiwit kwaliteit van het oorspronkelijke monster speelt een belangrijke rol bij de bepaling van het resultaat van de daaropvolgende westelijke vlekkenanalyse. Zoals eiwitten kan worden geëxtraheerd uit een grote verscheidenheid van monsters en bronnen, met inbegrip van weefsels van dierlijke modellen, cellijnen en post mortem menselijke weefsels, is consistentie in afhandeling en verwerking vereist om reproduceerbare resultaten te verkrijgen. Bijvoorbeeld, als de langetermijnopslag van monsters voor eiwit extractie vereist is, is het belangrijk om te beseffen dat, hoewel eiwit over het algemeen stabiel bij-80 ° C is, verschillen in eiwitstabiliteit uitgepakte eiwitten en intact weefsels bij-80 ° C geweest gerapporteerde10. Bovendien, met het oog op een reproduceerbare ramingen van de hoeveelheden eiwit, consistente homogenisering van de monsters is cruciaal. Optimaliseren van verschillende lysis buffers en homogenisering methoden (bijvoorbeeld handmatige homogenisering in vergelijking met geautomatiseerde methoden) kan nodig zijn voordat u begint een grootschalige kwantitatieve experiment.

Normalisatie strategieën om te corrigeren voor eiwit laden en kwantificering variabiliteit zijn essentieel voor het verkrijgen van robuuste, kwantitatieve resultaten van eiwit expressie. Huishouden eiwitten zoals β-actine, α-tubuline, β-tubuline en glyceraldehyde-3-fosfaat dehydrogenase (GAPDH) hebben van oudsher gebruikt om te normaliseren eiwitniveaus voor kwantificering. Echter, normalisatie aan specifieke huishouding eiwitten voor kwantificering doeleinden is steeds meer bekritiseerd over de afgelopen paar jaar11,12. Bijvoorbeeld, kunt de uitdrukking van de huishouding eiwitten wijzigen in verschillende ontwikkelingsstadia13,14, over weefsels van dezelfde dieren4en onder verschillende ziekte voorwaarden4,15 ,16,17. Daarom is het gebruik van specifieke huishouding eiwitten beperkt de mogelijkheden van het maken van meer complexe vergelijkingen tussen eiwit expressie uit verschillende weefsels, op verschillende tijdstippen en onder verschillende experimentele omstandigheden. Een alternatief voor huishouden eiwitten aan besturingselement voor eiwit laden variatie is het gebruik van een totale proteïne vlek (TPS) dat etiketten en visualiseert alle eiwitten aanwezig in een monster. TPS kunt signaal normalisering op basis van de totale proteïne laden in plaats van de niveaus van één specifieke proteïne en dus kwantificering van TPS signaal moet zijn vergelijkbaar en reproduceerbare ongeacht de experimentele conditie, monster type of developmental timepoint . Voorbeelden van totaal eiwit vlekken zijn Ponceau S, vlek-vrij gels Coomassie R-350, Sypro-Ruby, Epicocconone, Amydo Black en Cy5 (herzien in ref. 18). Elk van deze methoden heeft specifieke voordelen en beperkingen en selectie methode hangt af van de tijd en hulpmiddelen beschikbaar, evenals de experimentele opzet4,18.

Naast het gebruik van een TPS om te corrigeren voor binnen-membraan laden en kwantificering variabiliteit, wellicht te vergelijken tussen verschillende membranen, met name bij het uitvoeren van grootschalige eiwit expressie analyse monsters. Echter kan variabiliteit in factoren zoals antilichamen bindende efficiëntie en totaal eiwit vlek intensiteit leiden tot verdere variabiliteit tussen de eiwitsteekproeven die op aparte gels zijn geanalyseerd en membranen. Voor robuuste kwantificering in deze situatie moet het dan ook om een verdere normalisatie stap om de variabiliteit tussen-membraan te verklaren. Dit kan worden bereikt door een interne laden standaard op elk van de afzonderlijk geanalyseerde membranen die constant wordt gehouden over experimenten. Deze standaard kan de vorm aannemen van een eiwit lysate die in voldoende hoeveelheden worden gebruikt in alle membranen opgenomen in het experiment kan worden verkregen. Hier, gebruiken we een lysate van muis hersenen (verkregen uit 5 dag oud besturingselement muizen), omdat de hersenen is gemakkelijk gehomogeniseerd en de verkregen eiwit lysate bevat een aanzienlijke hoeveelheid eiwit met een hoge concentratie. Laden van een interne standaard in drievoud kunt monsters op aparte membranen worden genormaliseerd en vergeleken rechtstreeks.

Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol die we hebben ontwikkeld zodat ons ertoe complexe vergelijkingen van eiwit expressie variatie in verschillende weefsels, Muismodellen (inclusief ziekte modellen) en ontwikkelingsstoornissen timepoints19. Door een fluorescerende TPS te combineren met het gebruik van een interne laden standaard, konden we bestaande beperkingen in het aantal monsters en experimentele omstandigheden die binnen een enkele experiment kunnen worden vergeleken. Deze aanpak breidt het gebruik van traditionele westelijke vlek technieken, waardoor onderzoekers beter verkennen eiwituitdrukking in verschillende weefsels en monsters.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Weefsels voor deze procedure werden verkregen uit dierlijke studies die werden goedgekeurd door het Comité van interne ethiek aan de Universiteit van Edinburgh en werden uitgevoerd in overeenstemming met de institutionele en UK Home Office verordeningen onder het gezag van relevante persoonlijke en project licenties.

Opmerking: Dit protocol is geoptimaliseerd met behulp van gestandaardiseerde, commercieel beschikbare kits en reagentia teneinde reproduceerbaarheid (Zie Tabel van materialen).

1. bereiding van de monsters

  1. Eiwit extractie
    1. Overdracht module-bevroren cel of weefselmonsters van-80 ° C op droog ijs, ontdooien op ijs, en wassen zoals vereist met ijs koud 1 x-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) (voor meer informatie over weefsels en PBS wast, Zie tabel 1). Vermijd geen onnodige bevriezen-ontdooien cycli als dit zal invloed hebben op eiwit kwaliteit.
    2. Toevoegen van radioimmunoprecipitation assay (RIPA) buffer (25 mM Tris-HCl (pH 7,6), 150 mM NaCl, 1% NP-40, 1% natrium deoxycholate, 0,1% SDS) met 1 x proteaseinhibitor aan elk monster, met behulp van de optimale bedrag per weefsel gewicht (Zie tabel 1 voor aanbevelingen).
      Opmerking: Afhankelijk van de toepassing, de aard en hoeveelheid van homogenisering buffer wellicht verdere optimalisatie.
    3. Gebruik een hand-held elektrische homogenizer met een polypropyleen stamper om te homogeniseren weefselmonsters. Tussen elk monster, de stamper in tweemaal gedestilleerd water wassen en drogen met een schone tissue. Het wijzigen van de stamper tussen verschillende experimentele omstandigheden en weefsels.
    4. Laat de monsters op het ijs gedurende 10 minuten na homogenisatie. Centrifugeer de monsters op > 10.000 x g bij 4 ° C gedurende 10 minuten.
    5. Overbrengen in het supernatant een nieuwe buis op ijs zonder de pellet te verstoren. De bovendrijvende substantie is de eiwitSteekproef. Winkel de uitgepakte eiwit bij-80 ° C of direct overgaan tot het meten van de eiwitconcentratie.
  2. Kwantificering en normalisering van de eiwitconcentratie
    1. Meet de eiwitconcentratie met behulp van een bicinchoninic zuur (BCA) test. Een mix van BCA assay volgens de instructies van de fabrikant in een 96-Wells optische plaat met behulp van 200 µL van BCA mix per goed voor te bereiden.
      Opmerking: Andere methoden zoals Lowry en Bradford testen een kwantificering kunnen ook worden gebruikt om te bepalen van de eiwitconcentratie, zolang de eiwitconcentratie is gekwantificeerd consequent over experimenten.
    2. Bereiden bovien serumalbumine (BSA) normen op toenemende concentraties in drievoud en voeg 1 µL van elke eiwitSteekproef in tweevoud. Incubeer de 96-wells-plaat in een voorverwarmde warmte blok bij 60 ° C gedurende 10 minuten of langer als de eiwitconcentratie verwachting laag.
    3. Na incubatie het meten van de absorptie bij 560 nm met behulp van een afleesapparaat.
    4. Exporteer de plaat lezer metingen en de eiwitconcentratie berekenen door de waarden van de gemiddelde absorptie van elke steekproef aan een standaard curve verkregen met behulp van de standaard eiwit te vergelijken. De R-kwadraatwaarde voor de standaard curve moet groter dan of gelijk aan 0.98 te monster eiwitconcentratie nauwkeurig te schatten.
    5. Normaliseren de hoeveelheid eiwit door het opstellen van verdunningen van EiwitSteekproeven in monster (buffer) en ultrapure water. Het totale volume kan worden aangepast afhankelijk van het soort gel gebruikt. Laden van 30 µg eiwit per lane als een beginbedrag wordt aanbevolen. Toevoegen van reductiemiddel zoals dithiothreitol (DTT; eindconcentratie 5 mM) of bèta-mercaptoethanol (eindconcentratie 200 mM) aan elk monster zoals vereist. Pipetteer onverdund bèta-mercaptoethanol in een zuurkast.
    6. Incubeer de monsters in een blok van warmte bij 70 ° C gedurende 10 min. de monsters op ijs, vortex en spin down kort gezegd om te verzamelen. Houd op ijs tot het laden van de gel.

2. gelelektroforese van EiwitSteekproeven

  1. Apparaat en gel instellen
    1. Setup een helling van de Bis-Tris geprefabriceerd 4 – 12% gel (Zie Tabel van materialen) in het gel-elektroforese kamer-systeem. Spoel de gels met tweemaal gedestilleerd water vóór gebruik.
      Opmerking: Afhankelijk van de grootte, de interacties en de overvloed van de proteïne van belang, gels met een verschillende helling, bufferen agent of goed formaat en nummer kan worden gebruikt.
    2. Voeg 500 mL 1 x MES SDS buffer verdund in tweemaal gedestilleerd water per tank lopen. Verwijder voorzichtig de kam van de gels na het toevoegen van de lopende buffer zonder verstoring van de putten in de stapelvolgorde gel.
  2. Eiwit laden
    1. Laden 3,5 µL van een eiwit standaard in de put. Afhankelijk van de indeling van de steekproef, kan laden van een eiwit ladder aan beide zijden van de gel helpen in meer eiwit grootte nauwkeurig te schatten. Gebruik schone-tipped gel laden van tips voor meer nauwkeurige steekproef laden.
    2. Bij het gebruik van een interne standaard voor tussen-membraan normalisatie (zie stap 5 hieronder en discussie), het laden van een bedrag dat gelijk is aan de andere monsters in de eerste 3 putten naast de eiwit-ladder.
    3. Belasting 30 µg van elk monster in de overige wells. Breng 1 x monster buffer in alle lege putjes.
  3. Elektroforese
    1. Monteer de gel tank na het laden van de monsters. De monsters worden uitgevoerd door de stapelvolgorde gel bij 80 V gedurende 10 minuten gevolgd door 150 V voor een extra 45-60 min.

3. eiwit overdracht

Opmerking: Eiwit overdracht in dit protocol wordt uitgevoerd met behulp van een commercieel beschikbare semi-droge Bevlekkende systeem (Zie Tabel of Materials) voor snelle en consistente resultaten.

  1. Voorbereiden van de eiwit-overdracht door vooraf filtreerpapier in tweemaal gedestilleerd water onderdompelen en het waarborgen van de gel-mes, kunststof Pasteur Pipetteer Bevlekkende roller en pincet zijn klaar voor gebruik.
  2. Open de transfer-stack door het zorgvuldig verwijderen van alle wrapping folie. De top uit de bodem stapel verwijderen en zet het opzij. Snel bevochtigen het membraan op de stapel van de bodem met enkele druppels elektroforese met buffer (2-3 mL). Zodra de transfer-stack geopend is, is het belangrijk om te voorkomen dat het membraan PVDF uitdrogen.
  3. Na het stoppen van de elektroforese, openen de voorgegoten gel met behulp van de gel-mes en sneed de stapelvolgorde gel. Snijd de gel rond de randen aan het bevrijden van de kunststof cast. Houd het mes van de gel NAT om schade te voorkomen aan de gel.
  4. Monteren van de transfer-stack van bodem tot bovenkant: onderste van de stapel (met het membraan PVDF), eiwit gel, filtreerpapier. Gebruik de Bevlekkende roller te verwijderen alle luchtbellen. Plaats de bovenste stapel op de top van het koffiefilter en rollen van de stapel weer om luchtbellen te verwijderen. Duw niet te sterk als hierdoor kan de gel te vervormen tijdens eiwit overbrengen.
  5. Breng de hele stack in het apparaat van de overdracht met de elektrode aan de linkerkant van het apparaat en plaats van de spons van de gel op de top van de stack, zodat het wordt uitgelijnd met de bijbehorende elektrische contacten op het apparaat. Sluit het deksel, selecteer en start het juiste programma (20 V voor 7 min is een aanbevolen uitgangspunt).
  6. Wanneer u klaar bent, laat het deksel gesloten gedurende 2 minuten om de stack om af te koelen en te voorkomen dat het membraan uitdrogen. Verwijder de transfer-stack en het membraan op de gel maat gesneden. Was de gesneden membraan snel met tweemaal gedestilleerd water voordat u verdergaat met de totale proteïne vlek.

4. totaal eiwit kleuring

Opmerking: Met behulp van fluorescerende detectie biedt een aanzienlijk voordeel over meer traditionele benaderingen (bijvoorbeeld ECL detectie), zoals de lineaire bereik en gevoeligheid kunnen veel beter gecontroleerde4. Dus in stappen 4 en 5, een fluorescerende TPS en fluorescerende secundaire antilichamen worden gebruikt (Zie Tabel van materialen).

  1. Rol het membraan in een 50 mL-buis met de eiwit kant naar binnen. Vanwege de lichtgevoeligheid van de fluorescerende TPS en secundaire antilichamen, worden alle volgende stappen uitgevoerd in het donker.
  2. Voeg 5 mL van eiwit vlek oplossing (Zie Tabel van materialen) en uit te broeden op een roller gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Omdat TPS en was buffer bevatten methanol, deze stappen uit te voeren in een zuurkast.
  3. Negeren van de kleurstofoplossing en was tweemaal snel met de 5 mL wassen oplossing (6,3% azijnzuur in 30% methanol). Plaats de buis kort terug op de roller tussen wassen stappen. Spoel het membraan kort met ultrazuiver water voordat u verdergaat.

5. blokkeren, antilichaam-incubatie en opsporing

  1. Het blokkeren van het membraan: Voeg 3 mL blokkeerbuffer (Zie Tabel van materialen) aan de 50 mL-buis met het membraan. Het membraan op een roller gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur incuberen. Afhankelijk van de keuze van antilichaam, kan het type buffer met blokkerend gebruikt optimalisatie nodig.
  2. Primair antilichaam-incubatie
    1. Gooi de blokkering buffer en vervangen met het primaire antilichaam aan de passende, geoptimaliseerd concentratie (Figuur 1 en Figuur 2: muis-anti-SMN, op 1:1, 000, verdund in blokkeerbuffer).
      Opmerking: Dient voldoende optimalisatie van primaire antilichamen bevestiging dat het antilichaam een eiwit product van de juiste grootte detecteert terwijl tonen geen of minimale binding met andere, aspecifieke eiwitproducten. Indien mogelijk testen en vergelijken meerdere antistoffen tegen het eiwit van belang.
    2. Incubeer het membraan op een roller's nachts bij 4 ° C. De volgende dag, verwijder de antilichaam-oplossing en wassen 6 keer gedurende 5 minuten met 1 x PBS op een roller bij kamertemperatuur (RT).
  3. Incubatie van secundair antilichaam
    1. Bereid de specifieke secundair antilichaam op 1:5,000 tegen de gastheer van het primaire antilichaam in 5 mL blokkeerbuffer. Andere secundaire antilichamen kunnen andere verdunningen of het gebruik van alternatieve blokkerende buffers verlangen.
    2. Incubeer het membraan met de secundair antilichaam-oplossing op een roller voor 1 h op RT. Na incubatie het membraan driemaal 30 min met 1 x PBS te wassen op een roller.
    3. Droog het membraan en houden het membraan beschermd tegen licht met behulp van aluminiumfolie tot opsporing. Membranen kunnen worden bewaard bij 4 ° C voor lange termijn opslag.
  4. Beeldacquisitie
    1. Login aan de computer waarop de scanner is aangesloten. Plaats het membraan op de scanner met de eiwit-zijde naar beneden en selecteer het scangebied in de software.
    2. Optimaliseren van de intensiteit van de laser voor beide (700 nm en 800 nm) kanalen, door te bevestigen zonder verzadiging optreedt. Verwerven van de beelden in beide kanalen en exporteren van de afbeeldingen voor verdere analyse (stap 6).

6. westelijke vlekkenanalyse en kwantificering

Opmerking: Deze aanbevelingen zijn gebaseerd op de vrij beschikbare beeld Studio software. Echter vergelijkbare analyses kunnen ook worden gedaan met behulp van andere softwarepakketten, zoals ImageJ.

  1. Het bestand importeren: een lokale werkruimte maken op de computer die wordt gebruikt voor de analyse. Dit genereert een database van afbeeldingsbestanden voor verworven westelijke vlekken. Verkregen op de scanner-bestanden importeren en selecteert u de afbeelding voor analyse.
  2. TPS analyse
    1. De 700 nm kanaal zodat het totaal eiwit kleuring resultaat weergeven. Een voorbeeld van een afbeelding van de TPS is opgenomen in Figuur 1 in welke verschillende weefsels van neonatale (P5) (figuur 1A-B) en 10 - weken oude muizen (Figuur 1 C-D) direct worden vergeleken. Figuur 2 toont ook een voorbeeld van een directe vergelijking van hersenweefsel van muizen van verschillende leeftijden.
    2. Selecteer tabblad analyse in de rechterbovenhoek en selecteer Voeg rechthoek om het gebied van belang zijn voor de normalisatie (figuur 1B, D) te definiëren. Kopieer en plak de eerste rechthoek gebied op elk afzonderlijke monster om ervoor te zorgen de gedefinieerde regio op dezelfde grootte voor alle geanalyseerde rijstroken.
    3. Kopieer het resultaat van het tabblad van de Shapes in de linker onderhoek van de software.
  3. Kwantificering
    Opmerking: De optimale aanpak voor het kwantificeren van de monsters is afhankelijk van de proefopzet. Hier zullen wij een illustratief voorbeeld van de detectie van de overleving motor neuron proteïne (Smn; een belangrijke eiwitten die betrokken zijn bij de neuromusculaire ziekte spinale musculaire atrofie20,21), die erom bekend te afnemen in de tijd 19 en hoe normalisering van Smn signaal intensiteit aan TPS biedt betrouwbare schattingen van eiwit expressie ontwikkeling.
    1. Figuur 2 toont een daling van Smn expressie met de leeftijd van het dier met TPS als eiwit laden van controle te verhogen. Herhaal stap 6.2.1-6.2.3 om te kwantificeren eiwit laden (figuur 2B). Herhaal stap 6.2.1-6.2.3 in de 800 nm kanaal (figuur 2A) voor het analyseren van de proteïne van belang.
    2. De resultaten van zowel de proteïne van belang als de TPS kopiëren naar een spreadsheetprogramma. Op het werkblad, eerst het normaliseren van het eiwit laden door het bepalen van de hoogste TPS-signaal en verdelen van elke TPS waarde door deze waarde te verkrijgen van de genormaliseerde proteïne laden waarde signaalverwerking.
    3. Verdeel de 800 nm signaal waarde van elke afzonderlijke monster door de bijbehorende waarde van het genormaliseerde eiwit voor de berekening van de relatieve eiwitverhouding met expressie in verschillende monsters.
    4. Na de eerste normalisatie, door verschillende tijdstippen of weefsels op de gemiddelde waarde van de interne standaard waarmee directe vergelijkingen over verschillende membranen en experimenten te vergelijken.

7. statistieken

  1. Om te bepalen een statistisch significante verschillen in eiwit expressie meerdere complexe en grote groepen van monsters, is passende statistische methoden vereist. Hoewel een gedetailleerde bespreking van de statistische achtergrond buiten het bestek van dit document gaat, die we willen markeren van de verschillende overwegingen en een succesvolle aanpak die we eerder hebben gebruikt19in detail te beschrijven.
  2. Wat betreft veel experimenten vertegenwoordigen eiwit kwantificering metingen niet volledig onafhankelijke gegevens. Hier, bijvoorbeeld, zijn meerdere weefsels over het algemeen verkregen van enkele dieren om eiwitniveaus over meerdere organen bij een experimentele tijd-aanspreekpunt. Daarom we een gemengde effecten modellen gebruikt voor het analyseren van de verschillen in eiwit expressie na verloop van tijd, en tussen de weefsels.  In het algemeen, bieden gemengde effecten modellen een effectieve manier om te gaan met niet-onafhankelijkheid en daardoor pseudo-replicatie22,23te vermijden. In het onderhavige geval, heeft gemengde effecten modellen met boekhouding voor herhaalde metingen onder weefsels, binnen individuen statistisch onderscheidingsvermogen toenemen. Gebruiken we het statistisch softwarepakket R voor het uitvoeren van deze analyses, omdat dit vrij beschikbaar en veelzijdig is. Echter, andere commercieel beschikbare pakketten mogelijk soortgelijke analyses uitvoeren.
  3. De huidige proefopzet impliceert een ontwerp "split perceel" omdat elke muis tot slechts één leeftijdsgroep behoorde. Dus we individuele muizen (muis ID) gemodelleerd als een willekeurige effect met een unieke identifier; We tekende ook voor weefsel, leeftijd en hun interactie als vaste effecten. Wij de gegevens met behulp van de functie lmer in de R-bibliotheek, lme4 gemodelleerd. Als een stap in de kwaliteitscontrole, we gevisualiseerd storingswaarden te beoordelen van de veronderstellingen van gelijke variantie en een normale verdeling en getransformeerd de gegevens indien nodig om te voldoen aan deze veronderstellingen. Om te testen voor een belangrijke interactie tussen weefsel en leeftijd, passen we een identiek model dat ontbrak deze interactie, en ten opzichte van de modellen met parametrische bootstrappen (R functie PBmodcomp in de bibliotheek, pbkrtest).  Waar significante interacties ontstaan, we de functie emmeans (in de bibliotheek van de emmeans R) gebruikt om te bepalen van de oorzaak van de interactie.  Bijvoorbeeld, vergeleken we gemiddelde expressie onder leeftijdsklassen binnen elk weefsel; een belangrijke interactie tussen leeftijd en weefsel kan ontstaan als, zeg, twee bepaalde leeftijdsklassen verschilde aanzienlijk voor een weefsel, maar niet een andere. Kortom bieden deze benaderingen een manier om de robuustheid van de conclusies van westelijke vlek experimenten uit te breiden door het bieden van statistische ondersteuning aan deze resultaten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Wij zijn voorbeelden van het gebruik van TPS en een interne standaard om vergelijkingen van eiwitniveaus over weefsels en tijdstippen. Figuur 1 toont de resultaten van het westelijke bevlekken op eiwit geëxtraheerd uit weefsels verkregen neonatale (postnatale dag 5) in vergelijking met volwassen muizen (10 - weken oude). TPS en Smn immunoblot worden weergegeven in figuur 1A, C. Kwantificering van de intensiteit van de fluorescentie van de TPS werd bereikt door het meten van de intensiteit van de fluorescentie in het vak van de rechthoek op elke rijstrook en de resultaten worden weergegeven in de tabellen van figuur 1B en 1 D. Merk op dat de monsters uit verschillende weefsels worden gekenmerkt door TPS eiwit band kruisbare en daarom het nodig is om de hele baan voor normalisatie doeleinden gebruiken. Inderdaad, wanneer hele rijstroken worden geanalyseerd, de intensiteit van de fluorescentie blijft relatief vergelijkbare in verschillende steekproeven, die aangeeft dat TPS voor normalisatie is geschikt voor dit doel. Een interne standaard bestaande uit een P5 hersenen lysate mengsel werd ook opgenomen om te illustreren hoe het gebruikt kan worden voor verdere vergelijkingen tussen verschillende membranen. Bovendien in Figuur 2, laten we zien hoe een TL TPS kan worden gebruikt voor het vergelijken van eiwitniveaus op verschillende ontwikkelings tijd punten. Hier, laten we Smn niveaus in de hersenen lysates van neonatale (P5), spenen leeftijd (P20) en volwassene (10W) muizen (figuur 2A). Hoewel Smn niveaus duidelijk met de leeftijd dalen, blijft TPS kwantificering constant zoals geïllustreerd in figuur 2B.

Figure 1
Figuur 1. Western vlekken weergegeven: TPS en Smn eiwitniveaus in muis weefsels op twee verschillende leeftijden. TPS en Smn-eiwit voor P5 (A) en 10 weken oude (C) muizen. (B, D) De intensiteit van de fluorescentie van geheel-baans TPS werd berekend en wordt aangegeven (in willekeurige eenheden). M: marker/proteïne norm; kDa: kilodalton; a.u.: willekeurige eenheid; P5: postnatale dag 5; 10W: 10 weken. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2. Analyse van Smn expressie in de weefsels van de muis op verschillende ontwikkelings tijdstippen. (A) hersenen lysates uit weefsel verkregen P5, P20 en 10 weken oude muizen werd geanalyseerd met behulp van de TPS (bovenzijde) en SMN (onderkant). (B) de intensiteit van de fluorescentie van de TPS werd berekend en wordt aangegeven in willekeurige eenheden. M: marker/proteïne norm; kDa: kilodalton; a.u.: willekeurige eenheid; P5: postnatale dag 5; P20: postnatale dag 20; 10W: 10 weken. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Weefsel Ca. gewicht * 1xPBS wassen (4 ° C) Herhaal wassen Homogenisator buffer **
Spinal cord 40 mg 150 mL 3 x 100 mL
Spier (GC) 20 mg 150 mL 3 x 100 mL
Hersenen 240 mg 400 mL 4 x 400 mL
Hart 60 mg 400 mL 4 x 200 mL
Lever 130 mg 400 mL 4 x 400 mL
Nier 45 mg 400 mL 4 x 200 mL
* Deze gewichten zijn indicatieve waarden voor weefsel verkregen P8 muizen.
** Deze volumes zijn aanwijzingen en verder kunnen worden aangepast volgens het gewicht van het weefsel.

Tabel 1. Overzicht van de verwachte weefsels gewichten en de bijbehorende aanbevelingen voor PBS wast en lysis buffervolume moet worden gebruikt voor de homogenisering. De gewichten zijn aanwijzingen voor weefsel verkregen van postnatale dag 8 (P8) muizen. PBS en lysis buffer volumes kunnen omhoog en omlaag worden aangepast volgens de experimentele behoeften.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Met de juiste proefopzet, de controlemaatregelen en de statistische analyse, kan westelijke bevlekken worden gebruikt om betrouwbare kwantitatieve ramingen van eiwit expressie binnen en tussen een gevarieerd aanbod van biologische monsters. Het protocol we in het huidige manuscript beschrijven wil dienen als richtsnoer voor onderzoekers op zoek naar het westelijke bevlekken om kwantitatieve analyse over grotere en complexere groepen van monsters, met behulp van een combinatie van fluorescentie gebaseerde gebruiken detectiemethoden, totaal eiwit laden normalisatie en interne standaarden. Hoewel de nadruk hier ligt op bepalen en eiwit expressie uit verschillende muis weefsels en vergelijken op verschillende leeftijden, kan deze aanpak ook worden uitgebreid om te vergelijken eiwituitdrukking in andere experimentele omstandigheden.

Een centrale stap in onze huidige protocol is de normalisatie van proteïnen van belang zijn voor de totale proteïne geladen door een fluorescerende totaal eiwit vlek te kwantificeren. TPS normalisatie corrigeert voor variatie in monster laden en fout marges in eiwit kwantificering methoden. Omdat het aantal EiwitSteekproeven die kunnen worden geanalyseerd op een één membraan vaak beperkt is, verdere normalisatie kan echter worden verlangd dat vergelijken meerdere membranen. Inderdaad, variabiliteit tussen hoe eiwitten worden gedetecteerd op verschillende membranen (als gevolg van bijvoorbeeld antilichaam-incubatie tijd of temperatuur variatie) kan leiden tot variatie dan die stapsgewijs laden en kwantificering van het protocol. Hier, gebruiken wij een interne standaard die bestaat uit een enkele eiwit lysate mix die is geladen in drievoud op elke gel en zorgt voor vergelijking en normalisatie tussen gels/membranen. In theorie zou dit een eiwitsteekproef, zolang het in voldoende hoeveelheden kan worden gemaakt zodat hetzelfde monster kan worden gebruikt voor alle experimenten. In onze experimenten gebruiken we een mengsel van hersenen eiwitten lysates, zoals hersenen homogenates grote hoeveelheden eiwitten bevatten en doorgaans op een hoge concentratie verkregen zijn. Kwantificering van de drievoudige standaard gemiddeld moet verder verhogen van de nauwkeurigheid van ondermeer over membranen en bijdragen tot de reproduceerbaarheid van het experiment.

Eiwitniveaus kunnen worden bepaald door een aantal verschillende technieken en de beste methode is afhankelijk van het type van de steekproef wordt geanalyseerd en het doel van het experiment. Reproduceerbare kwantificering van de Western blot werken beste in situaties waar de experimentele omstandigheden goed gecontroleerde, zoals wanneer met behulp van de muis of andere dierlijke modellen van een bepaalde genetische achtergrond kunnen worden. Daarentegen kan in vele experimenten met menselijke patiënten monsters, dit minder haalbaar als leeftijd, genetische variabiliteit en weefsel bemonsteringstijdstippen zijn veel moeilijker te controleren dan in (diermodel) systemen. Plaat gebaseerde technieken zoals ELISA wellicht meer geschikt zijn voor deze analyses, hoewel de zorgvuldige validatie van antilichamenspecificiteit is van cruciaal belang. Bijvoorbeeld, in fragiele X syndroom onderzoek, antilichamen is aangetoond dat verschillende isoforms detecteren en wanneer gebruikt in ELISA tot een overschatting van de totale hoeveelheid eiwit leiden zou als ELISA een signaal voor alle isoforms bepaalt gecombineerd24. Optimale keuzes voor de methoden ter bepaling van eiwit expressie zijn daarom afhankelijk van de context, type en proeven de onderzoeksvraag die wordt onderzocht.

Het uitvoeren van adequate statistische analyse is een voorwaarde voor de betrouwbaarheid van alle conclusies uit de kwantificering van biologische gegevens. Statistisch analyseren van complexe gegevens zoals worden gegenereerd door het vergelijken van de verschillende weefsels, tijd punten communicatieforfait of via andere experimentele omstandigheden en combinaties daarvan dat meer geavanceerde statistische modellen dan ANOVA met post-hoc testen kan leveren. Voor meer complexe statistische modellen, zoals de gemengd-effects model aanpak, beschrijven we in het huidige manuscript, het wellicht raadzaam om te proberen verdere adviseren van stelt. Adequate statistische analyse van grootschalige eiwit expressie kunt u aanzienlijk verbeteren de robuustheid van de uitkomsten en de betrouwbaarheid en reproduceerbaarheid van de resultaten.

Kortom biedt de experimentele aanpak die we hier beschrijven een robuuste en reproduceerbare methode voor onderzoekers die wilt bepalen eiwit expressie gebruiken van westelijke vlek in complexe monsters zodat nieuwe en spannende onderzoeksvragen te beantwoorden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben geen concurrerende belangen openbaar te maken.

Acknowledgments

E.J.N.G. wordt ondersteund door de Wellcome Trust (grant 106098/Z/14/Z). Andere financiering is verstrekt door de SMA Trust (SMA UK Consortium; T.H.G. & Y-T. H.), SMA Europa (T.H.G, D.v.D.H. & E.J.N.G.), de Universiteit van Edinburgh DTP in precisie geneeskunde (T.H.G., L.L. & A.M.M.) en het Euan MacDonald-centrum voor Motor Neurone Disease Research (T.H.G).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fine Tipped Gel Loading Tips Alpha Laboratories GL20057SNTL
Halt Protease Inhibitor Cocktail, EDTA-free 100x 5mL ThermoFisher Scientific 78437
Handheld homogeniser  VWR Collection 431-0100
iBlot 2 Gel Transfer Device ThermoFisher Scientific IB21001
iBlot Transfer Stack, PVDF, regular size ThermoFisher Scientific IB401031
Image Studio Lite Licor N/A Free download from https://www.licor.com/bio/products/software/image_studio_lite/
IRDye 800CW secondary antibodies Licor -- Select appropriate secondary antibody that is specific against host of primary antibody.
Micro BCA Protein Assay Kit ThermoFisher Scientific 23235
Novex Sharp Pre-stained Protein Standard ThermoFisher Scientific LC5800
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15-well ThermoFisher Scientific NP0323BOX
NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) ThermoFisher Scientific NP0007
NuPAGE MOPS SDS Running Buffer (20X) ThermoFisher Scientific NP0001
Odyssey Blocking Buffer Licor 927-40000
Purified Mouse anti-SMN (survival motor neuron) monoclonal antibody BD Transduction Laboratories 610646 Is used extensively in the SMN/SMA literature and gives consistent results regardsless of lot number
REVERT Total Protein Stain, 250 mL  Licor 926-11021 
REVERT Wash Solution  Licor 926-11012 
RIPA Lysis and Extraction Buffer ThermoFisher Scientific 89900
XCell SureLock Mini-Cell ThermoFisher Scientific EI0001

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bertoni, T. A., Perenha-Viana, M. C., Patussi, E. V., Cardoso, R. F., Svidzinski, T. I. Western blotting is an efficient tool for differential diagnosis of paracoccidioidomycosis and pulmonary tuberculosis. Clinical and Vaccine Immunology. 19, (11), 1887-1888 (2012).
  2. Hutchinson, A. B., et al. Costs and outcomes of laboratory diagnostic algorithms for the detection of HIV. Journal of Clinical Virology. 58 Suppl 1, e2-7 (2013).
  3. Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76, (9), 4350-4354 (1979).
  4. Eaton, S. L., et al. Total protein analysis as a reliable loading control for quantitative fluorescent Western blotting. PloS One. 8, (8), e72457 (2013).
  5. Ghosh, R., Gilda, J. E., Gomes, A. V. The necessity of and strategies for improving confidence in the accuracy of western blots. Expert Rev Proteomics. 11, (5), 549-560 (2014).
  6. Jensen, B. C., Swigart, P. M., Simpson, P. C. Ten commercial antibodies for alpha-1-adrenergic receptor subtypes are nonspecific. Naunyn-Schmiedebergs Archives of Pharmacology. 379, (4), 409-412 (2009).
  7. Jositsch, G., et al. Suitability of muscarinic acetylcholine receptor antibodies for immunohistochemistry evaluated on tissue sections of receptor gene-deficient mice. Naunyn-Schmiedebergs Archives of Pharmacology. 379, (4), 389-395 (2009).
  8. Smejkal, G., Gallagher, S. Determination of semidry protein transfer efficiency with transverse gradient gel electrophoresis. Biotechniques. 16, (2), 196-198, 200-192 (1994).
  9. Eaton, S. L., et al. A guide to modern quantitative fluorescent western blotting with troubleshooting strategies. Journal of Visualized Experiments. (93), e52099 (2014).
  10. Hunter, G., Roche, S. L., Somers, E., Fuller, H. R., Gillingwater, T. H. The influence of storage parameters on measurement of survival motor neuron (SMN) protein levels: implications for pre-clinical studies and clinical trials for spinal muscular atrophy. Neuromuscular Disorders. 24, (11), 973-977 (2014).
  11. Fosang, A. J., Colbran, R. J. Transparency Is the Key to Quality. Journal of Biological Chemistry. 290, (50), 29692-29694 (2015).
  12. Taylor, S. C., Berkelman, T., Yadav, G., Hammond, M. A defined methodology for reliable quantification of Western blot data. Molecular Biotechnology. 55, (3), 217-226 (2013).
  13. Goasdoue, K., Awabdy, D., Bjorkman, S. T., Miller, S. Standard loading controls are not reliable for Western blot quantification across brain development or in pathological conditions. Electrophoresis. 37, (4), 630-634 (2016).
  14. Rocha-Martins, M., Njaine, B., Silveira, M. S. Avoiding pitfalls of internal controls: validation of reference genes for analysis by qRT-PCR and Western blot throughout rat retinal development. PloS One. 7, (8), e43028 (2012).
  15. Aghamaleky Sarvestany, A., et al. Label-free quantitative proteomic profiling identifies disruption of ubiquitin homeostasis as a key driver of Schwann cell defects in spinal muscular atrophy. Journal of Proteome Research. 13, (11), 4546-4557 (2014).
  16. Fuller, H. R., et al. Spinal Muscular Atrophy Patient iPSC-Derived Motor Neurons Have Reduced Expression of Proteins Important in Neuronal Development. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 506 (2015).
  17. Liu, N. K., Xu, X. M. beta-tubulin is a more suitable internal control than beta-actin in western blot analysis of spinal cord tissues after traumatic injury. Journal of Neurotrauma. 23, (12), 1794-1801 (2006).
  18. Moritz, C. P. Tubulin or Not Tubulin: Heading Toward Total Protein Staining as Loading Control in Western Blots. Proteomics. 17, (20), (2017).
  19. Groen, E. J. N., et al. Temporal and tissue-specific variability of SMN protein levels in mouse models of spinal muscular atrophy. Human Molecular Genetics. 27, (16), 2851-2862 (2018).
  20. Chaytow, H., Huang, Y. T., Gillingwater, T. H., Faller, K. M. E. The role of survival motor neuron protein (SMN) in protein homeostasis. Cellular and Molecular Life Sciences. (2018).
  21. Groen, E. J. N., Talbot, K., Gillingwater, T. H. Advances in therapy for spinal muscular atrophy: promises and challenges. Nature Reviews: Neurology. 14, (4), 214-224 (2018).
  22. Fitzmaurice, G. M., Laird, N. M., Ware, J. H. Applied longitudinal analysis. Wiley-Interscience. (2004).
  23. Jordan, C. Y. Population sampling affects pseudoreplication. PLoS Biology. 16, (10), e2007054 (2018).
  24. LaFauci, G., Adayev, T., Kascsak, R., Brown, W. T. Detection and Quantification of the Fragile X Mental Retardation Protein 1 (FMRP). Genes (Basel). 7, (12), (2016).
Robuuste vergelijking van eiwitniveaus over weefsels en in de gehele ontwikkeling met behulp van gestandaardiseerde kwantitatieve westelijke bevlekken
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Huang, Y. T., van der Hoorn, D., Ledahawsky, L. M., Motyl, A. A. L., Jordan, C. Y., Gillingwater, T. H., Groen, E. J. N. Robust Comparison of Protein Levels Across Tissues and Throughout Development Using Standardized Quantitative Western Blotting. J. Vis. Exp. (146), e59438, doi:10.3791/59438 (2019).More

Huang, Y. T., van der Hoorn, D., Ledahawsky, L. M., Motyl, A. A. L., Jordan, C. Y., Gillingwater, T. H., Groen, E. J. N. Robust Comparison of Protein Levels Across Tissues and Throughout Development Using Standardized Quantitative Western Blotting. J. Vis. Exp. (146), e59438, doi:10.3791/59438 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter